吳丹 張志鵬 馬玉超

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

鉛鋅礦區(qū)耐砷細菌的分離、鑒定及性質(zhì)研究

吳丹 張志鵬 馬玉超

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

旨在從湖南康家灣鉛鋅礦區(qū)的重金屬污染土壤樣品中篩選出耐高濃度砷的細菌菌株。用稀釋涂布法分離耐砷細菌；根據(jù)16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定分離得到的砷高耐受性菌株并檢測菌株內(nèi)含有的砷耐受性相關(guān)基因；用砷鉬藍法測定耐砷細菌的砷氧化還原能力；并通過吲哚乙酸（IAA）定量實驗檢測優(yōu)勢菌株產(chǎn)IAA的能力。結(jié)果顯示，從土壤樣品中共分離出152株耐砷細菌，其中6株細菌對As5+和As3+的耐受性值分別高達800 mmol/L和20 mmol/L；并且這6株耐砷細菌分屬于5個不同的屬：假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、芽孢桿菌屬、威廉氏菌屬和節(jié)細菌屬；菌株Tw31、Tw133、Sw149和Tw222中存在砷還原酶基因arsC，Bw218和Tw222中存在砷離子外排基因arsB/ACR3（2）；在72 h之內(nèi)，菌株Tw133和Tw222的As3+氧化率（約17 %）和As5+還原率（約35 %）均高于其他菌株；尤其是菌株Tw133在144 h具有48.66 %的As5+還原率；且這兩株菌分別能產(chǎn)生42.86 μg/mL和24.36 μg/mL的IAA。篩選出的Tw133和Tw222菌株在砷耐受性、砷氧還能力和產(chǎn)IAA能力等方面展現(xiàn)出了較明顯的優(yōu)勢，為深入研究細菌的砷耐受性機制提供了實驗材料。

耐砷細菌；耐砷基因；砷氧化還原；IAA

砷（As）廣泛存在于巖石圈、水圈和生物圈。長期接觸砷可以導(dǎo)致各種癌癥的發(fā)生，如膀胱癌、肺癌、皮膚癌等。目前，世界上包括孟加拉、印度、阿根廷、美國和中國等許多國家面臨著嚴重的砷污染威脅。有報道稱中國土壤中砷濃度的平均值為11.2 mg/kg，約為世界平均值（6 mg/kg）的2倍［1］。因此砷污染的治理迫在眉睫。

自然環(huán)境中的砷主要以As5+和As3+兩種無機價態(tài)形式存在，其中后者毒性大約為前者的100倍［2］。砷酸鹽的毒性源于其作為磷酸鹽的結(jié)構(gòu)類似物，可以取代磷酸鹽，抑制氧化磷酸化過程；而亞砷酸鹽能夠與半胱氨酸的巰基結(jié)合，破壞或干擾蛋白和酶的功能［3］，從而發(fā)揮毒性作用。目前砷污染的主要治理原理是通過物理、化學(xué)、生物等技術(shù)降低砷的毒性或增加其穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)在砷污染較嚴重的地區(qū)，一些特殊的“耐砷微生物”［4］在砷化合態(tài)的相互轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用［5］。目前報道較多的耐砷微生物有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、蒼白桿菌屬、節(jié)細菌屬、放線菌屬、微桿菌屬等［6-9］。微生物的耐砷特性與砷吸收、氧化還原、甲基化和外排等過程密切相關(guān)［10］。微生物體內(nèi)主要通過ars操縱子介導(dǎo)砷代謝過程，其中砷酸鹽還原酶（ArsC）［11］催化As5+還原成As3+，而As3+又被亞砷酸鹽外排泵（ArsB、ACR3）［12］排出細胞外，還有其他的一些相關(guān)基因arsR和arsD（調(diào)節(jié)基因），arsA（ATP酶基因），arsH［13］、arsO等也參與了輔助代謝過程。另外一種機制是由亞砷酸鹽氧化酶AioBA［11］催化介導(dǎo)的，它可以將高毒的As3+氧化成低毒、較穩(wěn)定的As5+。而Qin等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，在細菌Rhodopseudomonas palustris CGA009中As3+可以被轉(zhuǎn)甲基化酶ArsM經(jīng)過不同程度的甲基化，最終轉(zhuǎn)變成氣態(tài)的三甲基砷排出細胞，從而達到耐砷效果。近幾年，由于微生物的耐砷機制而演化出利用微生物進行砷污染的修復(fù)技術(shù)也受到了越來越多的關(guān)注。除此之外，有些耐砷微生物還有植物促生作用，可以促進蜈蚣草［15］、粉葉蕨［16］、大葉井口邊草［17］等一些砷富集植物對砷的吸收，從而達到微生物—植物協(xié)同作用修復(fù)砷污染的目的。

在土壤砷污染的來源中，礦業(yè)開采是主要原因之一。湖南的康家灣鉛鋅礦是中國的第四大礦區(qū)，至今已有100多年的開采歷史，在開采過程中，周圍環(huán)境被各種重金屬污染，如鉛、鋅、砷等，對人們的生活構(gòu)成很大的威脅。目前國內(nèi)外關(guān)于砷污染的環(huán)境中高耐砷性菌株分離的研究較少。本研究以該礦區(qū)作為研究對象，目的是分離篩選耐高濃度砷的細菌，并對其進行鑒定，通過研究其對砷的氧化還原能力、砷耐性基因及其他的與砷耐性相關(guān)的特性，從而確定目標菌株，進行下一步砷代謝機制的研究，旨為土壤砷污染的生物修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 采自湖南康家灣水口山鉛鋅礦（26°33'57.9"N 112°36'23.7"E）周圍礦渣區(qū)10-20 cm的表層土壤。采樣點周圍覆蓋冶煉礦渣，重金屬含量較高，表層植物較少。去除土壤表面礦渣，現(xiàn)場測定pH值，用無菌鏟取約5 kg左右的新鮮表層土壤，置于無菌袋中，做好標記，將無菌袋放入冰盒中空運回實驗室。取一部分新鮮樣品，立刻進行細菌分離，剩余的樣品存于4℃冰箱中，用于化學(xué)分析，土壤的理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤的基本性質(zhì)

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。CDM培養(yǎng)基［18］：溶液 A（0.081 2 mol/L七水硫酸鎂，0.187 mol/L氯化銨，0.07 mol/L無水硫酸鈉，0.574 mmol/L磷酸氫二鉀，4.57 mmol/L二水合氯化鈣和0.446 mol/L乳酸鈉），121℃滅菌20 min；溶液B（4.8 mmol/L七水硫酸亞鐵）和溶液C（0.95 mol/L碳酸氫鈉），用0.45 μm過濾器過濾除菌。分別配制上述3種溶液，1 L CDM液體培養(yǎng)基中含有100 mL溶液A、2.5 mL溶液B、10 mL溶液C和887.5 mL蒸餾水，調(diào)pH至7.2。上述培養(yǎng)基若制備固體培養(yǎng)基，加入14 g/L的瓊脂粉即可。

1.1.3 主要試劑和儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒和購自天根生化科技有限公司，PCR擴增和克隆相關(guān)試劑購自大連寶生物有限公司（TaKaRa），引物由上海英濰捷基公司合成，測序服務(wù)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)分別為Bio-Rad PCR儀和上海Tocan360凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 供試土壤理化性質(zhì)的測定 將新鮮土樣進行烘干、過篩、消化（1∶1的HNO3-H2SO4）處理，用火焰原子吸收分光光度法［19］測定供試土壤中的重金屬含量。用總有機碳分析儀（TOC-VE，Shimadzu，日本）檢測有機碳含量；而總氮和磷的含量用傅里葉變換近紅外光譜儀（NIRLabN-200，BUCHI，瑞士）即可測得。

1.2.2 土壤耐砷菌株的分離和純化 取1 g新鮮土樣溶于99 mL無菌水中，錐形瓶中加入10粒左右的玻璃珠，150 r/min，28℃振蕩培養(yǎng)30 min。將土壤懸液連續(xù)稀釋至濃度10-3，10-4和10-5，然后取0.1 mL稀釋液涂布于含有40 mmol/L Na2HAsO4·7H2O的CDM平板上，28℃倒置培養(yǎng)3-7 d后劃線分離。為了進一步篩選出對砷具有較高耐受性的菌株，分別用含不同梯度Na2HAsO4·7H2O（65、130和260 mmol/L）的CDM固體培養(yǎng)基對初篩分離的菌株進一步分離培養(yǎng)，純化。所有實驗重復(fù)3次。

1.2.3 對砷和其他重金屬耐受性檢測 對篩選出來的耐砷能力較強的菌株進行高濃度砷和其他重金屬的耐受性檢測。將分離純化的菌株接種于分別含有400、600、800 mmol/L Na2HAsO4·7H2O和 5、10、20 mmol/L NaAsO2的CDM瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)3-7 d。對其他重金屬（鎘、汞、銅、鎳和鋇）的耐受性測定分別選用化合物Cd（NO3）2·4H2O、HgCl2、Cu（NO3）2·3H2O、NiCl2和BaCl2的濃度為1-20 mmol/L，共20個梯度，每兩個梯度間隔1 mmol/L，用平板劃線法將菌株接種于含有不同重金屬濃度的CDM固體培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)3-7 d。

1.2.4 耐砷菌株的鑒定和耐砷基因的檢測 采用16S rRNA基因的PCR擴增和測序分析法對篩選出來的耐砷細菌進行菌種鑒定。利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取耐砷菌株的基因組DNA，并以其作為模板，以27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1 492R（5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）［20］為引物進行50 μL 體系的PCR擴增。擴增程序：94℃變性4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，循環(huán)30次；72℃ 10 min。為了獲得幾乎全長的16S rRNA基因，將PCR擴增產(chǎn)物用DNA純化試劑盒（TaKaRa）進行純化，然后用切膠回收試劑盒（TaKaRa）回收純化DNA片段，并用pMD18-T克隆試劑盒（TaKaRa）將純化片段鏈接到pMD18-T載體中，10 μL的連接體系包含1 μL T4 DNA Ligase Buffer（10×），7.5 μL DNA，0.5 μL pMD-18T，1 μL T4 DNA 連接酶，16℃連接16 h，然后用氯化鈣法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞（購自天根生化科技有限公司）中，挑取單克隆進行菌落PCR檢測，篩選出陽性克隆，然后送到生工生物工程股份有限公司利用引物M13-47（5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'）/RV-M（5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'）進行測序。用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行拼接，將得到的序列提交到http://www.eztaxon-e.ezbiocloud. net/［21］進行序列分析，然后用MEGA 5.0［22］軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［23］。

對于砷耐受性相關(guān)基因（As3+氧化酶基因aioA、As5+還原酶基因arsC、外排基因arsB/ACR3(1)/ ACR3(2)、甲基化酶基因arsM）的檢測，我們分別選取了9對引物（表2）進行PCR擴增。25 μL PCR反應(yīng)體系包含 14.75 μL 2×Taq PCR Mix，上下游引物各0.2 mmol/L，25 ng DNA模板，克隆及測序方法同16S rRNA鑒定。

1.2.5 菌株氧化還原能力測定 采用砷鉬藍法［7］進行測定。其原理為五價砷與鉬酸銨作用生成砷鉬酸絡(luò)合物，然后被抗壞血酸還原成鉬藍，在沸水浴中顯色并在865 nm下吸收峰值達到最大。挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃，150r/min 培養(yǎng)24 h。將菌液4 750 × g 離心10 min，用PIPES（20 mmol/L，pH 7.0）緩沖液洗滌菌體兩次，懸浮于分別含有1 mmol/L NaHAsO2和1 mmol/L Na2HAsO4·7H2O的PIPES中，并調(diào)整菌液濃度至OD600= 1.0，28℃，150 r/min 培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48和72 h時取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，4 750 ×g離心10 min去沉淀，將上清用PIPES緩沖液稀釋10倍，用于測定As5+和As3+含量。具體測定方法：處理一：取300 μL稀釋后的上清液加入100 μL KIO3溶液（5 mmol/L KIO3溶于 50 mmol/L HCl），目的是將上清液中的As3+氧化成As5+；處理二：取300 μL稀釋后的上清液加入100 μL 25 mmol/L HCl，對樣品進行酸化。兩份樣品均25℃處理10 min，再分別加入600 μL鉬藍試劑（每升含有6 g鉬酸銨、10.8 g抗壞血酸、0.136 g酒石酸銻鉀、67.3 mL濃硫酸）立刻放入水浴鍋中，78℃處理10 min，然后冰浴5 min，用分光光度計在865 nm下測定其吸光度值。所有處理均進行3次重復(fù)。以砷（Na2HAsO4·7H2O）濃度（0、20、40、60、80和100 mmol/L）為橫坐標，吸光度OD865為縱坐標，繪制標準曲線。處理一和處理二分別測定的是樣品中總As和As5+濃度，而As3+的濃度則根據(jù)兩個處理的吸光度差值計算可得。

1.2.6 菌株產(chǎn)IAA能力測定 根據(jù)康貽軍等［29］的方法對砷氧還能力較強的菌株進行產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）能力定量測定。耐砷菌株產(chǎn)IAA濃度測定：用固體LB培養(yǎng)基活化耐砷菌株，然后接種于含有0.5 g/L色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min 28℃ 培養(yǎng)48 h。5 000×g 離心15 min取2 mL上清液于10 mL離心管中，再加入等體積的Salkowshi比色液（每升10. 8 mol /L H2SO4含4.5 g FeCl3），室溫避光放置30 min。根據(jù)混合液的顏色可初步判斷產(chǎn)IAA量（若菌株產(chǎn)IAA，混合液則顯示紅色）；然后用分光光度計測定OD530值，定量檢測IAA。以空白培養(yǎng)基作對照，重復(fù)3次。以純IAA濃度（0、20、40、60和80 μg/mL）為橫坐標，OD530為縱坐標作標準曲線。根據(jù)IAA標準曲線的OD530值計算菌液中IAA濃度。

表2 擴增與砷代謝相關(guān)基因所選用的引物

2 結(jié)果

2.1 抗砷菌株的分離和篩選

利用含有40 mmol/L Na2HAsO4·7H2O的CDM平板，從采集的土壤樣品中共初篩獲得152株耐砷細菌。然后用更高濃度的As5+對152株菌進行了進一步的篩選，在65、130和260 mmol/LNa2HAsO4·7H2O的CDM瓊脂培養(yǎng)基中分別篩選出了42、26和6株砷耐受性菌株（圖1）。

圖1 根據(jù)不同濃度的As5+篩選的菌株數(shù)量

2.2 菌株對砷和其他重金屬的耐受性測定

對篩選出的6株砷高耐受性菌株進行砷的最低抑菌濃度和耐其他重金屬性能的測定。從表3可以看出大多數(shù)菌株對As5+的耐受性在600 mmol/L以上，甚至高達800 mmol/L（Tw133和Tw222）；對As3+的耐受性除了Tw31（5 mmol/L）以外，也均在10 mmol/L以上。這些耐砷菌株還對多種重金屬具有耐受性，其中對鎳和銅耐受性較高，對汞和鋇產(chǎn)生中等程度的耐受性，而對低濃度的鎘較為敏感。

表3 菌株對砷及其他重金屬的耐受能力

2.3 菌株鑒定及相關(guān)耐砷基因檢測

根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明這6株耐砷菌株分屬于5個不同的屬：假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、芽孢桿菌屬、威廉氏菌屬和節(jié)細菌屬（圖2）。

利用9對引物檢測以上6株細菌的砷耐受性相關(guān)基因，結(jié)果（表4）顯示，4株耐砷菌株含有還原酶基因arsC，其中Tw133中arsC由引物對arsC4r/ arsC4f擴增得到，而其他三株菌Tw31、Sw149和Bw218均用amlt42f/amlt376r引物得到。Tw222菌株同時含有兩個外排基因arsB和ACR3（2），菌株Bw218僅擴增得到外排基因ACR3（2）。在這6株菌中均沒有擴增得到氧化酶基因和甲基化酶基因，并且在菌株Tw49中沒有檢測到任何耐砷基因。

表4 菌株含有的相關(guān)砷耐受性基因

2.4 菌株氧化還原能力測定

用砷鉬藍法對6株耐高濃度砷的細菌進行砷氧化還原能力測定。結(jié)果（圖3）顯示，這6株菌均表現(xiàn)出了不同程度的氧化還原能力，其中菌株Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222的氧化還原率明顯高于其他菌株。在72 h內(nèi)，Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222均可氧化17 %左右的As3+（圖3-A），并可還原大約35 %的As5+（圖3-B）。由于Bacillus sp. Tw133菌株在72 h時的還原率表現(xiàn)出明顯的增長趨勢，因此又對其進行了更細致地測定，結(jié)果表明Bacillus sp. Tw133在144 h還原率達到最大值48.66 %（圖3-C）。由此可見，Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222菌株在砷氧化還原方面表現(xiàn)出了較明顯的優(yōu)勢。

2.5 菌株產(chǎn)IAA能力測定

IAA是一種植物內(nèi)源激素，與植物的生長發(fā)育相關(guān)，一定濃度的IAA可以促進植物的生長。通過對優(yōu)勢菌株Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222進行產(chǎn)IAA能力的測定。如圖4所示，B管的紅色明顯比C深，根據(jù)顯色結(jié)果初步判斷，Bacillus sp. Tw133的產(chǎn)IAA能力比Pseudomonas sp. Tw222強。根據(jù)IAA標準曲線計算可得，Bacillus sp.Tw133可以產(chǎn)生高達42.86 μg/mL的IAA，明顯高于Pseudomonas sp. Tw222（24.36 μg/mL）。而由此可推斷該兩株菌對植物有一定的促生作用。

圖2 耐砷菌株與相關(guān)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，土壤砷污染問題越來越嚴重，其毒性對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生極大的威脅。面對這種日益嚴峻的土壤砷污染問題，迫切需要一種高效、經(jīng)濟、環(huán)保的方法進行修復(fù)。近幾年，越來越多的研究表明，自然界中的微生物在砷的遷移轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了重要作用［30］，因此通過細菌的代謝活動減少或去除砷污染受到了越來越多的關(guān)注。多種耐砷菌株的分離和鑒定有利于深入研究其代謝機制，從而促進砷污染的生物修復(fù)。

本研究從湖南省康家灣鉛鋅礦土壤中共篩選出152株菌，其中耐高濃度砷的菌株細菌共6株。16S rRNA序列分析顯示，這6株耐砷菌株屬于5個不同的種屬，分別為假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、芽孢桿菌屬、威廉氏菌屬和節(jié)細菌屬。其中蒼白桿菌屬［31］、芽孢桿菌屬［9］、節(jié)細菌屬［6］和假單胞菌屬［32］均有報道。目前關(guān)于威廉氏菌屬的砷耐受性尚未有文獻報道，因此該研究中獲得的Williamsia sp. Tw49豐富了耐砷細菌的資源。

從重金屬污染環(huán)境中分離得到的細菌普遍存在耐砷及其他重金屬的特性。有報道稱一些細菌對砷的耐受性分別可達10 mmol/L（As3+）和100 mmol/L（As5+）［33］，甚至在Paul等［8］的研究中發(fā)現(xiàn) Acinetobacter，Microbacterium，Pseudomonas和Rhizobium對砷酸鹽耐受性可高達600 mmol/L。而本研究篩選得到的6株菌均表現(xiàn)出了更大的砷耐受性，其中對As5+和As3+的最大耐受性分別為800 mmol/L（Bacillus sp. Tw133和 Pseudomonas sp. Tw222） 和20 mmol/L（Williamsia sp. Tw49和 Pseudomonas sp. Tw222），如此高的砷耐受性特征為今后研究該菌的砷代謝機制提供了理論支持，也為發(fā)現(xiàn)細菌中新的砷代謝機理提供了可能性。

為了適應(yīng)砷污染的環(huán)境，細菌形成了各種砷代謝機制，目前最常見的耐砷機理包括砷的氧化、還原、甲基化等［2］。通過耐砷基因檢測，其中5株耐砷細菌中含有至少一個與砷耐受性相關(guān)的基因。6株耐砷菌株均表現(xiàn)出了不同程度的氧化還原能力，尤其是Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222的氧化率達17 %左右，但是未檢測到砷氧化酶基因和甲基化酶基因，可能是在這些菌株中存在其他類型的砷氧化酶基因［34］和甲基化酶基因或者選用的引物不合適［35］。根據(jù)As5+還原能力檢測結(jié)果可知，耐砷菌株Bacillus sp. Tw133的還原率在144 h時達到最大值48.66 %，明顯高于耐砷菌株Enterobacter coacae sp. MC204（38.1 %）［7］，而且這與該菌株中檢測到砷還原酶基因（arsC）結(jié)果相符。盡管Williamsia sp. Tw49對砷表現(xiàn)出了較高的耐受性（As5+= 600 mmol/L，As3+= 10 mmol/L），但是用所選引物進行PCR擴增，沒有檢測到任何砷耐受性基因，推測該菌株可能存在未知的耐砷機制，有待于進一步深入研究。

圖3 耐砷菌株分別對As的氧化還原能力

圖4 菌株產(chǎn)IAA能力顯色結(jié)果

植物修復(fù)技術(shù)是指利用植物清除土壤中的污染物質(zhì)或使污染物質(zhì)無毒化的技術(shù)［36］，但是較高濃度的重金屬限制了一些耐重金屬植物的正常生長，而從污染地區(qū)分離到的一些細菌具有植物促生特性（PGP），如產(chǎn)IAA、ACC（1-氨基環(huán)丙烷羧酸）、鐵載體等［37］，可以促進植物對重金屬的吸收，因此利用微生物—植物協(xié)同作用對重金屬污染土壤進行修復(fù)也是一種較為理想的選擇。文一等［38］的研究表明，鏈霉菌 Streptomyces sp. 能夠促進砷超積累植物蜈蚣草對砷的進一步吸收。本研究中篩選出的耐砷菌株Bacillus sp. Tw133和 Pseudomonas sp. Tw222產(chǎn) IAA的量分別可達42.86 μg/mL和24.36 μg/mL，均高于植物根際促生菌Pseudomonas sp. WP6［29］產(chǎn)IAA的量20.92 μg/mL。初步表明這兩株優(yōu)勢菌株均具有明顯的促生能力，為植物—微生物聯(lián)合修復(fù)砷污染提供一定的理論依據(jù)。實驗后期將通過測序確定這兩株優(yōu)勢菌的耐砷基因簇，以便研究它們的耐砷機制，并用基因工程手段對基因簇進行改造，提高其代謝砷的能力，為砷污染的生物修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實驗從湖南康家灣鉛鋅礦區(qū)總共篩選出152株細菌菌株，其中6株耐砷菌株對As5+和As3+的耐受性分別可高達800 mmol/L和20 mmol/L，并且對其他重金屬也有不同程度的抗性。這6株砷高耐受性細菌屬于5個不同的屬，所含有的砷耐受性基因主要為還原酶基因（arsC）和外排基因（arsB、ACR3（2））。Bacillus sp. Tw133和Pseudomonas sp. Tw222對砷的氧化還原能力相對較高，尤其Bacillus sp. Tw133在144 h的As5+還原率最高可達48.66 %，并且兩株菌產(chǎn)IAA的量分別為42.86 μg/mL和24.36 μg/mL，表現(xiàn)出了較明顯的優(yōu)勢。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Isolation，Identification and Characterization of Arsenic-tolerant Bacteria from Lead-zinc Mine Tailing

WU Dan ZHANG Zhi-peng MA Yu-chao
（College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

The aim of this study is to isolate highly arsenic-tolerant bacterial strains from heavy metal contaminated soils from the Kangjiawan lead-zinc mine，Hunan Province. Serial dilution and plating method was used to isolate arsenic-tolerant bacteria，and the strains were identified by 16S rRNA sequence analysis. Then the detection of arsenic tolerance-related genes was carried out. The arsenic molybdenum blue experiment was conducted to evaluate arsenic oxidation-reduction ability of arsenic-tolerant bacteria. Furthermore，the indole acetic acid（IAA）produced by the dominant bacterial strains was quantitatively determined. A total of 152 arsenic-tolerant bacterial strains were isolated from soils samples，and six strains were resistant to As5+and As3+up to 800 mmol/L and 20 mmol/L，respectively. The six arsenictolerant bacterial strains belonged to five different genera，Pseudomonas，Ochrobactrum，Bacillus，Williamsia，and Arthrobacter. In arsenic tolerance-related gene detection experiments，arsenate reductase gene arsC existed in strains Tw31，Tw133，Sw149，and Tw222，and strains Bw218 and Tw222 contained arsenic ion efflux permease gene arsB/ACR3（2）. Within 72 h，the As3+oxidation rate and As5+reduction rate of strains Tw133 and Tw222 were higher than those of other strains，which were about 17 % and 35 %，respectively. In particular，strain Tw133 had an As5+reduction rate of 48.66 % at 144 h. Moreover，the synthetic quantities of IAA in the two strains were 42.86 μg/mL and 24.36 μg/mL，respectively. The isolated strains Tw133 and Tw222 showed obvious advantages in terms of arsenic tolerance，arsenic oxidationreduction capacity and IAA production，providing experimental materials for the further study of arsenic-tolerant mechanism in bacteria.

arsenic-tolerant bacteria；arsenic-tolerant gene；arsenic oxidation-reduction；IAA

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0983

2016-10-27

國家十二五科技支撐計劃（2012BAC09B03），國家自然科學(xué)基金項目（J1310005），北京市科技新星項目（2011033），中央高?；究蒲谢痦椖浚?016JX03）

吳丹，女，碩士研究生，研究方向：重金屬污染土壤中耐砷微生物；E-mail：wuzhdan@163.com

馬玉超，女，博士，副教授，研究方向：微生物資源開發(fā)與利用；E-mail：mayuchao@bjfu.edu.cn