毛挺挺， 鄭亞華， 方紅波， 謝魯吉， 張偉丹， 姜麗萍

(1寧波市醫(yī)療中心李惠利東部醫(yī)院， 浙江 寧波 325000； 2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院， 上海 200092)

Bcl-2和PCNA表達(dá)在大鼠成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用*

毛挺挺1， 鄭亞華1， 方紅波1， 謝魯吉1， 張偉丹1， 姜麗萍2△

(1寧波市醫(yī)療中心李惠利東部醫(yī)院， 浙江 寧波 325000；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院， 上海 200092)

目的： 探討B(tài)cl-2、PCNA等蛋白表達(dá)在成肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的意義。方法: 將對數(shù)生長期成肌細(xì)胞進(jìn)行分組，結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)預(yù)處理2 h及過氧化氫處理，分為正常對照(control)組、單純bFGF組、氧化應(yīng)激組(H2O2組)和干預(yù)組(bFGF+H2O2組)。免疫組化檢測Bcl-2和Bax陽性沉積顆粒；免疫熒光觀察成肌細(xì)胞形態(tài)及Bcl-2和Bax熒光表達(dá)；Western blot檢測Bcl-2、PCNA等蛋白表達(dá)情況。結(jié)果: 免疫熒光及免疫組化結(jié)果顯示，與氧化應(yīng)激組比較，干預(yù)組Bcl-2表達(dá)增加，Bax表達(dá)減少；Western blot顯示，干預(yù)組Bcl-2和PCNA水平增加，Bax水平降低。結(jié)論: 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠成肌細(xì)胞損傷參與肌細(xì)胞病理進(jìn)程。Bcl-2和PCNA表達(dá)上調(diào)可減輕成肌細(xì)胞損傷程度。

深部組織損傷； 氧化應(yīng)激； L6成肌細(xì)胞； 堿性成纖維細(xì)胞生長因子

以往壓瘡研究集中于局部皮損及破潰范圍，往往忽視皮膚完整性深部組織損傷(deep tissue injury，DTI)的發(fā)生。近年來研究顯示，壓瘡受累組織尤以肌層最易損傷[1]。缺血再灌注為DTI形成重要機(jī)制，大量氧自由基及肌細(xì)胞損傷等病理反應(yīng)集中于缺血再灌注過程之中，并在DTI惡化進(jìn)程中起到重要作用[2-3]。目前已有報(bào)道顯示，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)能夠有效緩解大鼠深部肌組織損傷[4]，然而尚未有研究闡明bFGF與壓瘡肌細(xì)胞氧化應(yīng)激間的關(guān)系。因此，本研究通過體外模擬壓瘡氧化應(yīng)激過程，檢測Bcl-2、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)等蛋白表達(dá)，探討bFGF具體作用，以期在細(xì)胞水平為壓瘡肌組織損傷防治提供一定思路。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠成肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，采用含1%青/鏈霉素及10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，待其生長至對數(shù)期時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rhbFGF)由溫州生物與天然藥物研究所提供；過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)購自Sigma；胎牛血清、胰蛋白酶、青/鏈霉素和DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為Gibco產(chǎn)品；Hoechst 33258購自碧云天生物科技有限公司；兔單克隆抗Bcl-2、Bax抗體，鼠單克隆抗PCNA、GAPDH抗體及實(shí)驗(yàn)中所用的 II 抗羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、羊抗兔IgG-HRP、驢抗兔IgG-FITC均由Santa Cruz提供。

2 主要方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞生長為指數(shù)增長期后，統(tǒng)一換液。根據(jù)有無H2O2及bFGF干預(yù)可分為4組：正常對照(control)組、單純bFGF組、氧化應(yīng)激組(H2O2組；H2O2濃度及作用時(shí)間的確定參照文獻(xiàn)研究方法及我們前期體外DTI細(xì)胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建過程[5-6])和干預(yù)組(bFGF+H2O2組；bFGF濃度綜合參考文獻(xiàn)[7-8]選擇)。正常對照組不做任何處理；單純bFGF組提前給予100 μg/L bFGF 2 h；氧化應(yīng)激組采用100 μmol/L H2O2培養(yǎng)基處理4 h；干預(yù)組給予100 μg/L bFGF預(yù)給2 h后，加入100 μmol/L H2O2繼續(xù)孵育4 h。

2.2 SABC免疫組化 采用SABC法，4%多聚甲醛固定，3% H2O2-甲醇溶液抑制內(nèi)源性過氧化物酶，5% BSA封閉30 min，Bax和Bcl-2的 I 抗?jié)舛染鶠?1∶200，常規(guī)設(shè)立陰性對照(用PBS代替 I 抗)，于4 ℃冰箱過夜。滴加1∶1 000稀釋的 II 抗，置于37 ℃恒溫箱孵育2 h。PBS洗去未結(jié)合抗體，DAB顯色，中性樹膠封片，陽性結(jié)果為棕黃色顆粒沉積。

2.3 Bcl-2和Bax免疫熒光染色 4%多聚甲醛4 ℃固定，Triton X-100靜置15 min后，5% BSA室溫封閉15 min，滴加1∶200稀釋的Bax I 抗，4 ℃過夜。PBS 洗去未結(jié)合抗體(5 min×3次)，避光滴加1∶300稀釋的熒光 II 抗，黑色濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 h。Hoechst 復(fù)染1 min，PBS清洗 5 min×3次，滴加抗熒光淬滅劑并封片，熒光顯微鏡下拍片。染色結(jié)果Hoechst為藍(lán)色，以此定位肌細(xì)胞核；FITC熒光 II抗呈綠色，標(biāo)記Bcl-2和Bax蛋白，隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野(×400)，采用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件，統(tǒng)計(jì)任意單位內(nèi)平均熒光強(qiáng)度。

2.4 Western blot 收集不同批次成肌細(xì)胞，加裂解液后刮取蛋白液，離心取上清，采用考馬斯亮藍(lán)測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE 分離蛋白后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1.5 h，TBST洗去脫脂奶粉(7 min×3次)，兔單克隆Bcl-2、Bax抗體及鼠單克隆PCNA抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜7 min×3次，HRP標(biāo)記IgG II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，最后加入BeyoECL Plus顯色液于凝膠成像儀器曝光。GAPDH作為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。運(yùn)用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行灰度分析，以相對值定量表達(dá)各蛋白。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫組織化學(xué)檢測各組成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示：Bcl-2和Bax免疫陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，主要位于胞漿。正常對照組及單純bFGF組成肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有大量Bcl-2陽性顆粒，少數(shù)細(xì)胞為Bax陽性表達(dá)；氧化應(yīng)激組Bcl-2陽性顆粒銳減，Bax陽性細(xì)胞數(shù)量增加；bFGF干預(yù)后，Bcl-2陽性細(xì)胞增多，Bax表達(dá)隨之減少，見圖1、表1。

2 成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax免疫熒光表達(dá)情況

正常成肌細(xì)胞形態(tài)為梭形或成纖維樣，細(xì)胞生長速度較快，Bax熒光強(qiáng)度低，Bcl-2熒光強(qiáng)。應(yīng)激組肌細(xì)胞Bax熒光表達(dá)呈強(qiáng)陽性，細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)收縮明顯，細(xì)胞突起變短或消失。bFGF干預(yù)后，成肌細(xì)胞Bax陽性蛋白表達(dá)顯著減少，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，見圖2、表2。

Figure 1.Bcl-2 and Bax expression in rat myoblasts detected by immunohistochemistry (×200).

圖1 各組成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白免疫組化結(jié)果

表1 各組成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax免疫組化結(jié)果

Table 1.The relative expression of Bcl-2 and Bax in rat myoblasts detected by immunohistochemistry (Mean±SD.n=3)

GroupBcl-2BaxControl1.00±0.041.00±0.13bFGF1.05±0.161.16±0.14H2O2 0.35±0.12** 2.27±0.23**bFGF+H2O20.86±0.05##1.14±0.10##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsH2O2.

3 Bcl-2、Bax和PCNA等蛋白的表達(dá)水平

正常對照組及單純bFGF組Bax蛋白呈現(xiàn)低水平表達(dá)，Bcl-2和PCNA蛋白水平較高。氧化應(yīng)激組成肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)顯著增加，同時(shí)PCNA和Bcl-2蛋白水平降低。給予bFGF干預(yù)后，Bcl-2和PCNA表達(dá)增加，Bax蛋白水平下調(diào)，見圖3、表3。

討 論

壓瘡深部組織損傷為壓瘡中組織嚴(yán)重?fù)p傷類型，其發(fā)生隱匿、后期極易進(jìn)展為難愈性創(chuàng)面。近年來研究顯示，缺血再灌注生成氧自由基致使肌組織繼發(fā)性損傷為DTI關(guān)鍵所在[9]。過氧化氫是機(jī)體細(xì)胞氧化應(yīng)激主要成分之一，目前已應(yīng)用于體外DTI相關(guān)研究[10-11]。本實(shí)驗(yàn)基于前期結(jié)果[5]，以100 μmol/L叔丁基過氧化氫作用4 h為氧化應(yīng)激組，在此基礎(chǔ)上探討bFGF對大鼠成肌細(xì)胞Bcl-2、PCNA等蛋白影響。

Figure 2.Bcl-2 and Bax expression in rat myoblasts detected by immunofluorescence (×400).

圖2 各組成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白免疫熒光檢測結(jié)果

表2 各組成肌細(xì)胞Bcl-2和Bax熒光表達(dá)情況

Table 2.The relative expression of Bcl-2 and Bax in rat myoblasts detected by immunofluorescence (Mean±SD.n=3)

GroupBcl-2BaxControl1.00±0.141.00±0.07bFGF0.97±0.031.07±0.06H2O20.40±0.04**1.51±0.16**bFGF+H2O20.70±0.13##0.82±0.02##

**P<0.01vscontrol;##P< 0.01vsH2O2.

Figure 3.The protein levels of Bcl-2, Bax and PCNA in the rat myoblasts detected by Western blot.

圖3 成肌細(xì)胞Bcl-2、Bax和PCNA蛋白表達(dá)

研究表明，Bcl-2家族蛋白在壓瘡早期肌肉組織受損中具有重要作用，隨著Bcl-2/Bax比值的降低，組織損傷逐漸加重[12]。本實(shí)驗(yàn)氧化應(yīng)激組Bax水平上升而Bcl-2蛋白呈下降趨勢，這與張恩等[13]在III期壓瘡潰瘍創(chuàng)面中發(fā)現(xiàn)Bax蛋白增加，Bcl-2減少結(jié)果一致。在對氧化應(yīng)激組成肌細(xì)胞應(yīng)用bFGF進(jìn)行干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)增加明顯，Bax水平下降，提示bFGF上調(diào)Bcl-2/Bax比值有助于降低成肌細(xì)胞損傷，然而損傷減輕也有可能與bFGF上調(diào)細(xì)胞損傷耐受閾或是成肌細(xì)胞本身增殖活性增高相關(guān)。

PCNA是一種分子量為36 kD的細(xì)胞核蛋白，在細(xì)胞周期中同DNA合成一致，為細(xì)胞從G0、G1期進(jìn)入S期的前提[14]。PCNA在各種損傷中常存在表達(dá)下降現(xiàn)象，而損傷恢復(fù)期伴隨該指標(biāo)的增加。bFGF是一種廣譜促有絲分裂的生長因子[15]。在小型豬全層皮膚缺損創(chuàng)面的研究中，陳濤等[16]發(fā)現(xiàn)bFGF可通過上調(diào)PCNA表達(dá)刺激 DNA合成，促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖與遷移，加速創(chuàng)面修復(fù)。傳統(tǒng)觀念中骨骼肌為已分化組織，不具備再生能力，近年來在肌組織基底膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在著具有增殖活性的成肌細(xì)胞，在燒傷應(yīng)激等損傷恢復(fù)過程中通過PCNA結(jié)合細(xì)胞微觀檢測發(fā)現(xiàn)成肌細(xì)胞能夠增殖融入肌纖維內(nèi)，以維持肌組織體積與功能的穩(wěn)定[17]。本實(shí)驗(yàn)氧化應(yīng)激組成肌細(xì)胞PCNA含量處于較低水平，這可能與氧自由基攻擊位于核小體中組蛋白成分，造成DNA損傷后引起成肌細(xì)胞損傷增加有關(guān)，同時(shí)氧化應(yīng)激本身可破壞成肌細(xì)胞的微環(huán)境。王雅一等[18]報(bào)道PCNA可與蛋白因子結(jié)合參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)以及細(xì)胞損傷等過程。通過外源性bFGF的干預(yù)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)bFGF可上調(diào)成肌細(xì)胞PCNA和Bcl-2表達(dá)，這可能與外源性bFGF結(jié)合成肌細(xì)胞膜表面受體，通過轉(zhuǎn)入具有增殖活性的細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮生物學(xué)功能有關(guān)。

表3 各組成肌細(xì)胞Bcl-2、Bax和PCNA蛋白表達(dá)水平

*P<0.01vscontrol;#P<0.01vsH2O2.

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)bFGF能夠減少氧化應(yīng)激過程中成肌細(xì)胞Bax蛋白水平，同時(shí)增加Bcl-2、PCNA表達(dá)，為bFGF在壓瘡深部組織損傷的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與新思路。

[1] Black J, Baharestani MM, Cuddigan J, et al. National pressure ulcer advisory panel’s updated pressure ulcer staging system[J]. Adv Skin Wound Care, 2007, 20(5):269-274.

[2] Stekelenburg A, Gawlitta D, Bader DL, et al. Deep tissue injury: how deep is our understanding？[J]. Arch Phys Med Rehabil, 2008, 89(7):1410-1413.

[3] 蔡福滿， 姜麗萍， 楊曄琴， 等. 褥瘡不完全性缺血再灌注損傷簡易模型的建立[J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(4):830-832.

[4] 謝浩煌， 張宏宇， 毛挺挺， 等. 外源性重組人堿性成纖維生長因子對大鼠壓瘡深部組織損傷后肌肉修復(fù)的作用[J]. 中華燒傷雜志, 2015, 31(6): 439-445.

[5] 毛挺挺, 王曉慧, 謝浩煌, 等. 大鼠骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷實(shí)驗(yàn)研究[J]. 護(hù)理學(xué)雜志, 2015, 30(20): 57-60.

[6] Dhanya R, Arun KB, Syama HP, et al. Rutin and quercetin enhance glucose uptake in L6 myotubes under oxidative stress induced by tertiary butyl hydrogen peroxide[J]. Food Chem, 2014, 158(1):546-554.

[7] Wang Z, Wang Y, Ye J, et al. bFGF attenuates endoplasmic reticulum stress and mitochondrial injury on myocardial ischaemia/reperfusion via activation of PI3K/Akt/ERK1/2 pathway[J]. J Cell Mol Med, 2015, 19(3):595-607.

[8] Wang ZG, Zhang HG, Xu HL, et al. bFGF inhibits ER stress induced by ischemic oxidative injury via activation of the PI3K/Akt and ERK1/2 pathways[J]. Toxicol Lett, 2012, 212(2): 137-146.

[9] Siu PM, Tam EW, Teng BT, et al. Muscle apoptosis is induced in pressure-induced deep tissue injury[J]. J Appl Physiol, 2009, 107(4):1266-1275.

[10] Tinti F， Soory M. Oxidative actions of hydrogen peroxide in human gingival and oral periosteal broblasts:responses to glutathione and nicotine, relevant to healing in a redox environment[J]. Redox Biol, 2014, 2:36-43.

[11] Yao Y, Xiao Z, Wong S, et al. The effects of oxidative stress on the compressive damage thresholds of C2C12 mouse myoblasts: implications for deep tissue injury[J]. Ann Biomed Eng, 2015, 43(2):287-296.

[12] 王艷艷， 姜麗萍， 張純瑜， 等. 凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Bax在早期壓瘡組織中的作用[J]. 中華燒傷雜志, 2011, 27(3):197-199.

[13] 張 恩. III期壓迫性潰瘍傷口中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及其對創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制研究[D]. 溫州: 溫州醫(yī)學(xué)院, 2010.

[14] Naryzhny SN, Lee H. Proliferating cell nuclear antigen in the cytoplasm interacts with components of glycolysis and cancer[J]. FEBS Lett, 2010, 584(20):4292-4298.

[15] 林 麗， 林紹強(qiáng)， 王曉玉， 等. bFGF對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及膠原產(chǎn)生的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(3):509-514.

[16] 陳 濤， 付小兵， 伍津津， 等. bFGF與MSCs自體移植對豬皮膚創(chuàng)面PCNA和Ⅷ-RAg表達(dá)的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2007, 29(2):91-93.

[17] 段紅杰， 柴家科， 盛志勇， 等. 嚴(yán)重?zé)齻笫蠊趋兰〕杉〖?xì)胞增殖活性檢測及蛋白激酶B表達(dá)分析[J]. 中華外科雜志, 2009, 47(16):1261-1264.

[18] 王雅一. 大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)及恢復(fù)因子的變化[J]. 體育科學(xué)研究, 2014, 18(3):62-65.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of Bcl-2 and PCNA expression in rat myoblast injury induced by hydrogen peroxide

MAO Ting-ting1, ZHENG Ya-hua1, FANG Hong-bo2, XIE Lu-ji1, ZHANG Wei-dan1, JIANG Li-ping2

(1NingboMedicalCenterLihuiliEasternHospital,Ningbo325000,China;2XinhuaHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China.E-mail:lipingj@shsmu.edu.cn)

AIM: To explore the role of Bcl-2 and PCNA expression in the injury of rat myoblasts induced by hydrogen peroxide (H2O2). METHODS: Rat myoblasts at growth phase were divided into 4 groups based on basic fibroblast growth factor (bFGF) and H2O2levels: normal control group, bFGF group, model group (H2O2group) and treatment group (bFGF+H2O2group). The expression of Bcl-2 and Bax was observed by immunohistochemistry and fluorescence methods. The protein levels of Bax, Bcl-2 and PCNA were determined by Western blot. RESULTS: Compared with model group, both immunofuorescence and fluorescence in treatment group showed enhanced Bcl-2 and low expression of Bax. Furthermore, the results of Western blot showed up-regulated PCNA and Bcl-2 protein and decreased Bax expression in treatment group.CONCLUSION: Oxidative stress results in the pathologic changes of myoblasts, and the up-regulation of Bcl-2 and PCNA may attenuate myoblast injury.

Deep tissue injury; Oxidative stress; L6 myoblasts; Basic fibroblast growth factor

1000- 4718(2017)05- 0935- 05

2016- 08- 11

2017- 02- 08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81372064); 上海市教委護(hù)理高原學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.028

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