郭曉丹娜 郭夏麗

（鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，鄭州 450001）

白腐真菌共培養(yǎng)對磺胺二甲基嘧啶降解的影響

郭曉丹娜 郭夏麗

（鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，鄭州 450001）

磺胺類抗生素是全國檢出頻率較高的一種抗菌藥物，目前對磺胺類抗生素的生物降解方面研究較少，而生物法具有無二次污染、綠色環(huán)保的優(yōu)點。因此本實驗對雜色云芝和黃孢原毛平革菌共培養(yǎng)降解磺胺二甲基嘧啶進行研究。采用高效液相色譜（HPLC）和紫外分光光度計分別分析抗生素的濃度與酶活。結(jié)果顯示，平板對峙實驗中兩菌種間菌絲呈僵持狀，種間區(qū)域漆酶酶活始終高于其他區(qū)域。兩種白腐真菌液體混配4 d時可以獲得具有較高漆酶酶活的粗酶液，該粗酶液在48 h內(nèi)對磺胺二甲基嘧啶的降解率為25.4%，明顯高于雜色云芝純培養(yǎng)粗酶液的降解率（9.6%）。在加入天然助氧劑和人工助氧劑2，2'-聯(lián)氨雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（簡稱ABTS）后，混配粗酶液的降解率分別增至49%和93.1%。種間作用可以通過增加漆酶酶活以及產(chǎn)生助氧劑提升抗生素降解率，因此，共培養(yǎng)的白腐真菌可以作為抗生素污染生物治理的主要手段之一。

白腐真菌；共培養(yǎng)；漆酶酶活；磺胺二甲基嘧啶；降解

近年來，藥物及個人護理品（Pharmaceutical and personal care products，PPCPs）作為一種新型污染物日益受到關(guān)注［1-3］。大多數(shù)磺胺類藥物是以母體和代謝中間產(chǎn)物的形式通過畜禽糞便和尿液排到體外，從而進入環(huán)境。有研究表明，在養(yǎng)殖廢水中，磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine，SM2）是最常見的抗生素之一，最高含量在23.8-685 μg/L之間［4］。而目前的技術(shù)并不能有效的去除環(huán)境中殘留的抗生素［5］，抗生素的污染對于人類健康和生態(tài)環(huán)境有著更加嚴重的潛在危害，因此備受關(guān)注。

白腐真菌主要是通過合成木質(zhì)素降解酶降解一些難以被傳統(tǒng)的生物方法處理的污染物質(zhì)，尤其是抗生素［6］。酶法降解抗生素具有酶易獲得、易保存，酶濃度不受菌體生長情況的約束，對環(huán)境無污染，過程控制簡單方便等優(yōu)點。目前對于白腐真菌降解抗生素的研究大多側(cè)重于單菌株的生物降解，本研究的目的主要是考察白腐真菌的種間相互作用對磺胺二甲基嘧啶生物降解的影響。已有研究表明，雜色云芝（Trametes versicolor，TV）是能產(chǎn)漆酶（Laccase，Lac）的白腐真菌［7］，而黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium，PC）是產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）和錳過氧化物酶（Mn-dependent peroxidase，MnP）的白腐真菌［8］。在該研究中，以這兩種菌為實驗菌種，探究它們的平板共培養(yǎng)和液體共培養(yǎng)對木質(zhì)素降解酶酶活的影響，以及對磺胺二甲基嘧啶酶降解的影響，為水體與土壤的抗生素污染的生物治理提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與菌種 磺胺二甲基嘧啶（≥99%）購買自美國Sigma公司；甲醇為色譜純（99.9%）購買自天津四友有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。實驗菌種為鄭州大學(xué)環(huán)境與生態(tài)實驗室4℃保存的雜色云芝和黃孢原毛平革菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH自然。

液體培養(yǎng)基［9］：馬鈴薯100 g，葡萄糖10 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.75 g，酵母浸粉5 mg，蒸餾水1 L，pH自然。

1.2 分析方法

磺胺二甲基嘧啶的測定：使用高效液相色譜（HPLC）分析。色譜柱：Agilent 5 TC-C18（5 μm，250×4.6 mm）；流動相：甲醇-二次水（體積比為40：60）；檢測波長為267 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量20 μL；柱溫30℃。利用標準曲線法對SM2進行分析測定。

漆酶活性的測定［10］：4 mL反應(yīng)混合物中含0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH4.5），0.5 mmol/L的ABTS和1 mL的粗酶液，恒溫水浴30℃反應(yīng)5 min，用分光光度計檢測420 nm處1 min內(nèi)吸光度值的變化，定義為1 min內(nèi)催化氧化1 μmol ABTS的酶量為1個酶活單位（U）。

錳過氧化物酶活性的測定［11］：5 mL反應(yīng)混合物中含100 mmol/L酒石酸-酒石酸鈉緩沖溶液（pH5.0），0.1 mmol/L硫酸錳，0.1 mmol/L過氧化氫和以及1 mL粗酶液，恒溫水浴30℃反應(yīng)5 min，用紫外分光光度計檢測238 nm處10 s內(nèi)吸光度值的變化定義為1 min內(nèi)氧化1 μmol Mn2+為Mn3+所需的酶量為1個酶活單位（U）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的平板共培養(yǎng)及漆酶的著色 平板共培養(yǎng)：將在PDA平板上生長7 d的兩種白腐真菌，各取直徑10 mm的新鮮菌絲塊接種至滅菌的PDA平板上，兩菌種菌塊之間間隔3 cm。為了確保菌絲在平板中間接觸，混配中生長較慢的雜色云芝先于黃孢原毛平革菌提前2 d接種。單菌種自我配對作為對照。在恒溫培養(yǎng)箱中30℃避光培養(yǎng)，定性觀察以及定量測定兩菌種菌絲接觸后7 d內(nèi)的漆酶活性變化。每個處理作3個平行。

漆酶的定性觀察：在共培養(yǎng)5 d的混配菌種和自我配對菌種的平板中間，滴加0.5 mmol/L ABTS，1 h之后觀察染色情況。

1.3.2 粗酶液的制備 平板共培養(yǎng)粗酶液的制備（圖1）：在菌絲相互作用區(qū)域和兩側(cè)單菌區(qū)域分別取4塊直徑10 mm的菌絲塊，將菌絲塊對半劈，放置10 mL比色管中，內(nèi)裝4 mL 10 mmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH5.0），4℃隔夜浸提，4 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，過濾液即為粗酶液。

液體培養(yǎng)基中粗酶液的制備：在250 mL三角瓶中，裝液量50 mL，1×105Pa滅菌30 min。雜色云芝先于黃孢原毛平革菌2 d接種，接種量各5 mL。在150 r/min，30℃下培養(yǎng)7 d，每天取樣。10 000 r/min，4℃離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，獲得粗酶液。單菌種作為對照。

1.3.3 SM2的酶解 在250 mL三角瓶中，加入10 mmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH5.0），反應(yīng)液總體積50 mL含一定濃度的SM2，5 mL粗酶液，加入ABTS的濃度為1 mmol/L（天然介導(dǎo)物為5 mL）。在150 r/min，30℃的條件下反應(yīng)48 h后，用HPLC測定SM2的剩余濃度。

圖1 共培養(yǎng)取樣示意圖

2 結(jié)果

2.1 兩種白腐真菌共培養(yǎng)對酶活的影響

在平板中滴加0.5 mol/L的ABTS，通過無色化合物ABTS在平板上呈現(xiàn)的顏色變化來觀察漆酶活性的大小。結(jié)果（圖2）顯示，在雜色云芝自配對的平板中菌絲邊緣出現(xiàn)一圈藍綠色，表明雜色云芝產(chǎn)生并分泌胞外漆酶。在黃孢原毛平革菌自配對的平板中，顏色未有任何變化，表明黃孢原毛平革菌未產(chǎn)漆酶。兩個自配對菌株的接觸區(qū)與各自的其他區(qū)相比，均未有顏色差異，而共培養(yǎng)菌種的菌絲接觸區(qū)則呈現(xiàn)紫色，共培養(yǎng)的雜色云芝側(cè)呈現(xiàn)藍綠色，黃孢原毛平革菌側(cè)未有任何顏色變化，表明兩菌種間存在相互作用并對雜色云芝分泌漆酶產(chǎn)生影響。

雜色云芝和黃孢原毛平革菌在共培養(yǎng)3 d后菌絲開始接觸并進入僵持狀（圖3）。通過檢測漆酶酶活發(fā)現(xiàn)，在不同的僵持階段，菌絲僵持區(qū)域的漆酶酶活始終高于其他區(qū)域，其漆酶酶活峰值出現(xiàn)在共培養(yǎng)的第5天，達到0.34 U/g。雜色云芝未接觸側(cè)的最高漆酶酶活出現(xiàn)在共培養(yǎng)第8天，酶活值為0.18 U/g。黃孢原毛平革菌未接觸區(qū)域則始終未檢測出漆酶酶活，表明黃孢原毛平革菌對雜色云芝產(chǎn)漆酶具有促進作用。

圖2 菌種共培養(yǎng)5 d的漆酶著色情況

圖3 共培養(yǎng)過程中平板不同區(qū)域漆酶活性的變化

將兩種菌進行液體共培養(yǎng)，以期獲得具有較高漆酶酶活的粗酶液。從圖4-A可以看出在整個培養(yǎng)過程中，兩菌種共培養(yǎng)的漆酶酶活始終高于雜色云芝單菌種的漆酶酶活，在共培養(yǎng)的第3天至第5天，漆酶酶活均處于較高范圍，在第4天，漆酶酶活最大，達到95 U/L，而單菌株雜色云芝最大漆酶酶活出現(xiàn)在第5天，為44.6 U/L。對于漆酶酶活，液體共培養(yǎng)的效果明顯好于平板共培養(yǎng)。對于錳過氧化物酶（圖4-B），共培養(yǎng)與黃孢原毛平革菌單培養(yǎng)的酶活峰值相同，而雜色云芝單菌株也產(chǎn)生錳過氧化物酶，因此，共培養(yǎng)的酶活峰值未出現(xiàn)1+1≥2的效果，但共培養(yǎng)酶活下降幅度明顯低于單菌株。而后，對液體培養(yǎng)基中錳含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中錳的含量很低，幾乎為零。

在酶活檢測過程中，發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有實驗條件下單菌株及其共培養(yǎng)均未產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶，表明菌株間的相互作用并不能增加各菌株的新酶活，只能影響各菌株現(xiàn)有酶活，并且酶的種類不同，其產(chǎn)生的影響效果也不相同，對于漆酶，有著明顯增加作用，而對于錳過氧化物酶，未有明顯促進作用。

圖4 兩菌株液體混配中酶活的變化

2.2 液體共培養(yǎng)產(chǎn)生的粗酶液對磺胺二甲基嘧啶的降解

在黃孢原毛平革菌的培養(yǎng)液中，未檢測出漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶，而檢測出錳過氧化物酶，不同培養(yǎng)時間產(chǎn)生的粗酶液對SM2均未有明顯降解，表明錳過氧化物酶對SM2的去除無影響。結(jié)果如圖5所示，在雜色云芝及其與黃孢原毛平革菌共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中均檢測出漆酶酶活，不同培養(yǎng)時間產(chǎn)生的粗酶液對SM2的降解率，與粗酶液中的漆酶活均呈現(xiàn)正相關(guān)性，隨著漆酶活性的增大，SM2的降解率增大，在共培養(yǎng)第4天漆酶酶活最高，制備的粗酶液對SM2的降解率最大，在雜色云芝單培養(yǎng)第5天漆酶酶活最高，制備的粗酶液對SM2的降解率也最大，隨著漆酶活性的降低，SM2的降解率也降低，表明漆酶參與了SM2的降解。

由混配菌種得到的粗酶液對SM2的降解能力高于單菌種，磺胺二甲基嘧啶為非酚類化合物，漆酶對它的降解需要介導(dǎo)物參與。種間相互作用下各菌種為了維持它們的生長狀況，抵御其他菌絲體的侵入，可能會產(chǎn)生更多的天然介導(dǎo)物。

圖5 不同培養(yǎng)時間產(chǎn)生的粗酶液對SM2的降解

為了驗證以上推測，將兩種菌共培養(yǎng)4 d時制備的粗酶液分成2份，其中1份作為粗酶液，另一份進行加熱處理，以使其中的酶失活，作為天然介導(dǎo)物，與加入ABTS進行比較，探究天然介導(dǎo)物對SM2酶解的影響。

由圖6可知，未加入介導(dǎo)物時，共培養(yǎng)和雜色云芝單培養(yǎng)的粗酶液對SM2的降解率分別為25.4%和9.6%，當加入天然介導(dǎo)物之后，兩種粗酶液對SM2的降解率分別增至49%和24%，說明共培養(yǎng)中產(chǎn)生的某些代謝物可以作為漆酶的天然介導(dǎo)物。加入ABTS后，共培養(yǎng)和雜色云芝單培養(yǎng)的粗酶液對SM2的降解率顯著增加，分別為93.1%和88.0%，推測ABTS介導(dǎo)物所涉及的氧化機制比天然介導(dǎo)物更適宜于SM2的酶解。黃孢原毛平革菌單培養(yǎng)的粗酶液對SM2的降解無顯著作用影響。

圖6 不同介導(dǎo)物對粗酶液降解SM2的影響

3 討論

種間的拮抗作用會導(dǎo)致兩菌種相互作用區(qū)域受到脅迫，從而會積累大量的活性氧和過氧化氫，所以漆酶的產(chǎn)量會增加。白腐真菌能向胞外分泌降解木質(zhì)素的酶，生境重疊或部分重疊的真菌間存在空間和營養(yǎng)的競爭［12］。從菌落形態(tài)看，共培養(yǎng)的雜色云芝邊緣菌絲發(fā)生卷曲纏繞而緊密以對抗快速生長的黃孢原毛平革菌的空間競爭，而自配對的雜色云芝接觸區(qū)菌絲未發(fā)生明顯的形態(tài)變化；從生化角度看，共培養(yǎng)的漆酶酶活明顯高于單菌株雜色云芝的漆酶酶活。表明雜色云芝菌絲內(nèi)存在能夠識別異己并排他的防御系統(tǒng)，而該防御系統(tǒng)被黃孢原毛平革菌的競爭所激活，其中漆酶酶活的增加可能是該防御系統(tǒng)發(fā)揮的部分作用［13］。

漆酶是多銅氧化酶中的一種含銅的糖蛋白氧化酶，能催化多元酚及其衍生物的氧化并同時還原氧分子為水。漆酶的氧化還原電勢較低（300-800 mV）［14］，一些低分子量化合物在漆酶作用下可形成活性高的中間體，這些活性中間體可以氧化非酚類化合物，使漆酶可氧化的底物進一步擴大［15］，將這類在漆酶催化中起氧化助劑的低分子量化合物稱為介導(dǎo)物。目前對漆酶介導(dǎo)物的研究大多針對于人工合成介導(dǎo)物，對于天然介導(dǎo)物研究較少。介導(dǎo)物的助氧化機制大致有3種：（1）ABTS介導(dǎo)物的傳遞電子機制；（2）含N-OH基團的介導(dǎo)物及紫尿酸的傳遞羥基自由基機制；（3）2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧（TEMPO）介導(dǎo)物的離子氧化機制。

錳過氧化物酶是一種含鐵血紅素的糖基化過氧化物酶，當H2O2和Mn2+都存在時，錳過氧化物酶可以氧化分解芳香環(huán)多聚體及異生物質(zhì)［16］。有研究表明，當Mn2+濃度在適量的范圍內(nèi)，菌體生長較好，錳過氧化物酶酶活有明顯增加，但Mn2+濃度過大時反而會減少其產(chǎn)量［17］。Bonnarrme等［18］發(fā)現(xiàn)，在不含Mn2+的培養(yǎng)液中能夠檢測到極低的錳過氧化物酶酶活，Mn2+在0.32-39.8 mg/L中錳過氧化物酶酶活會隨之增加。因此當兩菌種共培養(yǎng)后，由于Mn2+濃度過低，導(dǎo)致錳過氧化物酶酶活并未有增加，共培養(yǎng)的酶活峰值滯后于單菌株的酶活峰值的原因可能是因為種間真菌的相互作用。

對于人工介導(dǎo)物，一般是一些小分子化合物，如ABTS，1-羥基-苯并-三氮唑（1-hydroxybenzotriazole，HBT），它們可以提高漆酶對于難降解化合物的氧化能力［19］。但由于它們可能存在的毒性以及價格昂貴，所以還是需要尋求更加良性的自然介質(zhì)［20］。已有的研究表明，白腐真菌產(chǎn)生和分泌的一些化合物可被用作天然介導(dǎo)物［21，22］，兩菌種間的相互作用可能導(dǎo)致菌種代謝產(chǎn)物發(fā)生了變化，從而生成天然介導(dǎo)物，在漆酶降解SM2中起到了促進作用［23］。

4 結(jié)論

在平板共培養(yǎng)中兩菌種間的菌絲形態(tài)不僅發(fā)生了變化，而且菌絲產(chǎn)生的漆酶酶活增大；雜色云芝與黃孢原毛平革菌液體共培養(yǎng)得到的粗酶液中的漆酶酶活高于單菌種雜色云芝，同時對SM2的降解能力提高。經(jīng)加熱處理的共培養(yǎng)液，可以提高粗酶液對SM2的降解效果，表明該兩種菌的共培養(yǎng)可以通過增加漆酶酶活以及產(chǎn)生天然介導(dǎo)物促進SM2的降解。

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（責任編輯 李楠）

Degradation of Sulfamethazine by Co-culturing of White-rot Fungi

GUO Xiaodanna GUO Xia-li
（College of Chemical Engineering and Energy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001）

Sulfonamides are a class of antimicrobial agents that have been detected in China at high-frequency. Biological method has the advantages of no secondary pollution and green environmental protection，but the researches on biodegradation of sulfonamides is still scarce. This experiment was to investigate degradation of sulfamethazine（SM2）by co-culturing Trametes versicolor and Phanerochaete chrysosporium. Antibiotic concentration and enzyme activity were determined using high performance liquid chromatography（HPLC）and UV spectrophotometer. A deadlock between the two mycelia was observed on plate confrontation method of an agar medium. The laccase activity at the interaction zone was higher than that at the other regions in the incubation of the two white-rot fungi on an agar plate. The crude enzyme preparation with high laccase concentration was obtained at the co-culturing time of 4 days in liquid medium. At 48 h after incubation，the degradation percentage of SM2 by crude enzyme solution from co-culturing was 25.4%，which was higher than that by crude enzyme preparations from Trametes versicolor（9.6%）. When natural mediators and artificial mediator 2，2’-azinobis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt）（ABTS）were added to the reaction mixture，the degradation percentages of SM2 by the crude enzyme from mixed culture significantly increased to 49% and 93.1%，respectively. The results showed that the interspecific interactions involving P. chrysosporium and T. versicolor enhanced the SM2 oxidation through increasing laccase activity and producing potential mediators. Therefore，the co-culturing of different white-rot fungi has potential for application in antibiotic-contaminated soils and wastes.

white-rot fungi；co-culture；laccase activity；sulfamethazine；degradation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0905

2016-09-26

國家水體污染控制與治理科技重大專項（2015ZX07204-002）

郭曉丹娜，女，碩士研究生，研究方向：環(huán)境生物技術(shù)；E-mail：nazi224@163.com

郭夏麗，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：環(huán)境生物技術(shù)與固廢資源化等；E-mail：guoxl@zzu.edu.cn