陶波 方梅 張嘉男 歐云文 賈寧

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070）

沙冬青種子總黃酮測定方法及純化工藝研究

陶波 方梅 張嘉男 歐云文 賈寧

（甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070）

旨在建立沙冬青種子總黃酮測定方法及沙冬青種子總黃酮純化工藝。選用常用4種黃酮顯色方法，通過紫外波長掃描分別確定槲皮素為對照品及沙冬青種子總黃酮的最佳吸收波長，建立標準曲線，并對各測定方法進行方法學驗證，利用新建立的條件方法對沙冬青種子總黃酮進行含量測定；實驗選擇AB-8、D101、S-8型大孔樹脂通過靜態(tài)吸附及解析試驗，篩選出AB-8型大孔樹脂進行動態(tài)試驗，建立大孔樹脂純化工藝條件，進一步通過乙酸乙酯進行萃取，提高其總黃酮純度。結(jié)果顯示，以槲皮素為對照品，采用AlCl3-CH4O顯色法，在檢測波長為335 nm條件下可對沙冬青種子總黃酮含量進行有效測定；AB-8型大孔樹脂在上樣液濃度為6 mg/mL、上樣液pH5.5、上樣液體積5 BV、上樣液流速3.5 BV/h條件下吸附，以70%乙醇、洗脫液流速1.5 BV/h、洗脫液體積6 BV條件下洗脫，沙冬青種子總黃酮含量由純化前5.69%提高到41.07%；用AB-8樹脂純化后的總黃酮配置成一定濃度溶液后用乙酸乙酯萃取，總黃酮含量達到76.15%。

沙冬青種子；總黃酮；AlCl3顯色法；大孔樹脂；萃??；純化

沙冬青為豆科旱生植物，主要分布于我國西北、蒙古國和俄羅斯。沙冬青也是甘肅與阿拉善戈壁荒漠唯一的強旱生常綠灌木，其種子可提取特種工業(yè)用油，枝葉入藥，可祛風、活血、止痛、外用主治凍瘡、慢性風濕性關節(jié)炎等［1］。研究表明，從沙冬青種子中分離、提取的沙冬青主要成分是生物堿；其次是黃酮類化合物［2］，黃酮類化合物不僅具有良好的抑菌特性［3，4］，而且也具有良好的免疫增強作用［5］和抗腫瘤的作用［6］。

目前，常用總黃酮含量測定方法主要有薄層色譜掃描法、紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法、超臨界流體色譜法和毛細管電泳法等幾種主要的方法。其中紫外-可見分光光度法檢測植物中總黃酮的方法具有操作簡便，檢測成本低廉的特點常被作為主要的測定方法［7］。但由于植物中提取物成分非常復雜，所含總黃酮種類也有所差異，同時，由于選用的檢測試劑不同可能也會對沙冬青種子總黃酮測定結(jié)果造成誤差［8］。本實驗針對沙冬青種子總黃酮用槲皮素為對照品，應用紫外-可見分光光度法在不同顯色體系中進行含量測定，并分別對其進行方法學驗證，建立一種更加可靠、有效的含量測定方法。其次，由于沙冬青種子總黃酮粗提物中總黃酮含量較低且成分復雜，單一使用乙酸乙酯萃取方法效率低且成本較高，而單一使用大孔樹脂純化后，總黃酮含量有所提高，但實際應用價值較低。因此，建立高效的沙冬青種子總黃酮純化工藝，提高其應用價值具有現(xiàn)實意義。本實驗首先使用大孔樹脂對其進行富集與純化［9，10］，分別考察了上樣液濃度，上樣液體積，pH值，洗脫液乙醇濃度，洗脫流速，洗脫液體積對吸附及洗脫效果的影響，然后進一步通過乙酸乙酯萃取方法對沙冬青種子總黃酮進行萃取，通過兩者的結(jié)合，有效的提高了總黃酮含量，從而確定最佳純化工藝路徑。

1 材料與方法

1.1 材料

沙冬青種子購于寧夏西貝農(nóng)林牧生態(tài)科技有限公司，干燥粉碎后備用。無水乙醇，石油醚，甲醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，乙酸乙酯，無水三氯化鋁均為分析純，購于天津光復化學試劑公司，槲皮素標準品（CAS#117-39-5，LOT：C20J6Y1722，HPLC≥98%）上海源葉生物科技有限公司，AB-8型樹脂，D-101型樹脂，S-8型樹脂均購于天津市光復化工研究所。

1.2 方法

1.2.1 沙冬青種子中總黃酮粗品溶液制備 稱取一定量沙冬青種子粉末在提取工藝為溫度40℃，乙醇體積分數(shù)為70%，提取時間為50 min，料液比為20 g/mL得到沙冬青種子總黃酮粗提液于60℃對其進行干燥處理，研磨過篩獲得總黃酮粗品。將總黃酮粗品用70%（V/V）乙醇配置成一定濃度溶液后作為待測樣品溶液備用。

1.2.2 不同顯色方法 直接測定法：準確吸取樣品溶液0.2 mL，用60%乙醇溶液定容至25 mL，充分混勻后，靜置5 min后測定吸光度；NaOH顯色法［11］：準確吸取樣品溶液0.2 mL，加入60%乙醇溶液2 mL，4% NaOH溶液1 mL，混勻后靜置顯色5 min后以60%乙醇溶液定容至25 mL，測定吸光度；NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法顯色法：準確吸取樣品稀釋液0.2 mL，加入蒸餾水2 mL，混勻后加入5% NaNO3溶液1 mL，充分混勻，反應6 min后加入10% Al（NO3）3溶液1 mL，充分混勻，6 min后加入4% NaOH溶液4 mL，混勻后靜置顯色15 min后以蒸餾水定容至25 mL，測定其吸光度；AlCl3-CH4O顯色法［12］：準確吸取樣品溶液0.2 mL，以0.01 mol/L AlCl3-CH4O溶液定容至25 mL，充分混勻后，靜置10 min后測定吸光度。

1.2.3 最佳檢測方法的建立 準確吸取一定量的沙冬青總黃酮待測液和槲皮素標準液，按1.2.2中顯色方法進行顯色處理，分別在200-600 nm條件下進行波長掃描。根據(jù)掃描光譜圖選定最佳待測吸收波長，分別以建立以槲皮素為對照品在4種顯色方法下的標準曲線，并對4種顯色方法在選定的最佳波長下進行精密度、重復性及加樣回收率測定。

1.2.4 沙冬青總黃酮純度測定 按上述1.2.3確立的最佳檢測方法，測定吸光度A，根據(jù)槲皮素總黃酮含量C（mg/mL）與吸光度A的線性回歸方程計算樣品溶液中總黃酮的含量 C（mg/mL）。通過計算，得出沙冬青種子中總黃酮提取物的純度。

1.2.5 大孔吸附樹脂型號選擇 稱取預處理過的大孔吸附樹脂1.0 g置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL已知濃度的沙冬青黃酮粗提物溶液，放置于恒溫振蕩器，室溫避光振搖12 h使總黃酮充分吸附，過濾，準確量取一定量剩余液，測定剩余液中總黃酮濃度，按照公式（1）計算其吸附率；將吸附飽和的樹脂過濾，精密加入70%的乙醇50 mL后放置于恒溫振蕩器，室溫避光振搖12 h使總黃酮充分解析，取濾液過濾后測定解析液中總黃酮濃度，按照公式（2）。

式中，C0為沙冬青樣品液初始總黃酮濃度（mg/mL），C1為吸附平衡后沙冬青總黃酮濃度（mg/mL），C2為解析液中沙冬青總黃酮濃度（mg/mL）。

1.2.6 AB-8大孔吸附樹脂吸附性能實驗

1.2.6.1 大孔吸附樹脂對沙冬青種子中黃酮靜態(tài)吸附動力學實驗 稱取預處理好的AB-8大孔吸附樹脂1.0 g于100 mL錐形瓶中，加入50 mL一定濃度的樣品溶液，封口，于臺式恒溫震蕩器中，室溫下避光振搖，每小時各取1 mL，測定其黃酮濃度，考察吸附時間對AB-8大孔吸附樹脂對沙冬青種子中總黃酮的吸附影響。

1.2.6.2 樣品液濃度對吸附性能的影響 配置濃度分別為0.61、1.83、3.05、4.27、5.76、6.71、7.93、9.15、10.37和11.59 mg/mL的沙冬青黃酮粗提物樣品液各50 mL，分別加入盛有1.0 g樹脂的錐形瓶，封口，置于恒溫振蕩器，室溫避光振搖6 h，使其充分吸附。過濾后，測定濾液中總黃酮濃度，確定樹脂的最佳吸附濃度。

1.2.6.3 上樣液pH值對吸附的影響 稱取預處理好的AB-8大孔吸附樹脂1.0 g于錐形瓶中，各加入50 mL濃度為6 mg/mL樣品溶液，pH值分別調(diào)至3、4、5、6和7，封口，放置在恒溫振蕩器上，室溫避光振搖6 h，考察不同上樣液pH值對AB-8大孔吸附樹脂對沙冬青種子中總黃酮的吸附影響

1.2.6.4 上樣液流速對吸附效果的影響 稱取預處理好的AB-8大孔吸附樹脂裝柱，濃度為6 mg/mL上樣液分別以2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h和5 BV/h過柱吸附，每10 mL收集一次液體，繪制曲線，確定最佳吸附流速。

1.2.6.5 AB-8 大孔吸附樹脂動態(tài)吸附條件正交試驗 在單因素條件實驗的基礎上，選擇上樣液濃度、上樣液pH、上樣液流速進行正交實驗，進一步對影響沙冬青種子總黃酮吸附的條件進行優(yōu)化。

1.2.7 AB-8 大孔吸附樹脂動態(tài)洗脫性能實驗

1.2.7.1 動態(tài)吸附透過實驗 稱取預處理好的AB-8大孔吸附樹脂30.0 g裝柱，濃度為6 mg/mL，流速為3.5 BV/h過柱，每10 mL收集一次液體，測定流出液吸光值并計算其濃度。

1.2.7.2 洗脫液濃度對解析效果的影響 本實驗采用乙醇溶液為洗脫劑，在洗脫劑流速為1 BV/h下，分別在乙醇體積分數(shù)為60%、70%和80%下進行洗脫，考察不同體積分數(shù)的乙醇溶液對AB-8大孔吸附樹脂解析的影響。

1.2.7.3 洗脫流速對解析效果的影響 將吸附飽和的大孔吸附樹脂濾干，以70%乙醇作為洗脫液，控制流速1 BV/h、1.5 BV/h、2 BV/h和2.5 BV/h（為吸附流速的1/2），每10 mL收集一次液體?？疾觳煌疵摿魉賹B-8大孔吸附樹脂解析的影響。

1.2.7.4 洗脫液用量對解析效果的影響 將吸附飽和的大孔吸附樹脂濾干，以70%乙醇，流速為1.5 BV/h進行洗脫，每10 mL收集一次液體，測定其吸光度，確定其充分洗脫時所需的洗脫液用量。

1.2.8 乙酸乙酯對沙冬青種子中總黃酮萃取 稱取一定量由AB-8 大孔吸附樹脂純化的總黃酮粉末，配置成一定濃度的溶液后，用乙酸乙酯按體積1∶1進行萃?。ㄒ话爿腿?-4次），收集乙酸乙酯相于60℃進行減壓蒸餾濃縮，干燥至恒重后測定總黃酮含量。

2 結(jié)果

2.1 沙冬青種子中總黃酮測定方法建立

2.1.1 沙冬青種子總黃酮粗提物及槲皮素不同顯色方法下波長測定 由于槲皮素對照品與沙冬青種子總黃酮粗提物最大掃描波長存在差異，為提高沙冬青種子中總黃酮含量檢測的真實性，減少實驗誤差，以沙冬青種子總黃酮粗提物顯色后掃描結(jié)果為主，通過掃描波長數(shù)據(jù)圖譜（圖1），確定其各顯色方法下的最大吸收波長。直接法：280 nm和325 nm；NaOH法：285 nm和 393 nm；NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法：335 nm和390 nm；AlCl3-CH4O法：303 nm和335 nm。在各顯色方法下選擇最佳吸收波長，建立標準曲線并進行方法學驗證。

圖1 槲皮素對照品及沙冬青種子總黃酮粗提物波長掃描結(jié)果

2.1.2 以槲皮素為標準品在不同顯色方法下建立標準曲線 由表1可知，槲皮素在4種顯色方法下，根據(jù)2.1.1所選擇對應的最大吸收波長獲得的標準曲線均呈較好的線性關系，通過線性方程計算得出的值可靠有效。

表1 槲皮素標準品4種顯色方法下的標準曲線

2.1.3 沙冬青種子總黃酮粗提物在不同顯色方法下方法學驗證 由表2可知，4種顯色方法緊密度RSD值較低，即緊密度都相對較好。直接法重現(xiàn)性RSD值較其他3種顯色方法大，且加樣回收率低，即該方法測得的總黃酮含量數(shù)值偏低；NaOH法加樣回收率較大，重現(xiàn)性RSD值較大但在誤差范圍內(nèi)，但其穩(wěn)定性較差；NaNO3-Al（NO3）3法重現(xiàn)性RSD值大，穩(wěn)定性也差。AlCl3-CH4O法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性RSD值較小，且回收率也較好。綜合2.1.1最大掃描波長數(shù)據(jù)圖譜分析，以槲皮素為對照品，通過AlCl3-CH4O顯色法在檢測波長為335 nm下對沙冬青種子總黃酮粗提物含量測定操作方法簡單，具有很好的穩(wěn)定性、重復性和準確度等優(yōu)點。

2.1.4 待測樣品溶液總黃酮含量測定 將5份待測樣品測得的吸光值A求得平均值后，利用所得標準曲線回歸方程計算得出待測溶液中總黃酮的濃度為1.249 mg/mL（表3），沙冬青種子總黃酮粗提取物含量為5.69%。

表2 沙冬青種子中總黃酮4種顯色方法方法學驗證

表3 待測樣品溶液吸光值

2.2 AB-8大孔吸附樹脂對沙冬青種子中總黃酮純化條件

2.2.1 不同型號大孔吸附樹脂對沙冬青總黃酮吸附率及解析率 通過表4可知，在相同條件下樹脂的類型不同，對總黃酮吸附和解析能力也有所差異。實驗結(jié)果表明，S-8型大孔樹脂吸附能力最強，

D101大孔樹脂吸附能力略強于AB-8大孔樹脂；S-8型大孔樹脂解析能力最差，AB-8型大孔樹脂解析能力強于D101型大孔樹脂。綜合上述情況，選擇AB-8型大孔樹脂作為純化所用樹脂。

表4 3種大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附及解吸性能

2.2.2 AB-8大孔吸附樹脂吸附性能的實驗

2.2.2.1 大孔吸附樹脂對沙冬青種子中黃酮靜態(tài)吸附動力學實驗 由圖2可知，隨著時間的增加，剩余液總黃酮濃度逐漸減少，在0-3 h內(nèi)，總黃酮濃度迅速減小，當達到6 h時，剩余液總黃酮濃度隨時間增加幾乎不變，說明AB-8樹脂對沙冬青種子中總黃酮的吸附快速達到吸附飽和，因此AB-8大孔樹脂適合進行沙冬青種子中總黃酮的純化。

圖2 AB-8大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線

2.2.2.2 樣品液濃度對吸附性能的影響 由圖3可知，AB-8大孔樹脂吸附能力隨上樣液濃度增加而增強，在總黃酮較低濃度時，溶液中雜質(zhì)與總黃酮存在競爭而使其吸附率較低。當總黃酮濃度過高時，容易導致總黃酮分子之間發(fā)生聚沉而黏附于樹脂表面，不利于樹脂吸附。因此，當總黃酮粗體物上樣液濃度確定為6 mg/mL時，吸附效果較好。

圖3 上樣液濃度對吸附性能影響

2.2.2.3 上樣液pH值對吸附的影響 由圖4可知，上樣溶液在弱酸性條件下，大孔樹脂吸附效果較好，pH值為5的時候，吸附效果最好，當溶液酸性過強，黃酮類化合物容易轉(zhuǎn)為佯鹽導致吸附率下降。

圖4 上樣液pH值對吸附性能的影響

2.2.2.4 上樣液流速對吸附的影響 由圖5可知，當上樣液流速為2 BV/h時，吸附效果最好，隨著上樣流速增大，溶液中總黃酮不能充分被大孔樹脂吸附導致吸附率降低。為了保證大孔樹脂充分利用及提高生產(chǎn)效率，實驗選用最佳上樣流速為3 BV/h。

圖5 上樣液流速對吸附率的影響

2.2.2.5 AB-8 大孔吸附樹脂動態(tài)吸附條件正交試驗 正交實驗設計表如表5所示。正交實驗極差分析顯示，影響AB-8大孔吸附樹脂吸附的諸因素的主次關系依次是上樣液流速（D）＞上樣液濃度（A）＞pH值（B）。從表6可以得出最佳組合為A2B1D3，即上樣液濃度6 mg/mL、pH值5.5、上樣液流速3.5 BV/h，在此條件下沙冬青種子總黃酮吸附率達到87.33%。

表5 吸附工藝正交實驗設計表

表6 L9（34） 正交實驗設計與結(jié)果

2.2.3 AB-8 大孔吸附樹脂動態(tài)滲漏試驗 由圖6可知，隨著上樣液體積增加，流出液黃酮濃度逐漸升高，表明樹脂逐漸趨于飽和平衡。當上樣液體積達到5 BV時，隨著上樣液體積增加，流出液總黃酮濃度與初始濃度相同且不再變化，表明AB-8樹脂吸附達到飽和。

圖6 動態(tài)吸附滲露曲線

2.2.4 AB-8大孔吸附樹脂動態(tài)解析性能的試驗

2.2.4.1 解析液濃度對解析效果的影響 由圖7可知，用60%乙醇進行洗脫時相比70%、80%乙醇洗脫峰型較寬且完全洗脫黃酮所需乙醇體積更多，70%乙醇與80%乙醇峰型接近，綜合成本考慮，選擇70%乙醇作為洗脫條件。

圖7 不同濃度乙醇的洗脫曲線

2.2.4.2 洗脫液流速對洗脫效果的影響 由圖8可知，當上樣液流速為1 BV/h的時候，洗脫效果最好。隨著洗脫液流速增加使得洗脫液與大孔樹脂作用時間減少，被吸附的總黃酮不能充分解析，造成解析率減低。洗脫流速過慢則會增加生產(chǎn)周期，為提高總黃酮得率及縮短生產(chǎn)周期，實驗選擇最佳洗脫流速為1.5 BV/h。

圖8 不同洗脫流速的滲漏曲線

2.2.4.3 洗脫液用量對洗脫效果的影響 由表7可知，隨著洗脫液用量增加，洗脫液中黃酮含量逐漸增加。當洗脫液用量達到6 BV時，洗脫液黃酮含量隨洗脫液用量增加而增加量極小，考慮到成本，確定洗脫液用量為6 BV。

表7 不同體積70%乙醇洗脫效果

3 討論

3.1 沙冬青種子總黃酮測定方法

目前總黃酮的測定主要以蘆丁、槲皮素作為對照品，通過AlCl3-CH4O法和NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法進行顯色，但由于NaNO3-Al（NO3）3-NaOH法使用的試劑較多且不同植物所提取的總黃酮成分有所差異，對檢測帶來很大誤差。本實驗選用槲皮素為對照品，通過4種顯色方法對沙冬青種子總黃酮進行顯色，分別對其進行波長掃描后發(fā)現(xiàn)經(jīng)AlCl3-CH4O法顯色后，沙冬青種子總黃酮在303 nm和335 nm處均出現(xiàn)明顯的最大吸收峰，通過方法學驗證可知AlCl3-CH4O法在335 nm處精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性的相對標準偏差（RSD）分別為0.541%、1.05%、0.62%，均在誤差范圍以內(nèi)，其加樣回收率達到102.57%，故以槲皮素為對照品在波長335 nm通過AlCl3-CH4O法顯色后測定沙冬青種子總黃酮的方法可行，能為更加準確檢測沙冬青種子總黃酮提供依據(jù)。

3.2 沙冬青種子總黃酮純化工藝

由于沙冬青種子總黃酮粗提物中總黃酮含量較低且成分復雜，常單一使用乙酸乙酯萃取方法效率低且成本較高，而單一使用大孔樹脂純化后，總黃酮含量有所提升，但實際應用價值較低。本實驗分別挑選S-8（極性），AB-8（弱極性），D101（非極性）三種大孔樹脂，通過試驗選擇出吸附和解析性能相對較好的AB-8型大孔樹脂，分別從上樣液濃度，上樣液體積，上樣液流速，pH值，洗脫液乙醇濃度，洗脫流速，洗脫液體積對吸附及洗脫效果的影響進行考察，從而確定最佳純化工藝，純化后沙冬青種子總黃酮含量由純化前5.69%提高到41.07%；經(jīng)大孔樹脂純化后的總黃酮，配置成一定濃度溶液后用乙酸乙酯萃取，總黃酮含量達到76.15%。

4 結(jié)論

以槲皮素為對照品在波長335 nm通過AlCl3-CH4O法顯色后測定沙冬青種子總黃酮的方法可行，能為更加準確檢測沙冬青種子總黃酮提供依據(jù)。

確定最佳純化工藝為：上樣液濃度6 mg/mL、上樣液體積5 BV、上樣液流速3 BV/h，洗脫液為70%乙醇、洗脫液流速1.5 BV/h、洗脫液體積6 BV，純化后沙冬青種子總黃酮含量由純化前5.69%提高到41.07%；經(jīng)大孔樹脂純化后的總黃酮，配置成一定濃度溶液后用乙酸乙酯萃取，總黃酮含量達到76.15%。該工藝可行性高，可用于沙冬青種子總黃酮的純化，使其具有更好的應用價值。

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（責任編輯 李楠）

Determination and Purification of Total Flavonoids from Seeds of Ammopiptanthus mongolica

TAO Bo FANG Mei ZHANG Jia-nan OU Yun-wen JIA Ning
（College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）

This work is to establish the determination and purification method of total flavonoids from seeds of Ammopiptanthus mongolica. Four chromogenic methods were chosen for the determination of total flavonoids，the best absorption wavelengths were selected by UV-wavelength scanning of quercetin standard and total flavonoids from seeds of A. mongolica. Standard curves for quercetin by four chromogenic methods were built，and each method was verified via methodology，and the new experimental condition and method after verification were used to determine the content of total flavonoids from seeds of A. mongolica. In this experiment，3 kinds of macroporous resins of AB-8，D101，and S-8 were selected for static adsorption and elution test，and AB-8 was chosen for dynamic test，with which the process condition for purifying total flavonoids from seeds of A. mongolica was established，and the extraction was conducted with ethyl acetate to improve the purity of total flavonoid. The results showed that the determination of total flavonoids from seeds of A. mongolica with AlCl3-CH4O chromogenic method at 335 nm and quercetin as the standard substance was reliable and effective. Under the optimal condition，adsorption with AB-8 macroporous resins was 5 BV of 6 mg/mL sample solution at pH 5.5 at rate of 3.5 BV/h，and then elution was 6 BV of 70% ethanol at rate of 1.5 BV/h，the purity of the product was 41.07% from 5.69% before purification. The total flavonoids after purified with AB-8 resin were prepared into a certain concentration solution，and then extracted with ethyl acetate，the total flavonoids content reached 76.15%.

seeds of Ammopiptanthus mongolica；total flavonoids；AlCl3chromogenic method；macroporous resin；extraction；purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.05.009

2016-10-30

國家自然科學基金項目（31560686）

陶波，男，碩士研究生，研究方向：動物病理學及新獸藥研發(fā)；E-mail：315661125@qq.com

賈寧，男，碩士生導師，教授，研究方向：動物疾病病理與免疫病理學；E-mail：jianing@gansu.edu.cn