孫雯鄭峰

（1. 揚(yáng)州科技學(xué)院，揚(yáng)州 225000；2. 中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，南京 210002）

S. suis 2 中國(guó)強(qiáng)毒株烯醇化酶 Enolase 基因的分子克隆及蛋白生物功能研究

孫雯1鄭峰2

（1. 揚(yáng)州科技學(xué)院，揚(yáng)州 225000；2. 中國(guó)人民解放軍南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所，南京 210002）

對(duì)中國(guó)強(qiáng)毒株 S. suis 2 烯醇化酶 Enolase 進(jìn)行克隆表達(dá)、定位分析、酶活性檢測(cè)及免疫相關(guān)功能研究，探討 Enolase在 S.suis 2 致病中的作用。基于 S. suis 2 05ZYH33 全基因組測(cè)序，對(duì) Enolase 編碼基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。構(gòu)建 pET32a∷eno 重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入 E. coli BL21 中誘導(dǎo)表達(dá)，利用 His-Beads 和 FPLC 純化后獲得 Enolase 重組蛋白。對(duì)純化后的 Enolase 進(jìn)行酶活性檢測(cè)，鑒定其糖代謝功能。然后利用 FCM 分析 Enolase 在 S. suis 2 的定位情況，最后通過外周血單核細(xì)胞 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) Enolase對(duì) PBMCs 活性的影響。同源性分析發(fā)現(xiàn) S. suis 2 eno 與多種細(xì)菌中 eno 高度同源。SignalP 和 TMHMM 分析發(fā)現(xiàn) Enolase 沒有信號(hào)肽也沒有跨膜區(qū)。eno 分子克隆并測(cè)序顯示長(zhǎng)度為 1 308 bp。重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)并純化后，獲得 75 kD 的 Enolase 蛋白。純化的重組 Enolase 有將 2-PEG 轉(zhuǎn)化成 PEP 的能力。FCM 分析表明 Enolase 也存在于細(xì)菌表面。MTT 測(cè)試表明 Enolase 能夠引發(fā) PBMCs 活性的下降。Enolase 不僅在 S.suis 2 體內(nèi)參與基礎(chǔ)代謝活動(dòng)，同時(shí)也存在于 S.suis 2 表面，可能通過破壞單核細(xì)胞參與感染過程。

豬鏈球菌2型（S. suis 2）；烯醇化酶；酶活性；流式細(xì)胞術(shù)；外周血單核細(xì)胞

豬鏈球菌2型（S. suis 2）是豬鏈球菌35種血清型中致病性最強(qiáng)、分布最廣的烈性人畜共患病原菌。近幾十年，S. suis 2 已在歐洲、美洲、亞洲的幾十個(gè)國(guó)家陸續(xù)引發(fā)了200多例散發(fā)的人群惡性感染事件［1］。尤其在2005年的中國(guó)四川省人群中暴發(fā)了規(guī)模巨大的 S. suis 2 疫情，大量患者出現(xiàn)了鏈球菌高侵襲、深部組織感染的罕見毒性休克綜合征（STSS），病死率高達(dá) 62%-82%［2］。北京中科院通過流行病學(xué)調(diào)查、動(dòng)物模型、多重 PCR 及基因生物信息學(xué)分析等方法，確認(rèn)了 S. suis 2 是四川省豬鏈疫情暴發(fā)和 STSS 出現(xiàn)的原因［3］。

大量研究表明暴露在病原菌細(xì)胞壁外的蛋白不僅參與細(xì)菌的免疫防御機(jī)制，也涉及細(xì)菌侵染宿主過程中一系列環(huán)節(jié)，如黏附、侵襲、定植及穿梭等［4，5］。近年報(bào)道一些在細(xì)菌體內(nèi)參與基礎(chǔ)代謝的蛋白，大都缺乏信號(hào)肽序列和細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)，但也能出現(xiàn)在細(xì)胞表面［6，7］。烯醇化酶（Enolase，ENO）似乎就是如此，在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中是一個(gè)參與糖代謝的金屬酶，也能在許多病原菌胞壁外參與感染過程［10］。本研究在前期已完成 S. suis 2 05ZYH33（四川省資陽2005年疫區(qū)分離菌株）全基因組的測(cè)定，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了 CDS SSU1503 基因序列與多種細(xì)菌 Enolase 編碼基因高度同源，故推斷為Enolase 疑似編碼序列（eno），進(jìn)而本研究對(duì) eno 基因進(jìn)行序列信息分析和克隆表達(dá)，檢測(cè) eno 基因編碼蛋白 Enolase 在菌內(nèi)的酶活性和菌外的定位，并對(duì)蛋白引發(fā)的免疫抑制作用進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用實(shí)驗(yàn)材料及其來源如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 eno基因生物信息學(xué)分析 利用 BLAST（ExPASy提供）進(jìn)行 Enolase 蛋白質(zhì)序列相似度比對(duì)，在蛋白序列數(shù)據(jù)庫中利用 PSIBLAST 程序搜索序列顯著相似的 Enolase 同源序列。再利用 Clustal X 軟件開展多重序列比對(duì)以及分子遺傳分析軟件生成 Enolase 的系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用軟件 SignalP 4.1 和TMHMM 2.0 分別預(yù)測(cè) S. suis 2 05ZYH33 中 Enolase的信號(hào)肽及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 Enolase 分子克隆 根據(jù) S. suis 2 05ZYH33 Enolase 序列設(shè)計(jì)合成引物（DNAStar 軟件設(shè)計(jì)，上海芃碩生物科技有限公司合成），進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。上游引物為 5'-GCGGATCC ATGTCAATTATTACTG-3'（前端帶有 BamH I 切割位點(diǎn)）；下游引物為 5'-GC CTCGA GTATGGATTTACCTGTTA G-3'（前端帶有Xho I 切割位點(diǎn)）。PCR程序：95℃ 預(yù)變性 2 min；循環(huán)30次：94℃ 變性 40 s，55℃ 復(fù)性 35 s，72℃延伸 1 min；72℃ 延伸 7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳和試劑盒回收回收后與 pMD-18T 載體連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài) E. coli DH5α。菌液 PCR 陽性者提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。用 BamH I 和 Xho I 分別對(duì) pMD-18T∷eno 和 pET32a 進(jìn)行雙酶切，用 T4 DNA 連接酶連接酶切后的目的片段，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒 pET32a∷eno，再次轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài) E. coli DH5α，菌液 PCR 陽性者提取重組質(zhì)粒，單酶切（BamH I）和雙酶切（BamH I 和 Xho I）處理后，瓊脂糖電泳后經(jīng)凝膠成像儀鑒定陽性者由上海伯豪生物技術(shù)公司測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.3 Enolase 表達(dá)和純化 提取重組表達(dá)載體pET32a∷eno 轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài) E. coli BL21，IPTG（異丙基-β-D-半乳糖苷）誘導(dǎo)后，用無菌 PBS 重懸離心后菌體沉淀，進(jìn)行超聲裂解細(xì)菌，離心收集上清，經(jīng)12% SDS-PAGE電泳、染色和脫色后，鑒定Enolase是否表達(dá)。大量培養(yǎng)重組菌 E. coli BL21（含pET32a∷eno）并誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎菌液離心取上清與 His 標(biāo)簽純化樹脂孵育過夜。次日將孵育物裝進(jìn)層析柱中，PBS 平衡后，用5 mmol/L 咪唑洗脫非特異性蛋白，用 100 mmol/L 咪唑洗脫 Enolase 目的蛋白。目的蛋白經(jīng)快速蛋白液相層析（FPLC）法進(jìn)一步得到純化，再次用 SDS-PAGE 電泳分析。

1.2.4 Enolase 酶活性測(cè)定 酶催化體系為：重組Enolase（5 μg），2-PGE（2-磷酸甘油酸鹽，以 0.25-12 mmol/L 的濃度逐漸增加），HEPES（100 mmol/L，pH 7.0），MgCl2（10 mmol/L），KCl（7.7 mmol/L）。每個(gè)濃度 37℃ 條件下反應(yīng) 5 min，測(cè)定 OD240nm。以 2-PGE濃度為橫坐標(biāo)，以 OD 值為縱坐標(biāo)，繪出米氏方程曲線，再根據(jù) Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法計(jì)算 Enolase的米氏常數(shù) Km。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)定位分析 將培養(yǎng)的 05ZYH33 菌液調(diào)整到 108CFU/mL，取 1 mL 菌液離心后用 0.01 mol/L PBS 洗沉淀3次，并重懸于 100 μL PBS 中，細(xì)菌總數(shù)約為108個(gè)。設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入100倍稀釋的大鼠抗 Enolase 蛋白多抗血清（對(duì)照組只加入大鼠陰性血清），4℃ 孵育 1 h，離心后用0.01 mol/L PBS 洗沉淀3次再重懸于 100 μL PBS 中，加入50倍稀釋的 FITC-兔抗大鼠 IgG，4℃ 孵育 1 h，離心后用 PBS 洗滌沉淀4次并重懸，最后用 4% 多聚甲醛進(jìn)行固定。用熒光激活細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)檢測(cè)。

1.2.6 外周血單核細(xì)胞 MTT 測(cè)試 通過密度梯度離心法從健康人的全血中分離出外周血單核細(xì)胞（PBMCs），洗滌后，用細(xì)胞培養(yǎng)液 RPMI 1640（添加抗生素和 10% 胎牛血清）將 PBMCs 濃度調(diào)整到105/ mL，并鋪于96孔圓底組織培養(yǎng)板中（每孔 200 μL），細(xì)胞培養(yǎng)箱 37℃ 孵育，至細(xì)胞長(zhǎng)滿單層。設(shè)實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)濃度，每孔加入重組 Enolase 10 μg、5 μg和0.25 μg（100 μL，各10個(gè)復(fù)孔），陰性對(duì)照組只加入 RPMI 1640（100 μL，10個(gè)復(fù)孔），細(xì)胞培養(yǎng)箱 37℃ 孵育 72 h，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每孔分別加入 5 mg/mL噻唑藍(lán)溶液（MTT），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，酶標(biāo)儀 570 nm 處測(cè)定 OD值（計(jì)算復(fù)孔平均值）。

2 結(jié)果

圖1 S. suis 2 05ZYH33 Enolase蛋白進(jìn)化樹

2.1 eno基因生物信息學(xué)分析

圖2 S. suis 05ZYH33 Enolase與其他相似序列的比對(duì)

BLAST 比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，S. suis 2 05ZYH33 CDSSSU1503基因編碼序列與 S. pyogene、S. pneumoniae、S. sobrinu、S. agalactiae、S.mutans核酸序列相似性分別都達(dá)到 88% 以上，氨基酸序列則更加保守，相似性達(dá)到 91%-96% 之間，故將S.suis 2 05ZYH33中CDSSSU1503 基因序列推斷為 Enolase 基因疑似序列。分子遺傳軟件生成 S. suis 2 05ZYH33 Enolase 蛋白進(jìn)化樹（圖1，圖2）。

2.2 Enolase信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

SignalP 4.1 和 TMHMM 2.0 分析發(fā)現(xiàn) 05ZYH33 Enolase 既沒有信號(hào)肽序列（圖3-A），也沒有跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)（圖3-B）。

圖3 SignalP 4.1和TMHMM 2.0對(duì)Enolase信號(hào)肽（A）和跨膜區(qū)（B）的預(yù)測(cè)

2.3 eno基因分子克隆

重組載體 pMD18T∷eno 和 pET32a∷eno 經(jīng)單酶切（BamH I）和雙酶切（BamH I 和 Xho I）后，核酸凝膠電泳顯示（圖4） eno 疑似片段，生物公司測(cè)序后確定 eno 長(zhǎng) 1 308 bp。

2.4 Enolase表達(dá)及純化

重組菌 E. coli BL21（含 pET32a∷eno）誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，與蛋白標(biāo)記比對(duì)后顯示在 75 kD 處有一條明顯增多的蛋白條帶（圖5-A）。目的蛋白通過 Expasy 估算的分子量為54 kD，加上融合標(biāo)簽（Trx Tag+S Tag+His Tag）分子量約為21 kD，故認(rèn)為融合蛋白的分子量與預(yù)測(cè)一致。利用 FPLC 技術(shù)進(jìn)行蛋白純化，每個(gè)收集管經(jīng)電泳后顯示出特異條帶（圖5-B，5-C）。

圖4 質(zhì)粒pMD-18T∷eno（A）和質(zhì)粒pET32a∷eno（B）的酶切鑒定

2.5 Enolase酶活性測(cè)定

米氏方程曲線可以看出，在 Enolase 催化下，隨著底物 2-PEG 的增加，產(chǎn)物磷酸烯醇丙酮酸鹽（PEP）含量隨之增加（圖6-A），表明 Enolase 的確能夠?qū)?-PEG 轉(zhuǎn)化為 PEP。雙倒數(shù)作圖法得出，橫坐標(biāo)軸截距為-1/Km（1.4308），縱坐標(biāo)軸截距為1/Vmax（0.405 2）（圖6-B）。由此算出，Vmax=1/0.405 2，Km=1/1.430 8（即 0.7 mmol/L）。

2.6 Enolase在S. suis 2的表面分布

流式細(xì)胞術(shù)采集圖中，F(xiàn)ACS 前向角（FCS）表示 S. suis 2 05ZYH33 體積大小，側(cè)向角（SSC）表示 S. suis 2 05ZYH33 數(shù)量多少（圖7-A）。大鼠陰性血清標(biāo)記 FITC 峰圖顯示對(duì)照組熒光含量較低，為1.06%（圖7-B），大鼠抗 Enolase 血清標(biāo)記 FITC峰圖顯示實(shí)驗(yàn)組熒光含量較高，峰圖明顯右移，為4.33%（圖7-C）。表明本室制備的鼠抗 Enolase 能夠與 05ZYH33細(xì)菌表面的 Enolase 結(jié)合，驗(yàn)證了 S. suis 2 05ZYH33細(xì)菌表面確實(shí)存在 Enolase。

圖5 Enolase蛋白的SDS-PAG電泳和FPLC鑒定

2.7 外周血單核細(xì)胞MTT測(cè)試

電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不加 Enolase 的陰性對(duì)照組中 PBMCs 圓形、飽滿、透明、貼壁生長(zhǎng)（圖8-A），而加 Enolase 孵育的實(shí)驗(yàn)組中 PBMCs 數(shù)量明顯減少，脫落漂浮、透光性差（圖8-B）。酶標(biāo)儀 OD570nm結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組 OD 值明顯低于對(duì)照組（圖8-C），P＜0.05（實(shí)驗(yàn)組中Enolase不同濃度的OD值變化不大，未圖示），暗示 Enolase 與 PBMCs 活性之間存在聯(lián)系。

圖6 純化Enolase酶活測(cè)定

3 討論

本研究通過 BLAST 蛋白序列相似度比對(duì)、Clustal 多重序列比對(duì)及分子遺傳分析發(fā)現(xiàn)，S. suis 2 05ZYH33 CDS SSU1503基因序列及氨基酸序列與多種細(xì)菌中 Enolase 序列存在高同源性，故將S.suis 2 05ZYH33中 CDSSSU1503 基因序列推斷為 Enolase基因疑似序列，同時(shí)暗示 Enolase 基因編碼序列在進(jìn)化中十分保守［8］。本研究對(duì)2005年四川疫區(qū)分離獲得的強(qiáng)毒株 S. suis 2 05ZYH33 中 Enolase 編碼基因進(jìn)行分子克隆和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn) Enolase 以可溶形式存在于重組菌中，經(jīng) His 標(biāo)簽親和層析法和快速蛋白液相層析技術(shù)純化后，獲得了75 kD 的 Enolase重組蛋白，與預(yù)測(cè)相一致。酶催化實(shí)驗(yàn)顯示純化的重組 Enolase 具有酶活性，能將底物 2-PEG 轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物 PEP，說明 Enolase 在 S. suis 2 體內(nèi)確實(shí)能參與基礎(chǔ)糖分解代謝。研究資料顯示，Enolase 同時(shí)也能催化糖生成逆向反應(yīng)［9］。Enolase 有兩個(gè) Mg2+離子結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)結(jié)合一個(gè) Mg2+后能引起 Enolase 活性位點(diǎn)構(gòu)型變化從而有利于結(jié)合第2個(gè) Mg2+和底物［10，11］。生物信息學(xué)分析顯示，S. suis 2 Enolase 既沒有信號(hào)肽序列，也沒有細(xì)胞膜錨定結(jié)構(gòu)。然而，熒光激活細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)檢測(cè)結(jié)果卻顯示Enolase 確實(shí)在 S. suis 2 細(xì)胞壁表面存在。關(guān)于細(xì)胞質(zhì)中的 Enolase 是如何穿過細(xì)胞膜在細(xì)胞壁表面存在的機(jī)制尚未明確，可能 Enolase 是通過非共價(jià)鍵結(jié)合了其他細(xì)菌表面蛋白。細(xì)菌吸附宿主細(xì)胞是侵染致病的第一步，推測(cè) Enolase 確實(shí)可能參與了感染過程。

圖7 熒光激活細(xì)胞分揀器對(duì)S. suis 2 Enolase的胞外定位檢測(cè)

圖8 Enolase引起PBMCs凋亡

在金黃色葡萄球菌、鏈球菌（A、C、G 群）、淋病奈瑟菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌及伯氏疏螺旋體等多種病原菌細(xì)胞壁表面都發(fā)現(xiàn)存在 Enolase，促進(jìn)細(xì)菌穿越基底膜，參與感染過程［12-14］。研究發(fā)現(xiàn)，S. pyogenes 胞外的 Enolase 依靠 C 末端的賴氨酸殘基結(jié)合血纖溶酶原，賴氨酸基因敲除株明顯表現(xiàn)出侵襲細(xì)胞外基質(zhì)屏障能力的減弱［15］。S. mutans 胞外的 Enolase 能結(jié)合宿主口腔中的唾液粘液素 MG2，有助于細(xì)菌定植于口腔組織，并進(jìn)一步發(fā)生遷移［16］。近年來發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)組織、肌肉組織及腫瘤細(xì)胞和某些免疫細(xì)胞表面也存在 Enolase。當(dāng) S. suis 2 感染宿主時(shí)，宿主產(chǎn)生的抗細(xì)菌 Enolase 抗體也能夠結(jié)合自身的 Enolase，從而引發(fā)交叉反應(yīng)，導(dǎo)致很多自身免疫性疾病的發(fā)生［17］。如急性風(fēng)濕性發(fā)熱、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、子宮內(nèi)膜異位及免疫紊亂患者血清中都檢測(cè)出升高Enolase 抗體［18］。

單核細(xì)胞具有吞噬、清除損傷或衰老細(xì)胞、產(chǎn)生抗體等作用，能夠有效抵御或清除入侵的病原生物，是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分［19］。本研究發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞在 Enolase作用下，出現(xiàn)數(shù)量減少、脫落漂浮、透光性差等現(xiàn)象，表明細(xì)胞受到了損傷或發(fā)生了凋亡。MTT 比色法，是檢測(cè)細(xì)胞活性的常用技術(shù)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶（SDH）能將 MTT 還原成藍(lán)紫色結(jié)晶沉淀，死細(xì)胞則不能［20］，因此 MTT 結(jié)晶量越大，則 OD 值越大，表明細(xì)胞活性越強(qiáng)。外周血單核細(xì)胞 MTT 測(cè)試顯示 PBMCs 在 Enolase 作用下，OD 值明顯下降，表明 PBMCs 活細(xì)胞數(shù)量的減少。前期溶血空斑試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) Enolase 能夠引發(fā)小鼠體內(nèi)免疫抑制狀態(tài)出現(xiàn)［21］，此結(jié)果與溶血空斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。推測(cè)細(xì)菌表面Enolase 可能通過直接或間接損傷單核細(xì)胞或誘發(fā)單核細(xì)胞凋亡，從而影響單核細(xì)胞的免疫防御機(jī)制。

4 結(jié)論

同源性分析發(fā)現(xiàn) S. suis 2 05ZYH33 CDSSSU1503基因序列及氨基酸序列與多種細(xì)菌中 Enolase 序列高度同源，故推斷此序列為S. suis 2 05ZYH33 Enolase基因疑似序列。SignalP 和 TMHMM 分析發(fā)現(xiàn) Enolase沒有信號(hào)肽也沒有跨膜區(qū)。eno 分子克隆并測(cè)序顯示長(zhǎng)度為 1 308 bp，pET32a∷eno 重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)并純化后，獲得 75 kD 的 Enolase 蛋白。FCM定位分析顯示 Enolase 也存在于細(xì)菌表面。MTT 試驗(yàn)檢測(cè)表明 Enolase能夠引發(fā) PBMCs 活性的下降。

致謝：

本課題的實(shí)施得到了中國(guó)科學(xué)院微生物研究所高福實(shí)驗(yàn)室豬鏈球菌課題組的支持和幫助，在此表示衷心的感謝。

［1］Zhang YY, Ding DD, Liu ML, et al. Effect of the glycosyltransferases on the capsular polysaccharide synthesis of Streptococcus suis serotype 2［J］. Microbiological Research, 2016, 24（1）：185-189.

［2］Tang JQ, Wang CJ, Feng YJ, et al. Streptococcal toxic shock syndrome caused by Streptococcus suis serotype 2［J］. PLoS Med, 2006, 3（5）：151-155.

［3］Chen C, Tang JQ, Dong W, et al. A Glimpse of Streptococcal toxic shock syndrome from comparative genomics of S. suis 2 Chinese isolates［J］. PLoS ONE, 2007, 2（7）：5298-5305.

［4］Zhang CP, Zhang ZQ, Li S. Antimicrobial resistance profile and genotypic characteristics of Streptococcus suis capsular type 2 isolated from clinical carrier sows and diseased pigs in China［J］. BioMed Research International, 2015, 20（22）：3649-3657.

［5］Pian YY, Li XQ, Zheng YL, et al. Binding of human fibrinogen to MRP enhances Streptococcus suis survival in host blood in a αXβ2 integrin-dependent manner［J］. Scientific Reports, 2016, 6（4）：26966-26969.

［6］JF Mariscotti, JJ Quereda, MG Pucciarelli. Contribution of sortase A to the regulation of Listeria monocytogenes LPXTG s［J］. International Microbiology, 2012, 15（1）：43-51.

［7］ Michon C, Langella P, Eijsink VGH, et al. Display of recombinant proteins at the surface of lactic acid bacteria：strategies and applications［J］. Microbial Cell Factories, 2016, 15（1）：1-16.

［8］ Wongsawan K, Gottschalk M, Tharavichitkul P, et al. Serotype- and virulence-associated gene profile of Streptococcus suis isolates from pig carcasses in Chiang Mai Province, Northern Thailand［J］. Journal of Veterinary Medical Science, 2014, 77（2）：233-236.

［9］Wu CH, , Kuo YH, Hong RL, et al. α-Enolase-binding peptide enhances drug delivery efficiency and therapeutic efficacy against colorectal cancer［J］. Science Translational Medicine, 2015, 7（290）：1250-1268.

［10］Zhong Z, Peng N, Ying Q, et al. An electrochemical immunosensor for simultaneous multiplexed detection of neuron-specific enolase and pro-gastrin-releasing peptide using liposomes as enhancer［J］. Electrochimica Acta, 2011, 56（16）：5624-5629.

［11］ Guillou C, Derambure C, Fréret M, et al. Prophylactic injection of recombinant alpha-Enolase reduces arthritis severity in the collagen-induced arthritis mice model［J］. Plos One, 2014, 10（8）：4478-4488.

［12］ Ebner P, Prax M, Nega M, et al. Excretion of cytoplasmic proteins（ECP）in Staphylococcus aureus［J］. Molecular Microbiology, 2015, 97（4）：775-789.

［13］Wang J, Wang K, Chen D, et al. Cloning and characterization of surface-localized α-Enolase of Streptococcus iniae, an effective protective antigen in mice［J］. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16（7）：14490-14510.

［14］M Ween, J Ahern, A Carroll, et al. A small volume technique to examine and compare alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic cells and non typeable Haemophilus influenzae（NTHi）［J］. Journal of Immunological Methods, 2016, 429（11）：7-14.

［15］ Balhara V, Deshmukh SS, Kalman L, et al. The interaction of streptococcal enolase with canine plasminogen：the role of surfaces in complex formation［J］. PLoS One, 2014, 9（2）：88395-88402.

［16］ Mitsuhata C, Puteri MM, Ohara Y, et al. Possible involvement of enolase in fluoride resistance in Streptococcus mutans［J］. Pediatric Dental Journal, 2014, 24（1）：12-16.

［17］ Ge JP, Catt DM, Gregory RL, et al. Streptococcus mutans Surface α-Enolase Binds Salivary Mucin MG2 and human plasminogen［J］. Infection & Immunity, 2004, 72（11）：6748-6752.

［18］Patricia AF, Pancholi V, Marcelo MN. Antibodies to streptococcal surface enolase react with human α-enolase：implications in poststreptococcal sequelae［J］. The Journal of Infectious Diseases, 2000, 182（1）：1712-1721.

［19］ G Ahangari, SE Koochak, LM Amirabad, et al. Investigation of 5-HT2A gene expression in PBMCs of patients with allergic asthma［J］. Nature, 2015, 14（1）：529-532.

［20］ Nazarpour R, Zabihi E, Alijanpour E, et al. Optimization of human peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）cryopreservation［J］. International Journal of Molecular & Cellular, 2012, 1（2）：88-93.

［21］孫雯. 豬鏈球菌2型的表面蛋白烯醇化酶在細(xì)菌黏附和引發(fā)免疫下調(diào)中的作用［J］. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2010, 38（2）：28-31.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Molecular Cloning of Gene for Enolase in Highly Virulent Strains from Streptococcus suis serotype 2 and Its Protein Biological Function

SUN Wen1ZHENG Feng2
（1. Yangzhou College of Science and Technology，Yangzhou 225000；2. Institute of Military Medical Sciences，Nanjing Command，Chinese People’s Liberation Aarmy，Nanjing 210002）

To investigate the role of enolase in the pathogenesis of highly virulent strains from Streptococcus suis serotype 2，its molecular cloning，protein location analysis，enzymatic activity assay，and immune related function were studied. Based on the whole genome sequencing of S. suis 2 05ZYH33，bioinformatics of gene eno encoding enolase was analyzed. The recombinant expression plasmid pET30a∷eno was transformed into Escherichia coli BL21 competent cells，and the expression was induced. Recombinant protein enolase was obtained by the purification with His-Beads and FPLC. Then the enzyme activity of enolase was detected，and its basal metabolic function was identified. Further，F(xiàn)CM was used to analyze the localization of enolase in S. suis 2. Finally，the effect of enolase on the activity of peripheral blood monouclear cells（PBMCs）was detected by MTT test. Homology analysis showed a highly homologous of eno with that in many others. SignalP and TMHMM analysis revealed that enolase had neither signal peptide sequence nor transmembrane domain structure. Molecular cloning and sequencing illustrated that the eno fragment length was 1 308 bp. The 75 kD protein was acquired after the recombinant plasmid was induced to express and purification. Enzyme activity assay showed that the purified recombinant enolase had the ability to convert 2-PEG into PEP. FCM analysis demonstrated that enolase also existed on the surface of bacteria. The results of MTT test showed that enolase resulted in the decrease of PBMCs activity. In conclusion，enolase is not only involved in the activities of glucose metabolism in S. suis 2，but also exists on its surface，probably involving in the infection process by destroying the mononuclear cells.

Streptococcus suis serotype 2（S. suis 2）；enolase；hemolytic activity；flow cytometry；peripheral blood monouclear cells

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.029

2016-09-22

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31300119）

孫雯，碩士研究生， 研究方向：流行病學(xué)；E-mail：wen-sun@163.com

鄭峰，博士研究生，研究方向：流行病學(xué)；E-mail：zhengf82@gmail.com