李維理

摘要：對(duì)L-色氨酸生產(chǎn)基因工程菌TP01發(fā)酵的接種量、發(fā)酵溫度和溶氧等條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該菌株的最佳發(fā)酵條件初始培養(yǎng)基組成為葡萄糖30 g/L、硫酸銨40 g/L、酪氨酸0.2 g/L、玉米漿25 mL/L、磷酸氫二鉀10 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、七水硫酸鎂2 g/L、硫酸鈉0.002 g/L、七水硫酸亞鐵0.01 g/L、維生素B1 100 μg/L、維生素H 50 μg/L，流加糖為濃度70%的葡萄糖（質(zhì)量體積比），pH為7.0，溫度為37 ℃，接種量為10%，溶氧控制在20%～30%。

關(guān)鍵詞：L-色氨酸；基因工程菌；發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ922 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1463（2017）07-0057-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.07.014

Abstract：The genetically engineered bacterium TP01 was one L-tryptophan fermentation producing strain. The culture conditions such as inoculum size， temperature and dissolved oxygen were studied to confirm the optimal fermentation conditions. The results showed that the optimal fermentation medium was glucose 30 g/L， （NH4）2SO4 40 g/L， tyrosine 0.2 g/L， corn steep liquor 25 mL/L， K2HPO4 10 g/L， KH2PO4 5 g/L， MgSO4·7H2O 2 g/L， Na2SO4 0.002 g/L， FeSO4·7H2O 0.01 g/L， vitamin B1 100 μg/L， vitamin H 50 μg/L. The optimum fermentation conditions of L-tryptophan were 70% （m/v） amount of glucose， pH 7.0， fermentation temperature 37 ℃， inoculum size 10% and dissolved oxygen 20%～30%.

Key words：L-tryptophan； Genetically engineered bacterium； Fermentation optimization

L-色氨酸是人體和動(dòng)物生命活動(dòng)所需的8種必需氨基酸之一，以游離態(tài)或結(jié)合態(tài)存在于生物體中[1 - 3 ]，對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝起著非常重要的作用，被稱為第二必需氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)[4 - 5 ]。Eiteman等根據(jù)代謝控制發(fā)酵原理對(duì)L-色氨酸發(fā)酵進(jìn)行了研究[6 - 8 ]。筆者對(duì)L-色氨酸生產(chǎn)菌株TP01的發(fā)酵條件（發(fā)酵接種量、發(fā)酵溫度及溶氧控制等）進(jìn)行了試驗(yàn)，以期明確TP01菌株的最佳發(fā)酵條件，為相關(guān)科學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 供試菌株為基因工程菌TP01。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌種培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、硫酸銨5 g/L、蛋白胨4 g/L、酵母粉2 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L，混勻后于0.1 MPa滅菌20 min，pH 6.8～7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、硫酸銨 40 g/L、酪氨酸 0.2 g/L、玉米漿25 mL/L、磷酸氫二鉀 10 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、七水硫酸鎂2 g/L、硫酸鈉0.002 g/L、七水硫酸亞鐵0.01 g/L、維生素B1 100 μg/L、維生素H 50 μg/L，流加糖為濃度70%的葡萄糖（質(zhì)量體積比）。

1.2 菌種培養(yǎng)

從生長(zhǎng)良好的基因工程菌TP01活化培養(yǎng)基斜面刮滿環(huán)菌苔，轉(zhuǎn)入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的無擋板三角瓶（容量500 mL）中，用8層紗布封口，置于巡回式搖床上振蕩培養(yǎng)。

1.3 5 L罐發(fā)酵

將菌種液通過火圈直接接種至5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐中，裝液量3 L，溫度自控，自動(dòng)流加氨水控制pH，起始通風(fēng)量為80 L/h，流加“泡敵”消泡，通過流加葡萄糖、控制不同的攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量來實(shí)現(xiàn)不同的溶氧。溶氧為相對(duì)溶氧水平，即將培養(yǎng)基未接種時(shí)的飽和溶氧設(shè)定為100%，發(fā)酵過程顯示的溶氧水平為相對(duì)于飽和溶氧的分?jǐn)?shù)。

1.3.1 菌種接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響 菌種發(fā)酵中，如菌株接種量太少，菌體增長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，使發(fā)酵周期延長(zhǎng)，同時(shí)會(huì)降低菌種活力，不利于得到較高的產(chǎn)酸水平；菌株接種量過大，雖然縮短了長(zhǎng)菌的時(shí)間，但會(huì)因菌數(shù)增長(zhǎng)過快和隨接種而移入過多的代謝廢物，菌種容易衰老，不利于得到較高的產(chǎn)酸水平；適宜的接種量既能保證合理縮短發(fā)酵周期，又能得到較高的發(fā)酵產(chǎn)酸水平。為了確定菌株TP01色氨酸發(fā)酵最佳種子接種量，進(jìn)行了不同接種量的發(fā)酵試驗(yàn)。根據(jù)發(fā)酵試驗(yàn)的常用接種濃度分別試驗(yàn)了5%接種量、7%接種量、10%接種量、12%接種量、15%接種量5個(gè)不同的接種濃度，根據(jù)種子的生長(zhǎng)條件，發(fā)酵在pH 7.0、37 ℃、溶氧30%±5%（按常規(guī)溶氧控制條件）條件下進(jìn)行，重復(fù)3批試驗(yàn)，以48 h產(chǎn)酸求平均值計(jì)算各接種濃度的產(chǎn)酸量，確定最佳的接種濃度。

1.3.2 菌液pH對(duì)發(fā)酵效果的影響 菌種發(fā)酵過程中較高或較低pH均會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，使菌體生長(zhǎng)緩慢，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，降低色氨酸產(chǎn)量。根據(jù)色氨酸發(fā)酵菌株TP01的生長(zhǎng)pH，進(jìn)行了不同pH發(fā)酵試驗(yàn)。由于菌株TP01的生長(zhǎng)pH為7.0，因此選擇pH 6.6、6.8、7.0、7.2、7.5等5個(gè)不同pH進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)種子的生長(zhǎng)條件，發(fā)酵在37 ℃、接種量10%、溶氧30%±5%（按常規(guī)溶氧控制條件）條件下進(jìn)行，重復(fù)3批試驗(yàn)，以48 h產(chǎn)酸求平均值計(jì)算各pH的產(chǎn)酸量，確定最佳的發(fā)酵pH。

1.3.3 溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響 溫度對(duì)發(fā)酵的影響主要表現(xiàn)在發(fā)酵前期影響菌體的生長(zhǎng)和在發(fā)酵中后期影響菌體產(chǎn)酸。溫度適宜，菌體生長(zhǎng)好，菌體量大，L-色氨酸產(chǎn)量高，糖酸轉(zhuǎn)化率也高。溫度偏低，菌體生長(zhǎng)較慢，對(duì)原料的轉(zhuǎn)化效率低。溫度偏高，菌體易衰老，不利于L-色氨酸的積累。根據(jù)色氨酸發(fā)酵菌株TP01的生長(zhǎng)溫度，進(jìn)行了不同溫度發(fā)酵試驗(yàn)。由于菌株TP01的生長(zhǎng)溫度為37 ℃，因此選擇33、35、36、37、39 ℃等5個(gè)不同的溫度進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，根據(jù)種子的生長(zhǎng)條件，發(fā)酵在pH 7.0、接種量10%、溶氧30%±5%（按常規(guī)溶氧控制條件）條件下進(jìn)行，重復(fù)3批試驗(yàn)，以48 h產(chǎn)酸求平均值計(jì)算各溫度下的產(chǎn)酸量，確定最佳的發(fā)酵溫度。

1.3.4 不同溶氧水平對(duì)發(fā)酵效果的影響 發(fā)酵過程中，通過流加70%葡萄糖（質(zhì)量體積比）、控制不同的攪拌轉(zhuǎn)速及通風(fēng)量來實(shí)現(xiàn)不同的溶氧。將溶氧分別控制在10%～20%、20%～30%和30%～40% 3個(gè)水平進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵在pH 7.0、37 ℃、接種量10%條件下進(jìn)行，重復(fù)3批試驗(yàn)，以48 h為發(fā)酵終點(diǎn)，每4 h采集1次數(shù)據(jù)，采用發(fā)酵液吸光度和產(chǎn)酸量來評(píng)價(jià)不同的溶氧控制條件的優(yōu)劣，確定最佳的發(fā)酵溶氧濃度控制。

1.4 分析方法

使用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的吸光度，確定菌體濃度；使用pH計(jì)測(cè)定pH；采用SBA-40C型生物傳感分析儀測(cè)定殘?zhí)?；采用液相色譜測(cè)定L-色氨酸含量[9 ]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

由圖1可以看出，當(dāng)菌株TP01接種量為10%時(shí)，L-色氨酸濃度最大，達(dá)到25.8 g/L，即菌株TP01的產(chǎn)酸量達(dá)到最大，因此菌株TP01發(fā)酵的最佳接種量為10%。

2.2 菌液pH對(duì)發(fā)酵效果的影響

由圖2可以看出，當(dāng)發(fā)酵pH為7.0時(shí)，菌株發(fā)酵效果最好，L-色氨酸濃度最高，達(dá)到26.3 g/L，即菌株TP01的產(chǎn)酸量達(dá)到最大。因此，確定菌株TP01發(fā)酵的最佳pH為7.0。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

由圖3可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，發(fā)酵液中L-色氨酸含量最高，達(dá)到25.6 g/L，即菌株TP01的產(chǎn)酸量達(dá)到最大，表明菌株TP01發(fā)酵的最適溫度為37 ℃。

2.4 溶氧濃度對(duì)發(fā)酵效果的影響

在不同的溶氧水平下，菌體的生長(zhǎng)量都能達(dá)到一個(gè)相近的飽和值，但菌體的生長(zhǎng)速率存在差異。由圖4和圖5可以看出，當(dāng)溶氧控制在20%～30%水平時(shí)，菌體生長(zhǎng)最快，發(fā)酵產(chǎn)酸量也高，發(fā)酵液中L-色氨酸含量也相應(yīng)最高；當(dāng)溶氧控制在30%～40%水平時(shí)，菌體生長(zhǎng)速度有所降低，產(chǎn)酸量也較低；當(dāng)溶氧濃度控制在10%～20%水平時(shí)，菌體生長(zhǎng)較為緩慢，產(chǎn)酸量最低，L-色氨酸含量也相應(yīng)最低?？梢娙苎鯘舛绕突蚱邔?duì)于發(fā)酵產(chǎn)酸都是不利的，特別是溶氧濃度偏低時(shí)不但對(duì)菌體的生長(zhǎng)不利，也不利于發(fā)酵產(chǎn)酸。因此，菌株TP01發(fā)酵過程中溶氧濃度應(yīng)控制在20%～30%。

3 小結(jié)

研究表明，菌株TP01最佳發(fā)酵條件的培養(yǎng)基組成為葡萄糖30 g/L、硫酸銨 40 g/L、酪氨酸 0.2 g/L、玉米漿25 mL/L、磷酸氫二鉀 10 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、七水硫酸鎂2 g/L、硫酸鈉0.002 g/L、七水硫酸亞鐵0.01 g/L、維生素B1 100 μg/L、維生素H 50 μg/L，流加糖為濃度70%葡萄糖（質(zhì)量體積比）；發(fā)酵pH為7.0，發(fā)酵溫度37 ℃，接種量為10%，溶氧控制在20%～30%。

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（本文責(zé)編：鄭丹丹）