許超熊亞茹盧明倩廖威張?jiān)崎_黃庶識(shí)

（1. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530003；2. 廣西科學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007；3. 廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 530226）

一株具有褐藻膠降解能力的海洋細(xì)菌的篩選鑒定及其多糖利用能力研究

許超1熊亞茹1盧明倩2廖威3張?jiān)崎_1黃庶識(shí)2

（1. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530003；2. 廣西科學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007；3. 廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 530226）

旨在得到一株具有褐藻膠降解能力的菌株。利用海藻酸鈉作為唯一碳源，從腐爛馬尾藻中篩選純化得到一株降解褐藻膠能力較強(qiáng)的海洋細(xì)菌，編號(hào)X511。根據(jù)形態(tài)觀察和理化指標(biāo)，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)鑒定該菌株為弧菌，命名Vibrio sp. X511。X511菌株的指數(shù)生長期5-16 h，適宜生長的鹽濃度為2%-6%（W/V）。能在以葡萄糖、甘露醇、淀粉等為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。4%-6%（W/V）的鹽濃度、海帶粉、昆布多糖能延長該菌株的生長穩(wěn)定期。該菌株在篩選培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24 h胞內(nèi)褐藻膠裂解酶粗酶活力達(dá)到12.68±0.13 U/mL；提取X511的褐藻膠裂解酶粗酶，分別對(duì)海藻酸鈉、聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸三種多糖的酶解能力依次為：海藻酸鈉＞聚甘露糖醛酸＞聚古羅糖醛酸。薄層層析（TLC）結(jié)果顯示，該菌株胞內(nèi)酶降解海藻酸鈉的產(chǎn)物為三糖。結(jié)果表明，X511是一株鹽耐受性較強(qiáng)、生長周期較短且能同時(shí)以海藻酸鈉、聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸為碳源生長的海洋細(xì)菌。

褐藻膠；篩選；鑒定；鹽耐受性；多糖利用

從第一次工業(yè)革命開始，支撐著世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展和進(jìn)步的主要能源是石油和煤炭等化石燃料資源。隨著經(jīng)濟(jì)規(guī)模變大，全球?qū)τ谀茉吹男枨罅恳苍诓粩嘣黾樱剂峡萁叩膯栴}日益凸顯。按照已發(fā)現(xiàn)的礦產(chǎn)儲(chǔ)量計(jì)算，如若保持當(dāng)今的開采量，煤炭將在約100-150年、天然氣在50-60年、石油在30-40年消耗完［1］。

“可持續(xù)發(fā)展”是世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主題，大力發(fā)展可再生能源是達(dá)成這一目標(biāo)的主要保障。以乙醇為代表的可再生生物質(zhì)能源能有效緩解能源危機(jī)，具有較好的應(yīng)用前景。近年來，以豐富的海洋藻類資源作為原材料迅速發(fā)展的第三代生物乙醇技術(shù)，引起了能源領(lǐng)域的廣泛關(guān)注［2］。據(jù)理論推測，僅需利用我國海洋面積的1%種植大型海藻就能生產(chǎn)1.3億t乙醇，能代替市場20%的石油需求，二氧化碳排放量可降低5.5%［3］。我國生物質(zhì)能源的開發(fā)政策是“不與人爭糧，不與糧爭地”［4］，利用大型藻類發(fā)展生物質(zhì)能源，符合我國國情，應(yīng)用潛力大，可以較好地滿足我國能源可持續(xù)發(fā)展的需求。

在地球上的大分子多糖中，褐藻膠的總量僅次于纖維素，是海藻最主要的組成成分。褐藻膠是一種高分子聚合物，通過1-4糖苷鍵連接β-D甘露糖醛酸（β-D-mannuronic）和α-L古羅糖醛酸（α-L-guluronic）單體而成，褐藻細(xì)胞壁是其主要存在部位［5］。利用褐藻膠裂解酶處理海藻酸可得到單糖，通過特定微生物進(jìn)行發(fā)酵可將單糖轉(zhuǎn)化為生物乙醇。因此，利用微生物技術(shù)高效地將海藻酸轉(zhuǎn)化為燃料乙醇，是得到生物質(zhì)能源的一條重要途徑，而如何獲得高活性褐藻膠裂解酶，將海藻酸高效轉(zhuǎn)化為燃料乙醇是該途徑的關(guān)鍵［2］。褐藻膠裂解酶的主要海洋或者陸地微生物來源包括假交替單胞（Pseudoalteromonas）［6］、弧菌（Vibrio）［7］、黃桿菌（Flavobacterium）［8］、芽胞桿菌（Bacillus）［9］、鏈霉菌（Streptomyces）［10］等。

本研究利用海藻酸鈉作為篩選培養(yǎng)基的唯一碳源，經(jīng)過多次富集和純化，從腐爛的馬尾藻中篩選得到一株高產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株X511，通過形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)考察和16S rDNA基因序列分析對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，并研究其生長特性、鹽耐受性及底物特異，旨為豐富對(duì)褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌菌株的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 分離菌種的樣本采自廣西北海潿洲島周邊海域生長的馬尾藻。

1.1.2 主要試劑及儀器 臺(tái)式冷凍離心機(jī)購自德國Hitachi科學(xué)儀器公司；雙光束紫外可見分光光度儀（TU-1901）購自北京普析通用儀器有限公司；PCR儀購自德國Biometra公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司；細(xì)菌總DNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；Silica gel 60 TLC鋁板購自德國merk集團(tuán)；海藻酸鈉購自阿拉丁試劑公司；硫酸鎂、甘露糖等購自天津博迪化工股份有限公司；氯代十六烷基吡啶購自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；聚甘露糖醛酸、聚古羅糖醛酸等由國家海洋藥物工程技術(shù)研究中心贈(zèng)送。

1.1.3 培養(yǎng)基 富集和篩選培養(yǎng)基：海藻酸鈉6 g，NaCl 15 g，硫酸銨5 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂1 g，硫酸亞鐵0.001 g，加水定容到1 L，pH7.5，121℃滅菌20 min。

鹽耐受性培養(yǎng)基：在篩選培養(yǎng)基中加入終濃度為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%和9%，10% NaCl（W/V）配制，pH 7.5，121℃滅菌20 min。

固體平板篩選培養(yǎng)基在富集和篩選培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加1.5%瓊脂，發(fā)酵培養(yǎng)基與篩選培養(yǎng)基相同。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選與純化 將馬尾藻樣品與2%（W/V）的NaCl水溶液混合均勻，室溫（20℃左右）放置至樣品發(fā)生腐爛。取10 mL腐爛樣品上清于90 mL 2%（W/V）的NaCl溶液中混勻，吸2 mL接種于富集培養(yǎng)基中，30℃搖瓶富集培養(yǎng)3 d，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。將富集的菌液梯度稀釋涂平板，30℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察平板上的菌落形態(tài)，挑取生長狀況較好的單菌落平板劃線，進(jìn)一步純化，利用10%（W/V）氯代十六烷基吡啶對(duì)已純化的菌落染色，挑取水解圈與菌落直徑比最大的菌株，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株生長曲線和酶活力測定 生長曲線的繪制：用接種環(huán)挑取一環(huán)菌種接至培養(yǎng)基中過夜活化后轉(zhuǎn)至50 mL/250 mL富集培養(yǎng)基，30℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，每隔4 h取樣一次，稀釋至合適濃度，測600 nm光吸收值，作生長曲線；8 000 r/min離心30 min，收集菌體，破胞，測定胞內(nèi)酶酶活力曲線。 酶活測定：胞內(nèi)酶粗酶。根據(jù)產(chǎn)酶曲線，取5 mL培養(yǎng)24 h的菌液，8 000 r/min 離心 30 min，收集菌體，加入10 mL 0.02 mol/L的PBS緩沖液重懸浮，8 000 r/min 離心 15 min，重復(fù)3次洗凈培養(yǎng)基，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)破胞20 min，將破胞液8 000 r/min 離心 20 min，取上清，用于胞內(nèi)酶活測定，上述操作均在4℃條件下進(jìn)行。相對(duì)酶活力測定：參照 Preiss法［11］，取0.5 mL胞內(nèi)粗酶加入到1.5 mL 0.2%（W/V）海藻酸鈉底物中，30℃水浴酶解30 min，沸水浴5 min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，測定235 nm光吸收值。定義光吸收值每分鐘增加0.01為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.3 菌株鑒定 菌株X511的菌落形態(tài)觀察。將已純化的菌株劃線至篩選培養(yǎng)基，恒溫（30℃）培養(yǎng)48 h，觀察單菌落的形態(tài)特征，采用革蘭氏法染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察單個(gè)菌體細(xì)胞形態(tài)并拍照。

生理生化相關(guān)、糖類發(fā)酵指標(biāo)以及產(chǎn)酶能力指標(biāo)送科標(biāo)技術(shù)（青島）研發(fā)中心測試。

耐鹽性生長特性測定。按2%（V/V）的接種量將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的種子液接種至不同濃度的鹽耐受性培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min條件下震蕩培養(yǎng)24 h，測定生物量和酶活性。

菌株的16S rDNA基因鑒定。挑取純化的菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取基因組 DNA。16S rDNA引物為27 f（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'） 和 1 492r（5'-GGTTAC-CTTGTTACGACTT-3'）。回收PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增片段送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。測序結(jié)果的16S rDNA基因序列輸入美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST在線分析，下載同屬代表種的16S rDNA序列，將結(jié)果輸入MEGA6.0軟件中，進(jìn)行完全序列比對(duì)切割后，以Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株X511胞內(nèi)酶底物特異性分析 底物專一性。分別取0.5 mL胞內(nèi)粗酶至1.5 mL 1%海藻酸鈉、1.5 mL 1%聚甘露糖醛酸和1.5 mL 1%聚古羅糖醛酸溶液中，30℃水浴酶解0.5 h，沸水浴5 min終止反應(yīng)，測定235 nm光吸收值。薄層層析法（TLC）分析胞內(nèi)酶酶解產(chǎn)物。用pH為7.5的Tris-HCl緩沖液配制10 mg/mL海藻酸鈉底物溶液，取0.5 mL胞內(nèi)酶粗酶加至1.5 mL的海藻酸鈉底物溶液中，30℃水浴1 h，沸水浴5 min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，12 000 r/min離心5 min后取3 μL上清，作為酶解上樣液，分兩次點(diǎn)樣于TLC鋁板上，80℃烘干后，在4℃條件下進(jìn)行Silica gel 60 TLC分析。展開劑各成分的比例為正丁醇∶乙酸∶水= 3∶2∶2；取10 mL濃硫酸加入到90 mL無水乙醇中，混勻，作為顯色劑。待樣品展開后，晾干硅膠鋁板，用顯色劑噴霧染色，110℃烘10 min顯色。

1.2.5 菌株X511的多糖利用能力 按2%（V/V）的接種量將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的種子液分別接至50 mL以海藻酸鈉、海帶粉、可溶性淀粉、D-木糖、褐藻膠、昆布多糖等多糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)（4℃，200 r/min），每隔1 d取樣，測OD600值。

2 結(jié)果

2.1 褐藻膠裂解酶產(chǎn)生菌的篩選

經(jīng)富集培養(yǎng)、篩選和純化，自腐爛的馬尾藻中共篩選得到15株具有褐藻膠降解能力且能在平板上形成水解圈的菌株。將篩選到的菌株進(jìn)行平板復(fù)篩，用10%（W/V）的氯代十六烷基吡啶染色。結(jié)果表明，菌株X511周圍出現(xiàn)大于菌落自身直徑3倍的水解圈。經(jīng)過5代遺傳穩(wěn)定性培養(yǎng)，選擇產(chǎn)酶能力穩(wěn)定的菌株作為出發(fā)菌株進(jìn)一步研究。菌株X511能同時(shí)產(chǎn)生胞內(nèi)酶和胞外酶，其中胞外酶活力為5.037±0.15 U/mL，胞內(nèi)酶活力為12.68±0.13 U/mL，故選用該菌株所產(chǎn)生的胞內(nèi)酶作進(jìn)一步研究。菌株X511在以海藻酸鈉為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中的生長曲線和產(chǎn)胞內(nèi)酶曲線，如圖1。該菌株生長具有明顯的3個(gè)時(shí)期，即延緩期（0-4 h），對(duì)數(shù)期（5-16 h），穩(wěn)定期（16-100 h），在接種至新鮮培養(yǎng)基的前24 h，其胞內(nèi)酶活隨著時(shí)間的增加而上升，在培養(yǎng)至24 h時(shí)，該菌株的胞內(nèi)酶活達(dá)到最大，隨后發(fā)生較明顯的下降，推測與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的消耗和菌株自身的老化有關(guān)。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 菌株X511菌落形態(tài)以及細(xì)胞形態(tài)特征如圖2-A所示，菌株在固體篩選平板上能形成規(guī)則的圓形菌落，生長時(shí)間超過48 h后，菌落由乳白色變?yōu)榈S色，中間凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊，易挑取。菌株經(jīng)革蘭氏染色后光學(xué)顯微鏡觀察，該菌株為革蘭氏陰性菌，菌體呈弧形，未發(fā)現(xiàn)芽孢存在（圖2-B）。

圖1 菌株X511在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長曲線和產(chǎn)胞內(nèi)酶曲線

圖2 菌株X511的菌落及菌體形態(tài)觀察和革蘭氏染色結(jié)果

2.2.2 生理生化及不同鹽濃度生長特性 菌株X511能利用蔗糖、D-海藻糖、D-葡萄糖、D-甘露醇、甘露糖，葡萄糖作為碳源生長，不能利用D-塔格糖、古老糖、D-纖維二糖、D-山梨醇和側(cè)金盞花醇、L-阿拉伯醇和5-酮-葡萄糖苷（表1）。在菌株的生長過程中，能檢出β-N-乙酰葡萄糖苷酶、氨基乙酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、吡咯烷基芳胺酶和酪氨酸芳胺酶等5種酶的活性（表2）。

表1 菌株X511對(duì)不同碳源的利用情況

表2 菌株X511產(chǎn)酶情況

耐鹽性結(jié)果（圖3）顯示，菌株X511無法在不含NaCl的培養(yǎng)基中生長；當(dāng)培養(yǎng)液中的NaCl濃度為2%（W/V）和4%（W/V）時(shí)，菌株在不到1 h內(nèi)達(dá)到最大生物量；當(dāng)培養(yǎng)基中的NaCl濃度為6%（W/V）和8%（W/V）時(shí)，菌株生長達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間延后，生物量積累速度相對(duì)緩慢，隨著NaCl濃度加大，菌株達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)間越長，總生物量越低；當(dāng)培養(yǎng)液中的NaCl濃度為10%（W/V）時(shí)，菌株基本不能生長。

圖3 NaCl濃度對(duì)菌株X511生長的影響

2.2.3 16S rDNA測序分析 利用16S rDNA通用引物對(duì)菌株X511擴(kuò)增，得到的目的片段長度為1 570 bp，其中（G+C）含量為56%。利用NCBI上的BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)，菌株X511與弧菌屬的多種菌株相似性為99%，同時(shí)結(jié)合菌株的形態(tài)特征和生理生化特征，鑒定其為弧菌屬菌株，并命名為Vibrio sp. X511，系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

2.2.4 菌株X511胞內(nèi)酶底物特異性分析 菌株X511胞內(nèi)酶粗酶分別降解海藻酸鈉、聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸，其對(duì)不同底物的利用能力如圖5所示。菌株X511中的胞內(nèi)酶粗酶液能同時(shí)降解海藻酸鈉、聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸，其中，該菌株利用海藻酸鈉的能力最強(qiáng)，利用聚甘露糖醛酸能力次之，而利用聚古羅糖醛酸能力最弱。

菌株X511胞內(nèi)酶粗酶降解海藻酸鈉，離心，取上清進(jìn)行薄層層析（TLC），結(jié)果如圖6所示，該菌株胞內(nèi)酶降解海藻酸鈉后能得較高濃度的褐藻三糖產(chǎn)物。

2.2.5 菌株X511的多糖利用能力 菌株X511在不同多糖培養(yǎng)液中的菌體濃度，如圖7所示。菌株在以海藻酸鈉、海帶粉和昆布多糖為唯一碳源時(shí)，其生物量最高，可溶性淀粉次之。此外，菌株還能利用L-巖藻糖、褐藻膠、褐藻糖膠和海帶多糖，以羧甲基纖維素鈉和D-木糖為唯一碳源時(shí)，菌株不能生長。

3 討論

圖4 基于16S rDNA基因序列用Neighbor-Joining方法構(gòu)建的菌株X511與相關(guān)菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹

近年來，對(duì)海洋環(huán)境來源的產(chǎn)褐藻膠裂解酶微生物的篩選屢有報(bào)道，篩選材料多為腐爛海帶，海泥，海水以及海洋魚類的內(nèi)臟［12-15］等，本研究從腐爛的馬尾藻中篩選得到了一株產(chǎn)褐。藻膠裂解酶菌株，其對(duì)數(shù)生長期為5-16 h，在培養(yǎng)24 h時(shí)相對(duì)酶活力達(dá)到最大；繼續(xù)培養(yǎng)后菌株的生物總量沒有明顯變化，但隨著菌株的老化以及培養(yǎng)基的消耗，酶活力下降趨勢明顯，菌株的總生物量未發(fā)生明顯下降；該菌株的最大產(chǎn)褐藻膠裂解酶時(shí)間相對(duì)于達(dá)到最大生物量時(shí)間有一定的延遲，老化能迅速降低該菌株的產(chǎn)褐藻膠裂解酶能力。本研究從腐爛的馬尾藻中篩選得到了一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的海洋弧菌X511。菌株X511的對(duì)數(shù)生長期為5-16 h，在培養(yǎng)24 h時(shí)相對(duì)酶活力達(dá)到最大，與已報(bào)道的菌株相比［16，17］，該菌株的生長速度快，達(dá)到酶活最大所需時(shí)間短。在耐鹽性試驗(yàn)中，菌株X511在無氯化鈉的培養(yǎng)液中不能生長，一定的鹽濃度（2%-6%）能促進(jìn)該菌株的生長，并能延長其穩(wěn)定期；6%（W/V）的鹽濃度能減緩該菌株的生長速度，但并不影響其最大生物量；當(dāng)鹽濃度大于6%（W/V）時(shí)，菌株的生長速度和最大生物量均明顯降低；10%（W/V）的NaCl濃度能抑制該菌株的生長。與其他同類型產(chǎn)褐藻膠裂解酶的嗜鹽菌株相比［15］，該菌株的鹽耐受性較強(qiáng)。

圖5 菌株X511胞內(nèi)粗酶對(duì)海藻酸鈉、聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸利用能力

圖6 TLC分析菌株X511降解海藻酸鈉產(chǎn)物

圖7 菌株X511在不同多糖培養(yǎng)基中的菌體濃度

菌株X511能同時(shí)降解海藻酸鈉、聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸，推測該菌株可能產(chǎn)生了能分別降解不同的底物多種酶，也可能產(chǎn)生了一種雙功能酶，有待進(jìn)一步研究。目前研究的大多數(shù)酶對(duì)聚甘露糖醛酸片段有偏好性，只有少數(shù)對(duì)聚古羅糖醛酸片段有偏好性［18］。薄層層析分析該菌株胞內(nèi)酶水解海藻酸鈉后的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其水解產(chǎn)物主要的為褐藻膠三糖。李恒等［13］篩選得到一株鹽單胞菌halomonas sp.WF6，酶水解海藻酸鈉后的薄層層析產(chǎn)物主要為聚合度為二和三的寡糖。Wang等［19］篩選的希瓦氏菌屬Shewanella sp.Kz7能同時(shí)水解聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸得到單糖。據(jù)相關(guān)報(bào)道，以褐藻膠三糖為主要成分的褐藻膠寡糖能促進(jìn)大鼠腸道內(nèi)益生菌的增殖和抑制有害菌的生長，而且低分子量的褐藻膠寡糖具有很強(qiáng)的抗氧化活性，有望開發(fā)成一種新的食品添加劑和飼料添加劑［20］。

在多糖利用實(shí)驗(yàn)中，菌株X511能利用褐藻膠、海藻酸鈉、昆布多糖、海帶粉、可溶性淀粉、海帶多糖、褐藻糖膠和L-巖藻糖，不能利用羧甲基纖維素鈉和D-木糖。海帶的主要多糖成分褐藻膠和昆布多糖［21］，該菌株能分別利用這兩種多糖，為海帶的生物酶解提供了思路。此外，海帶粉和昆布多糖還能延長該菌株的穩(wěn)定期。

4 結(jié)論

自廣西潿洲島海域馬尾藻樣本中分離純化得到一株具有較強(qiáng)海藻酸鈉降解能力的海洋細(xì)菌，屬于革蘭氏陰性菌，鑒定為弧菌屬，編號(hào)X511。

菌株X511的生長速度快，16 h達(dá)到穩(wěn)定期，液體發(fā)酵24 h酶活達(dá)到最大，能利用的單糖有葡萄糖、D-海藻糖、D-葡萄糖、D-甘露醇、甘露糖和蔗糖，還能以多種多糖為唯一碳源，如褐藻膠、海藻酸鈉、昆布多糖、海帶粉、可溶性淀粉、海帶多糖、褐藻糖膠和L-巖藻糖，其中包括多種褐藻的多糖成分，對(duì)褐藻資源的開發(fā)和利用具有較高的價(jià)值。

菌株X511在無NaCl以及NaCl濃度大于10%（W/V）的培養(yǎng)液中不能生長，其適宜生長的鹽濃度為2%-6%（W/V），且一定濃度的NaCl、海帶粉和L-巖藻糖能延長該菌的平穩(wěn)期，屬于典型的海洋細(xì)菌。

菌株X511產(chǎn)生的酶同時(shí)對(duì)海藻酸鈉、聚甘露糖醛酸和聚古羅糖醛酸有酶解活性，其海藻酸鈉的酶降解產(chǎn)物主要為褐藻膠三糖。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Screening and Identification of a Marine Alginate-degrading Bacterium and the Utilization Capacity of Polysaccharide

XU Chao1XIONG Ya-ru1LU Ming-qian2LIAO Wei3ZHANG Yun-kai1HUANG Shu-shi2
（1. College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530003；2. Biophysics Laboratory of Guangxi Academy，Nanning 530007；3. Guangxi Vocational and Technical College，Nanning 530226）

The purpose of this work is to obtain a strain with an ability to degrade alginate. With sodium alginate as a sole carbon source，a strain of marine bacterium with the solid ability to degrade alginate was screened and purified from the cankered gulfweed，coded as X511. According to the morphological observation，physicochemical indexes and the techniques of molecular biology，the strain was identified as Vibrio，designated as Vibrio sp. X511. The exponential phase of strain X511 was about 5-16 h，and the suitable salinity for its growth was around 2%-6%（W/V）. It was capable to grow in the culture medium with a sole carbon source like glucose，mannitol，or starch，et al. Also，4%-6%（W/V）of the salinity，the kelp powder，and the laminarin extended its stationary phase. The activity of intracellular crude alginate lyase reached 12.68 ± 0.13 U/mL when the X511 fermented in the screening medium for 24 h. The intracellular crude alginate lyase was extracted，and its ability to digest alginate sodium，poly mannurono acid，and poly guluronic acid was measured as such order：alginate sodium ＞ poly mannurono acid ＞ poly guluronic acid. The results of the Thin Layer Chromatography（TLC）showed that the enzymatic degradation product of alginate sodium was trisaccharide. The above results indicate that the X511 is a marine strain with strong salt tolerance，short growth cycle，and it simultaneously utilizes the sodium alginate，poly mannurono acid，and poly-guluronic acid as its growing carbon resource.

alginate；screening；identification；salt tolerance；polysaccharides use

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.026

2016-09-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560017），廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2014GXNSFDA118012）

許超，男，碩士研究生，研究方向：海洋微生物；E-mail：18174662721@163.com

黃庶識(shí)，男，研究員，研究方向：海洋微生物；E-mail：hshushi@gxas.cn