江士遠 向 娜

單縣海吉亞醫(yī)院兒科（山東單縣 274300）

先天性肌營養(yǎng)不良1A型1例臨床與基因分析

江士遠 向 娜

單縣海吉亞醫(yī)院兒科（山東單縣 274300）

目的報道1例LAMA2基因變異導致先天性肌營養(yǎng)不良的臨床、實驗室檢查及遺傳學特點。方法回顧分析1例先天性肌營養(yǎng)不良1A型患兒的臨床資料，并復習相關文獻。結果患兒，男，5歲2個月，臨床表現(xiàn)為運動發(fā)育落后，2歲時可獨坐，不能獨走；肌力及肌張力低下，早期出現(xiàn)關節(jié)攣縮。生化檢測發(fā)現(xiàn)肌酸激酶（CK）升高（491 U/L），其同工酶CK-MB升高（41.8 U/L）；肌電圖提示肌源性損害可能；頭顱MRI提示大腦白質異常信號。基因檢測發(fā)現(xiàn)LAMA2存在復雜雜合突變，c.2045-2046delAG雜合缺失，來自母親，為已報道的致病變異；exon5存在雜合缺失，來自父親，為未報道的新變異，軟件功能預測提示為致病性變異。結論LAMA2基因變異導致先天性肌營養(yǎng)不良，患兒以運動發(fā)育落后起病，CK升高，高通量基因檢測有助于明確診斷。

先天性肌營養(yǎng)不良; 臨床特點; 分子診斷

先天性肌營養(yǎng)不良（congenital muscular dystrophy，CMD）是一類出生后早期起病、主要影響骨骼肌功能的疾病，不同的肌營養(yǎng)不良雖有相似的臨床表型，但遺傳差異很大[1]。LAMA2基因突變導致的先天性肌營養(yǎng)不良1A型（congenital muscular dystrophy type 1A， MDC1A）又稱merosin缺乏癥，是首先被分離出的一種肌營養(yǎng)不良癥，約占先天性肌營養(yǎng)不良的40%，屬于常染色體隱性遺傳病，歐美國家較多見[2，3]。MDC1A臨床表現(xiàn)為出生時或出生后不久出現(xiàn)肌張力低下、肌肉無力、運動發(fā)育遲緩以及關節(jié)攣縮等癥狀，肌酶可有輕到中度升高，肌肉病理檢測可見肌營養(yǎng)不良改變[4]。現(xiàn)報告1例MDC1A，并對相關的文獻進行復習，探討臨床表現(xiàn)以及基因檢測對診斷的重要性。

1 臨床資料

患兒，男，5歲2個月，足月剖宮產(chǎn)，母孕期及出生時未見異常，出生后喂養(yǎng)困難，2歲可獨坐，早期出現(xiàn)關節(jié)萎縮，至今不能獨走。就診時體格檢查：神清，眼距寬，鼻梁低，上下牙齒不合；雙側呼吸運動對稱，未聞及啰音；心律齊，心音有力，心臟各聽診區(qū)均未聞及雜音；腹軟，肝脾肋下未觸及；四肢肌力及肌張力均降低，膝腱反射未引出，病理反射（－）。實驗室檢查：肌酸激酶（creatine kinase，CK）491 U/L（參考值25～195 U/L），肌酸激酶同工酶（creatinine kinase MB isoenzyme，CK-MB）41.8 U/L（參考值0～25 U/L）；肌電圖檢測發(fā)現(xiàn)肌源性損害可能；頭顱MRI提示大腦白質異常信號，主要累及側腦室前后角。根據(jù)以上表現(xiàn)患兒擬診為先天性肌營養(yǎng)不良1A型。其父母體健，非近親結婚，雙方家族中無類似疾病史。

經(jīng)家屬知情同意以及醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核后，抽取患兒及其父母外周靜脈血2 mL，置EDTA抗凝管，利用基因組DNA提取試劑盒（AXYGEN公司）提取基因組DNA，并測定濃度。委托華大基因公司利用目標區(qū)域序列捕獲法對患兒進行高通量測序分析（先天肌營養(yǎng)不良相關的基因檢測包），測序深度為200×，測序后行相應的軟件分析。結果發(fā)現(xiàn)患兒LAMA2基因存在c.2045-2046delAG雜合缺失（圖1），2個堿基缺失可導致基因所編碼的蛋白產(chǎn)生移碼突變即LAMA2蛋白在682位賴氨酸開始產(chǎn)生移碼突變并在之后22位氨基酸處終止（p.Lys682fsX22）。

圖1 突變位點高通量測序reads比對圖

對突變結果進行Sanger測序驗證。在LAMA2基因突變位點的兩端設計擴增引物，利用PCR方法擴增出含有突變位點的片段，其中25μL的PCR擴增體系中含10 mmol Tris-HCl（pH 8.3），50 mmol KCl，1.5 mmol MgCl2，0.3 mmol dNTP，引物各200 pmol，Taq 1.0 U（東盛生物公司），在Bio-Rad PCR儀上進行擴增，擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共34個循環(huán)。擴增產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)患兒存在c.2045-2046delAG雜合缺失，其母親也存在該位點突變，其父親未見異常，見圖2，說明患兒該位點的異常遺傳自其母親。

圖2 c.2045-2046delAG測序圖

對高通量測序的結果進一步分析發(fā)現(xiàn)，患兒LAMA2基因exon5測序深度較其他外顯子低，推測患兒LAMA2基因exon5可能存在雜合缺失。選取ACTB基因為內參利用實時熒光定量PCR方法驗證發(fā)現(xiàn)，相對于正常對照，患兒的exon5片段拷貝數(shù)降低了約50%，說明患者LAMA2基因exon5存在雜合缺失，且患者父親亦存在該區(qū)域的雜合缺失（圖3），說明患兒該區(qū)域的異常遺傳自其父親。

圖3 實時熒光定量exon5拷貝數(shù)

2 討論

CMD于1960年由日本學者福山首先報道?；純撼錾鷷r或出生后數(shù)月內即出現(xiàn)肌力和肌張力低下及關節(jié)攣縮，肌活檢病理可見典型的肌營養(yǎng)不良改變，其他臨床表現(xiàn)為脊柱后突、髖關節(jié)脫位、近端關節(jié)攣縮、斜頸等，后期運動能力變異很大，部分可以自由活動，而嚴重者始終不能獨立行走[5]。該疾病主要分為福山型（Fukuyama type）和非福山型兩大類，而非福山型又可分為merosin缺乏癥（MDC1A）、肌-眼-腦?。ㄓ址QSantavouri?。?、Walker-Warburg綜合征、先天性肌營養(yǎng)不良合并脊柱強直綜合征以及Ullrich病等[3]。高通量測序技術又稱下一代測序技術，能一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。國內外很多研究組利用該技術對相關疾病進行遺傳學分析，如對杜氏/貝式肌營養(yǎng)不良、無腦回畸形及肥厚型心肌病等疾病的致病基因的檢測[6-8]，研究結果均顯示高通量測序技術具有高通量、低成本以及高靈敏度的特點，適合致病基因不確定及基因較大疾病的檢測。目前已經(jīng)證實，多種基因突變與CMD發(fā)病相關[3]，因此本例患兒選擇與先天性肌營養(yǎng)不良相關的致病基因panel進行檢測。

研究發(fā)現(xiàn)，LAMA2基因突變與MDC1A的發(fā)病有關。該基因定位于6q22-23區(qū)域，包括65個外顯子，編碼Laminin-a2蛋白(又稱merosin)[9]，基因突變的類型包括無義突變、錯義突變、缺失重復以及剪接位點的突變，目前文獻及數(shù)據(jù)庫（HGMD database）中記錄了約230多種LAMA2基因相關的突變。Merosin是一種糖蛋白，是異源三聚體復合物laminin-2和laminin-4的其中一條鏈，存在于橫紋肌細胞外基質、神經(jīng)-肌肉接頭、皮膚以及滋養(yǎng)層等處，該蛋白參與細胞間的識別、細胞分化以及遷移等過程，對維持正常的血腦屏障功能、引導神經(jīng)元移行有重要意義[10]。Merosin有6個結構域，與細胞外基質的大分子結合，建立一個連接肌細胞骨架和細胞外基質的橋梁。LAMA2基因突變后，merosin蛋白功能缺陷，使得肌膜完整性破壞，導致MDC1A發(fā)生[11]。

本例患兒胎兒期及出生時未見異常，出生后喂養(yǎng)困難，2歲可獨坐，但至今不能獨行。實驗室檢查發(fā)現(xiàn)肌酸激酶及其同工酶均升高，肌電圖提示肌源性損害可能，磁共振顯示腦白質異常信號。結合臨床表現(xiàn)患兒疑似先天性肌營養(yǎng)不良。不足之處是本例患兒未作肌肉活檢?；驒z測發(fā)現(xiàn)患兒存在復雜雜合突變（c.2045-2046delAG，del Exon5），故患兒MDC1A診斷確立。通過文獻搜索及數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)del Exon5為未見報道的新突變。

綜上所述，MDC1A疾病起病較早，患兒出生時或出生后數(shù)月內即出現(xiàn)肌力和肌張力低下和關節(jié)攣縮，肌活檢病理可見典型的肌營養(yǎng)不良改變。高通量測序可高效的進行遺傳突變分析，有助于進一步明確診斷。

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(本文編輯：蔡虹蔚)

Congenital muscular dystrophy type 1A: a report of one case with literature review

IANG Shiyuan，XIANG Na

(Department of Paediatrics，Shanxian Hygeia Hospital，Shanxian 274300，Shandong, China)

ObjectiveTo investigate the clinical features and genetic tests of a case with congenital muscular dystrophy type 1A (MDC1A).MethodsClinical data of proband were collected, and genetic change were tested using next generation sequencing, and literatures pertinent to the epidemiology, mechanisms, especially genetic testing of lisencephaly were reviewed.ResultsA 5 year and 2 month old boy present with normal intelligence and delayed motor development, he can be sit alone but not walk at two years old. Physical examination showed normal mental reaction, muscular dystrophy, hypotonia, and joint contracture at early age. From biochemical tests, we found creatine kinase (CK) and CK-MB were increased (491U/L, 41.8U/L). EMG test suggested possible muscle-derived damage. Brain MRI showed white matter abnormality. And a heterozygous mutation (c.2045-2046delAG) inherited from his mother in LAMA2 gene, and another novel heterozygous mutation (del Exon5) inherited from his father were identi fi ed by genetic test.ConclusionsLAMA2 gene de fi ciency can lead to MDC1A, and gene testing can help diagnosis.

congenital muscular dystrophy type 1A ; clinical features; genetic testing

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.05.012

2016-11-01)