郭大志　馮園　沈晨

[摘要] 目的 探討急性一氧化碳中毒（ACOP）對(duì)大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（OPCs）遷移的影響。 方法 采用差速貼壁法體外純化培養(yǎng)大鼠OPCs，免疫熒光法鑒定OPCs純度和形態(tài)，將其分為兩組，ACOP組：將細(xì)胞放在密閉容器內(nèi)，根據(jù)體積比例注入1%一氧化碳，建立ACOP的OPCs細(xì)胞模型，處理6、24 h和48 h；對(duì)照組：不進(jìn)行任何處理，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)6、24 h和48 h。兩組均在6、24 h和48 h利用Transwell方法觀察OPCs遷移情況。 結(jié)果 免疫熒光顯示純化培養(yǎng)的OPCs 95%以上表達(dá)NG2和PDGF-α，不表達(dá)GFAP和C-D11b；對(duì)照組遷移到小室穿透膜上的OPCs細(xì)胞數(shù)量自6 h到48 h逐漸增多，而ACOP組遷移的OPCs細(xì)胞數(shù)量逐漸減少；與對(duì)照組比較，ACOP組遷移到小室穿透膜上的OPCs細(xì)胞數(shù)量在6 h開(kāi)始下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），在24 h及48 h時(shí)遷移到小室穿透膜上的OPCs細(xì)胞數(shù)量明顯下降（P < 0.05）；其中，在ACOP后48 h遷移的OPCs細(xì)胞數(shù)量下降最顯著（P < 0.01）。 結(jié)論 ACOP會(huì)抑制OPCs細(xì)胞遷移能力，且隨著中毒時(shí)間的增加而加重，從而阻礙損傷CNS髓鞘的修復(fù)，進(jìn)一步闡明該機(jī)制可能對(duì)認(rèn)識(shí)一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病及尋找更有效的治療手段具有非常重要的意義。

[關(guān)鍵詞] 一氧化碳中毒；少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞；遷移

[中圖分類(lèi)號(hào)] R595.105 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）12（c）-0049-04

[Abstract] Objective To explore the effect of acute carbon monoxide poisoning （ACOP） for the migration of oligodendrocyte precursors （OPCs） in rats. Methods The OPCs model of rats was purified cultured by differential attachment in vitro， the purity and morphology of OPCs was identified by immumofluorescence method， they were divided into two groups， ACOP group： the cells were placed in a sealed container， which was injected 1% carbon monoxide by the volume ratio to establish OPCs cell model of ACOP， for 6， 24 h and 48 h； control group： the cells were cultured without any treatment， they were cultured for 6， 24 h and 48 h under the conditions of 5%CO2， 37℃； the OPCs migration of the two groups was observed by Transwell method at 6， 24 h and 48 h. Results The results of immunofluorescence showed that， more than 95% percent of purified cultured OPCs expressed NG2 and PDGF-α and did not express GFAP and CD11b； the number of OPCs migrated to the transmemberane of transwell in the control group was gradually increased from 6 h to 48 h， while the number of OPCs in ACOP group was gradually decreased； compared with control group， the number of OPCs migrated to the transmemberane of transwell in ACOP group began to decrease at 6 h， while there was no statistically significant difference （P > 0.05）， the number of OPCs migrated to the transmemberane of transwell in ACOP group was decreased significantly at 24， 48 h （P < 0.05）； among which， the migrated number of OPCs was decreased most significantly after 48 h of ACOP （P < 0.01）. Conclusion ACOP can inhibit the migration of OPCs， which will be more serious with the extension of poisoning time， thus hindering the repair of damaged CNS myelin. To further clarify the mechanism has very important significance to understand delayed encephalopathy after carbon monoxide poisoning and look for more effective therapy.

[Key words] Carbon monoxide poisoning； Oligodendrocyte precursors； Migration

一氧化碳（carbon monoxide）是一種無(wú)色無(wú)味的窒息性氣體，人體一旦吸入過(guò)量，就會(huì)造成急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning，ACOP），立即造成多系統(tǒng)損害，其中以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷最為嚴(yán)重，極易發(fā)生一氧化碳中毒遲發(fā)性腦?。╠elayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）。脫髓鞘改變被認(rèn)為是DEACMP最主要的病理改變之一，但目前機(jī)制尚不完全清楚。少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursors，OPCs）是腦內(nèi)廣泛存在的一大類(lèi)膠質(zhì)細(xì)胞，最初主要從室管膜區(qū)產(chǎn)生并經(jīng)過(guò)發(fā)育期的長(zhǎng)距離遷移而到達(dá)大腦的各個(gè)區(qū)域。OPCs的遷移過(guò)程是神經(jīng)元正常形成髓鞘的必要條件，還對(duì)大腦損傷后髓鞘的修復(fù)至關(guān)重要。本研究采用差速貼壁法體外純化培養(yǎng)大鼠OPCs，建立ACOP的OPCs細(xì)胞模型，觀察ACOP對(duì)OPCs的遷移情況影響，探討ACOP后CNS損傷及DEACMP的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)用SD大鼠孕鼠（E16-E18）購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SGXK（京）20022003。胎牛血清、胰蛋白酶、B27、Eagle's MEM購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；PDL、DAPI試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Rat FGF、Human PDGF-AA購(gòu)自Peorotech公司。鼠抗NG2、兔抗PDGF-α、鼠抗GFAP和鼠抗CD11b購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；cy-3、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)于中杉金橋公司。

1.2 體外OPCs純化培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)采用孕16 d的SD大鼠，乙醚麻醉解剖鏡下取胎鼠皮層，機(jī)械分離吹打成細(xì)胞懸液并用20 μm直徑的尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾重懸，以3×107個(gè)/培養(yǎng)皿的密度種入PDL預(yù)先包被的100 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，以含有10% FBS的Eagle's MEM 培養(yǎng)液在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d。5 d后，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞用0.05%的胰蛋白酶消化并吹打成細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min（離心半徑為4 cm）后重懸并用20 μm直徑的尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，以8×106個(gè)/培養(yǎng)皿的密度種入無(wú)PDL包被的60 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，以含有10% FBS的Eagle's MEM培養(yǎng)液在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 d。6 d后，將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞再次用0.025%的胰蛋白酶消化，并將神經(jīng)球周?chē)龅暮芏嗑哂袃蓸O或多極突起的OPC細(xì)胞輕輕吹打成細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min（離心半徑為4 cm）后重懸并用20 μm直徑的尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，以1×106個(gè)/mL的密度種入無(wú)PDL包被的玻片上，含10% FBS的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1 d后以備實(shí)驗(yàn)。

1.3 ACOP的OPCs細(xì)胞模型

將體外培養(yǎng)的OPCs細(xì)胞分為對(duì)照組和ACOP組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。ACOP組：將細(xì)胞放在密閉容器內(nèi)，根據(jù)體積比例注入1%一氧化碳（用一氧化碳檢測(cè)儀檢測(cè)，容器內(nèi)一氧化碳濃度為10 000 ppm），處理6、24 h和48 h后進(jìn)行免疫熒光和遷移檢測(cè)。對(duì)照組：不進(jìn)行任何處理，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。

1.4 免疫熒光染色

在干預(yù)各時(shí)間點(diǎn)吸除細(xì)胞玻片上的原培養(yǎng)基，用0.1×PBS漂洗3次，用預(yù)冷的多聚甲醛（4%）固定10 min，0.1×PBS漂洗3次，用含0.2% triton-X100的PBS室溫破膜10 min，PBS漂洗3次，0.1% BSA室溫封閉1 h，加入一抗，4°C過(guò)夜，次日PBS清洗，加入對(duì)應(yīng)二抗避光條件下室溫孵育1 h，0.1×PBS漂洗3次，用50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移情況

用Transwell 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板鋪板，對(duì)照組和ACOP組細(xì)胞分別在培養(yǎng)箱培養(yǎng)6、24、48 h，在下層小室中加入趨化劑（chemotaxis）。分別在不同時(shí)間點(diǎn)將小室用1×PBS洗2次，用刀片把小室穿透膜取下來(lái)放在載玻片上（把有透過(guò)細(xì)胞的那面朝上放，便于染色），把貼有小室穿透膜的載玻片用4%的多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次，5 min/次，用0.1% Trition×-100透化細(xì)胞15 min，1×PBS洗3次，5 min/次，加100 μL蘇木精染色20 min，自來(lái)水洗2 min，再用新的自來(lái)水浸泡10 min反藍(lán)，用中性樹(shù)膠封片，鏡檢。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OPCs細(xì)胞鑒定

采用免疫細(xì)胞熒光方法，分別用原代培養(yǎng)NG2和PDGF-α標(biāo)記OPCs細(xì)胞，GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，CD11b標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果顯示：OPCs細(xì)胞突起為雙極，少數(shù)為3極或多極，不表達(dá)GFAP和CD11b，OPCs純度達(dá)95%以上（圖1）。

2.2 Transwell檢測(cè)OPCs的遷移

對(duì)照組遷移到小室穿透膜上的OPCs細(xì)胞數(shù)量自6 h到48 h逐漸增多，而ACOP組遷移的OPCs細(xì)胞數(shù)量逐漸減少（圖2）。與對(duì)照組比較，ACOP組遷移到小室穿透膜上的OPCs細(xì)胞數(shù)量在6 h開(kāi)始下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），在ACOP后24 h時(shí)遷移到小室穿透膜上的OPCs細(xì)胞數(shù)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；其中，在ACOP后48 h時(shí)遷移的OPCs細(xì)胞數(shù)量下降最顯著（P < 0.01）（圖3）。

3 討論

短時(shí)間過(guò)量吸入或長(zhǎng)時(shí)間高濃度暴露一氧化碳均可引發(fā)一氧化碳中毒，導(dǎo)致機(jī)體多系統(tǒng)損害，尤以腦組織損害危害最大[1]。ACOP經(jīng)急救治療后，往往存在數(shù)天至數(shù)周（2～60 d）的表現(xiàn)正?；蚧菊５摹凹儆凇?，再次出現(xiàn)精神意識(shí)、大腦皮層局部、錐體及錐體外系功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)精神癥狀，即DEACMP，發(fā)生率占重癥ACOP的50%以上[2]。顱腦MRI+DTI研究表明，半卵圓中心是ACOP后CNS損害和DEACMP的最主要受累區(qū)域[3]。病理研究也顯示，CNS脫髓鞘病變被認(rèn)為是最常見(jiàn)的病理學(xué)表現(xiàn)之一，但其機(jī)制仍不清楚[4]。Kuroda等[5]研究發(fā)現(xiàn)，ACOP患者白質(zhì)損傷，DEACMP患者的蛋白質(zhì)代謝物出現(xiàn)異常，其中，膽堿化合物/肌酸比值升高、N-乙酰天門(mén)冬氨酸/肌酸比值降低，乳酸髓鞘相關(guān)蛋白升高，他們還發(fā)現(xiàn)乳酸峰值的出現(xiàn)提示預(yù)后不良。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)ACOP大鼠腦內(nèi)髓鞘抑制蛋白Nogo、MAG、NgR1表達(dá)增高，提示一氧化碳中毒可導(dǎo)致CNS脫髓鞘。近年來(lái)，有關(guān)DEACMP髓鞘損傷機(jī)制的研究還包括缺血缺氧、微血栓、自身免疫反應(yīng)、再灌注損傷、自由基、鈣超載、一氧化氮介導(dǎo)的損傷、細(xì)胞凋亡和興奮性氨基酸毒性等方面[7-15]，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為DEACMP的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，但上述機(jī)制仍不能對(duì)其發(fā)生、發(fā)展給出滿意的解釋。

CNS髓鞘由少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs）的突起纏繞神經(jīng)元軸突形成。在CNS，OLs細(xì)胞由OPCs分化而來(lái)。值得注意，在成年CNS中OPCs占全部神經(jīng)細(xì)胞的5%～10%，并保持一定增殖、分化能力，能夠分化為OLs、Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，是成年CNS的髓鞘形成的主要來(lái)源[16]。OPCs在成熟腦內(nèi)廣泛分布，除具有增殖和分化潛能外，還具備一些特殊的電生理特性，Ge等[17]發(fā)現(xiàn)它們可以直接接受神經(jīng)元的突觸支配，且具有可塑性。大部分學(xué)者認(rèn)為，OPCs最先發(fā)生于胚胎腹側(cè)端腦區(qū)以及發(fā)育后期的室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ），并由此不斷遷移到灰質(zhì)和白質(zhì)區(qū)分化為成熟的OLs細(xì)胞[18]。生理?xiàng)l件下，成年大腦白質(zhì)區(qū)的OPCs增殖和分化處于一種“相對(duì)平衡”狀態(tài)；而在病理?yè)p傷下，如多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)退行性疾病、腦卒中等疾病中，OPCs會(huì)被激活并不斷在SVZ區(qū)增殖并“精準(zhǔn)”遷移到受損腦區(qū)，分化成為OLs，發(fā)揮髓鞘損傷修復(fù)等多種功能[19]。在一氧化碳中毒細(xì)胞模型研究中也發(fā)現(xiàn)，OLs在ACOP發(fā)生后即出現(xiàn)凋亡、數(shù)量減少[20]。孫瑞佼等[21]研究發(fā)現(xiàn)ACOP后大鼠發(fā)生CNS脫髓鞘及OPCs損傷。

近年來(lái)，王曉虹等[22]建立了一氧化碳中毒OLs細(xì)胞模型，但關(guān)于一氧化碳中毒的OPCs細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)較少。本研究通過(guò)建立體外純化培養(yǎng)OPCs的一氧化碳中毒模型，利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACOP對(duì)OPCs遷移的影響。結(jié)果顯示，ACOP后OPCs細(xì)胞遷移能力在ACOP后6 h開(kāi)始下降，在24 h及48 h時(shí)細(xì)胞遷移明顯降低（P < 0.05）；其中，在ACOP后48 h細(xì)胞遷移能力下降最顯著，提示一氧化碳中毒時(shí)間越長(zhǎng)，OPCs細(xì)胞遷移能力越弱，損傷CNS髓鞘的修復(fù)越差，發(fā)生DEACMP的可能性越大。

綜上所述，一氧化碳中毒導(dǎo)致OPCs細(xì)胞遷移能力下降可能在ACOP后CNS損傷和DEACMP的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步闡明該機(jī)制可能對(duì)認(rèn)識(shí)DEACMP及尋找更有效的治療手段具有非常重要的意義。

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（收稿日期：2016-07-15 本文編輯：張瑜杰）