符鋒　陳以勝　李曉紅

[摘要] 目的 模擬腦組織彈性模量制備相應(yīng)二維培養(yǎng)基，比較亞低溫聯(lián)合溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（tsUC）與常溫下臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC）的分化特性。 方法 應(yīng)用單、雙丙烯酰胺的聚合作用，制備彈性模量為0.5 kPa的聚丙烯酰胺（PA）水凝膠，用于模擬腦組織的生物力學(xué)環(huán)境，并測(cè)其彈性模量。從新生兒臍帶中分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，通過感染攜溫度敏感型猿猴病毒40大T抗原（ts-SV40LT）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒來制備tsUC。實(shí)驗(yàn)分為3組：UC+常溫+玻片組（A組）、UC+常溫+0.5 kPa組（B組）、tsUC+亞低溫+0.5 kPa組（C組）。動(dòng)態(tài)觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化，并于7 d后行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞的分化水平并計(jì)算分化神經(jīng)元的軸突長(zhǎng)度。 結(jié)果 PA水凝膠彈性模量的檢測(cè)結(jié)果為（0.50±0.03）kPa。B、C兩組部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)的胞突，并存在β-tubulin Ⅲ陽(yáng)性細(xì)胞，A組細(xì)胞鏡下無明顯神經(jīng)元形態(tài)，也無β-tubulin Ⅲ陽(yáng)性表達(dá)。B、C兩組的神經(jīng)元分化率以及熒光下軸突長(zhǎng)度均明顯高于A組，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 在模擬腦組織彈性模量的環(huán)境中，tsUC具有向神經(jīng)元分化的能力，可應(yīng)用于亞低溫治療下腦損傷修復(fù)的細(xì)胞移植研究。

[關(guān)鍵詞] 溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；聚丙烯酰胺水凝膠；彈性模量；生物力學(xué)

[中圖分類號(hào)] R651.15 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）12（c）-0014-04

[Abstract] Objective To manufacture two-dimensional culture medium of brain tissue elastic modulus， and to compare the differentiate property of temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells （tsUC） under mild hypothermia treatment （MHT） and umbilical cord mesenchymal stem cells （UC） under normal temperature （NT）. Methods Acrylamide and bis-acrylamide were applied to synthesise polyacrylamide hydrogel of 0.5 kPa in elasticity modulus. UC were isolated from umbilical cord of the newborn， and then the tsUC were obtained through the infection of temperature-sensitive Simian 40 Large T-antigen （ts-SV40LT） retrovirus. There were three experiment groups in this study， including UC+NT+glass （group A）， UC+NT+0.5 kPa PA （group B）， and tsUC+MHT+0.5 kPa PA （group C）. Cell growth and morphological changes in each group were given dynamic observation. 7 days later， cell immunofluorescence were implemented， with the differentiation level of each group estimated and the axon length of the differentiated neurons calculated by using Image J software. Results The elasticity modulus of PA gels was （0.50±0.03） kPa. A small amount of cells resembling the neurons were presented in group B and C， with small soma and long， slender protuberances. Cell immunofluorescence statistics demonstrated that the cells differentiated into neurons expressing beta-tubulin Ⅲ. The neuron differentiation rate and axon length were significantly higher than that of group A， which have no beta-tubulin Ⅲ expressing. However， there was no obvious difference between group B and C （P > 0.05）. Conclusion tsUC can differentiate to neurons in the environment mimicking the elastic modulus of brain tissue， which can be applied into cell transplantation of brain injury under MHT.

[Key words] Temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells； Polyacrylamide gels； Elastic modulus； Biomechanics

細(xì)胞生物學(xué)性能的調(diào)控機(jī)制與細(xì)胞的生物力學(xué)特性有關(guān)，包括細(xì)胞內(nèi)部的收縮力、細(xì)胞與基質(zhì)之間的牽張力、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用力等[1-2]。體外培養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)基質(zhì)的彈性模量是細(xì)胞生物力學(xué)的一個(gè)重要體現(xiàn)，且對(duì)干細(xì)胞分化具有調(diào)節(jié)作用[3-5]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC）具有多向分化的潛能，在彈性模量為11～30 kPa的培養(yǎng)基中多向成骨細(xì)胞分化，在2.5～5.0 kPa的培養(yǎng)基中多向脂肪細(xì)胞分化，而在0.1～1.0 kPa的培養(yǎng)基中，則可能向神經(jīng)元進(jìn)行分化[4，6]。

本課題組前期已經(jīng)建立了一種溫敏臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells，tsUC）系，發(fā)現(xiàn)tsUC在亞低溫（mild hypothermia treatment，MHT）作用下可促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)[7-8]，并對(duì)tsUC的增殖、溫度敏感等特性進(jìn)行了初步探討[9]，但其生物力學(xué)特性尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬在體外對(duì)人UC進(jìn)行擴(kuò)增以及力學(xué)誘導(dǎo)，觀察其在模擬腦組織硬度的培養(yǎng)基中的分化情況，從力學(xué)角度探討MHT聯(lián)合tsUC的分化特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新生兒臍帶（由武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，已通過武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院倫理協(xié)會(huì)審查），攜溫度敏感型猿猴病毒40大T抗原（ts-SV40LT）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒（加利福尼亞大學(xué)，美國(guó)），神經(jīng)元β-tubulin Ⅲ一抗及熒光標(biāo)記二抗（Millipore，美國(guó)），UC流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（BD，美國(guó)），單丙烯酰胺（Amresco，美國(guó)），雙丙烯酰胺（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所），硝化纖維、苯基疊氮化物交聯(lián)劑（sulfo-SANPAH）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、二氯二甲基硅烷（天津鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司），I型膠原蛋白（Sigma，美國(guó)）。

1.2 聚丙烯酰胺水凝膠的制備和檢測(cè)

將單、雙丙烯酰胺（0.03%～0.3%）按不同比例混合[10]，加入過硫酸銨（1/200 V）和TEMED（1/2000 V）置于凹槽中后蓋以玻璃板。凝結(jié)后切取2 cm×1 cm×2 mm的樣本，應(yīng)用力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（Instron 5865，美國(guó)）進(jìn)行拉伸測(cè)試，重復(fù)測(cè)量10次，篩選出彈性模量為0.5 kPa的PA水凝膠。

1.3 模擬腦組織彈性模量二維培養(yǎng)基的制備

根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果，配制彈性模量為0.5 kPa所對(duì)應(yīng)的單丙烯酰胺和雙丙烯酰胺混合液[11]。22 mm × 22 mm蓋玻片表面均勻涂抹3-氨基丙基三甲氧基硅烷后浸泡在0.5%戊二醛溶液中，30 min后清洗、晾干，并在玻片表面涂硝化纖維以增加黏性。蓋玻片均勻鋪被25 μL混合液后加蓋經(jīng)二氯二甲基硅烷預(yù)處理的18 mm×18 mm蓋玻片。待聚合完成后，暴露水凝膠并紫外消毒。將200 μL sulfo-SANPAH（50 mmol/L，pH=8.5）均勻滴在水凝膠表面，于無菌罩中紫外光活化5 min。將0.2 mg/mL的I型膠原蛋白均勻鋪在水凝膠表面，0.2 mg/mL的I型膠原蛋白包被玻片作為對(duì)照組。

1.4 tsUC的建立與鑒定

從健康新生兒臍帶中分離出UC，進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，用流式細(xì)胞分析儀（BD，美國(guó)）測(cè)定各類抗原的陽(yáng)性率[6]。細(xì)胞融合率60%時(shí)，用含4 μg/mL聚凝胺的tsSV40LT病毒懸液對(duì)細(xì)胞感染48 h，并根據(jù)前期研究方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定[7-9]。將感染成功的tsUC置于33℃培養(yǎng)箱中，余培養(yǎng)條件同UC[12]。

1.5 實(shí)驗(yàn)干預(yù)及分組

實(shí)驗(yàn)按培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基彈性模量分為3組：UC+NT+glass組（A組）為玻片上常溫培養(yǎng)UC；UC+NT+0.5 kPa組（B組）為0.5 kPa的PA水凝膠上常溫培養(yǎng)UC；tsUC+MHT+0.5 kPa組（C組）為0.5 kPa的PA水凝膠上亞低溫培養(yǎng)tsUC。各組細(xì)胞（5×103個(gè)/mL）均加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定期在相差顯微鏡（Optic BD200-PH，美國(guó)）下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)變化。

1.6 細(xì)胞免疫熒光

各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后進(jìn)行免疫熒光染色以檢測(cè)細(xì)胞分化情況。加入羊抗大鼠β-tubulin Ⅲ一抗和熒光標(biāo)記的二抗，細(xì)胞核DAPI染色，于倒置熒光顯微鏡（Leica DMI4000B，德國(guó)）下觀察。隨機(jī)取10個(gè)位點(diǎn)計(jì)數(shù)，并計(jì)算各組陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，即為近似分化率。應(yīng)用Image J軟件測(cè)量神經(jīng)元的軸突長(zhǎng)度，計(jì)算各組神經(jīng)元軸突的平均長(zhǎng)度[13]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 tsUCMSCs培養(yǎng)和鑒定

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，細(xì)胞表面標(biāo)記CD90、CD105、CD73呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34、CD116、CD19、CD45、HLA-DR呈陰性表達(dá)。感染成功的tsUC呈漩渦狀生長(zhǎng)，類似于UC，形態(tài)多為梭形、多邊形或成纖維細(xì)胞形態(tài)，大小均一（圖1）。

2.2 以PA水凝膠為基礎(chǔ)的細(xì)胞培養(yǎng)基

通過力學(xué)試驗(yàn)機(jī)的測(cè)量及篩檢，最終得到彈性模量為（0.50±0.03）kPa的PA水凝膠。按相應(yīng)比例于蓋玻片上配制出該彈性模量的培養(yǎng)基。見圖2。

2.3 光鏡下細(xì)胞形態(tài)變化

各組細(xì)胞均貼于玻片生長(zhǎng)，其中A組細(xì)胞在7 d內(nèi)未發(fā)生明顯變化，B、C組細(xì)胞的胞體大致呈圓形或橢圓形，與A組的細(xì)胞相比，胞體逐漸變小，并出現(xiàn)長(zhǎng)而纖細(xì)的胞突。見圖3。

2.4 細(xì)胞免疫熒光

B、C兩組均有β-tubulin Ⅲ表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，提示分化的神經(jīng)元細(xì)胞；而A組無陽(yáng)性表達(dá)。見圖4。B、C組神經(jīng)元總體分化率分別為11.3%和10.4%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.5 軸突長(zhǎng)度分析

B、C兩組細(xì)胞均有明顯突起，B和C組分化的神經(jīng)元軸突平均長(zhǎng)度分別為（262.52±36.16）μm和（229.83±33.95）μm，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

3 討論

細(xì)胞生物力學(xué)已逐漸成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。在各種內(nèi)外機(jī)械因素影響下，生物學(xué)信息可通過力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用于人體細(xì)胞，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化[14]。干細(xì)胞原位移植后，其周圍不同彈性基質(zhì)可誘導(dǎo)其分化為更接近宿主組織的細(xì)胞[15-16]。Engler等[6]研究證實(shí)，在彈性模量為0.1～1.0 kPa的培養(yǎng)條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞可向神經(jīng)元分化。本研究以培養(yǎng)基彈性模量這一力學(xué)特性為基礎(chǔ)，探討了在模擬正常腦組織彈性模量的培養(yǎng)條件下tsUC向神經(jīng)元分化的水平。在培養(yǎng)基的制備方面，本研究借鑒了Engler等[6]和Pelham等[11]的方法，根據(jù)單、雙丙烯酰胺的不同混合比例，制備模擬腦組織硬度的PA水凝膠，并應(yīng)用力學(xué)試驗(yàn)機(jī)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，保證了培養(yǎng)基彈性模量的精確性，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)液，制備二維培養(yǎng)基。

光鏡下可見，在彈性模量為0.5 kPa的培養(yǎng)基中，tsUC向神經(jīng)樣細(xì)胞變化，胞體變小、胞突伸長(zhǎng)，可見典型的軸突，這與相同培養(yǎng)基中UC的細(xì)胞形態(tài)變化類似，而玻片上的UC無明顯形態(tài)變化。免疫熒光結(jié)果顯示，神經(jīng)元表達(dá)只在彈性模量為0.5 kPa的培養(yǎng)基中出現(xiàn)，且tsUC和UC之間無明顯差異。上述結(jié)果表明，與UC相比，tsUC在亞低溫條件下的分化能力基本不受影響，可向神經(jīng)元分化。由此說明在亞低溫的作用下，tsUC的生物力學(xué)性能并未發(fā)生明顯變化。

生物力學(xué)在神經(jīng)組織方面也有重要意義，正常腦組織的軟基質(zhì)能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，因此模擬腦組織能保證移植干細(xì)胞的存活率和分化率。TBI后不僅腦組織的理化性質(zhì)受到破壞，而且腦細(xì)胞原本的力學(xué)微環(huán)境也發(fā)生相應(yīng)改變，此時(shí)腦組織硬度明顯增大[19-20]，這便影響腦組織的原位細(xì)胞以及損傷處移植干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化水平。本文以細(xì)胞生物力學(xué)為基礎(chǔ)，模擬腦組織彈性模量，證實(shí)了亞低溫作用下tsUC具有穩(wěn)定的生物力學(xué)性能和神經(jīng)元分化能力，從生物力學(xué)角度為亞低溫聯(lián)合tsUC移植治療TBI的研究提供了重要依據(jù)，并推動(dòng)該項(xiàng)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。

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（收稿日期：2016-09-10 本文編輯：程 銘）