滕雨明金海強(qiáng)邢海英范成河劉媛媛南丁孫永安黃一寧

·論 著·

超聲評價(jià)法優(yōu)化三氯化鐵誘導(dǎo)大鼠頸總動脈血栓模型的研究☆

滕雨明*金海強(qiáng)*邢海英*范成河*劉媛媛*南丁*孫永安*黃一寧

目的 探討采用連續(xù)超聲評價(jià)法優(yōu)化不同三氯化鐵濃度梯度和作用時(shí)間誘導(dǎo)大鼠頸總動脈血栓模型，為溶栓及取栓研究提供合適的在體血栓模型。方法 選取20只(Sprague–Dawley)SD大鼠，每組5只，分別采用20%、30%、40%、50%四種三氯化鐵濃度外敷大鼠單側(cè)頸總動脈，使用14 L高頻超聲探頭，分別在外敷10 min、15 min、20 min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察血管二維超聲圖像及彩色多普勒血流情況。選取血管閉塞最佳組大鼠，于干預(yù)120 min后觀察血管自發(fā)再通率及靜脈注射尿激酶后的血管再通率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出干預(yù)血管甲醛固定，石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色病理分析。結(jié)果 三氯化鐵外敷大鼠頸總動脈20 min、50%濃度組血管閉塞率100%，40%、30%、20%濃度組外敷20 min血管閉塞率分別20%、0%、0%(P＜0.001)。外敷120 min后，50%濃度組組血管自發(fā)再通率0%、40%、30%、20%組血管自發(fā)再通率100% (P＜0.001)，50%三氯化鐵濃度造模組尾靜脈注射尿激酶后血管部分再通率為40%。50%濃度組鏡下病理顯示血栓結(jié)構(gòu)致密，尿激酶干預(yù)后管腔部分再通，血栓結(jié)構(gòu)松散。結(jié)論 采用50%三氯化鐵濃度外敷大鼠頸總動脈20 min，可能是在體血栓模型形成的有效條件，該動物模型可能適合溶栓研究。

動物模型 三氯化鐵誘導(dǎo)血栓 閉塞血栓 超聲評價(jià)

1990年，KURZ等[1]，將三氯化鐵外敷于大鼠頸總動脈誘導(dǎo)閉塞性血栓形成，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血管閉塞時(shí)間依賴于三氯化鐵溶液濃度，濃度越高,閉塞性血栓形成越快，濃度越低，閉塞血栓形成越慢。此方法形成的血栓為富含血小板、纖維蛋白和紅細(xì)胞的混合型血栓，與臨床自發(fā)性血栓組織形態(tài)學(xué)特征相似[2]。國際通用的血栓模型評價(jià)方法為多普勒血流儀評價(jià)[1,3-6]，但血流儀只能連續(xù)顯示血流量變化情況，不能直觀的顯示血栓的形成特點(diǎn)及其變化情況。而超聲可以直觀地顯示血栓形態(tài)，便于進(jìn)行定量分析，同時(shí)可測量血栓形成過程中血流動力學(xué)變化和觀察血管壁及其周圍組織的解剖結(jié)構(gòu)。既往夏紅梅等[7]成功采用二維超聲和彩色多普勒，聯(lián)合評價(jià)兔腹主動脈非梗阻性動脈血栓的形成情況，同時(shí)郭朝峰等[8]采用多普勒血流儀聯(lián)合超聲評價(jià)兔股動脈的血栓制備，來彌補(bǔ)血流儀的不足。這些研究缺乏動物模型制備后是否適合溶栓的研究，也未采用超聲連續(xù)監(jiān)測評價(jià)血栓形成，因此本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)超聲評價(jià)及造模后溶栓研究評估，簡化實(shí)驗(yàn)方法,優(yōu)化三氯化鐵造模條件，試圖發(fā)現(xiàn)更適合溶栓研究的血栓大鼠模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 健康雄性(Sprague–Dawley) SD大鼠20只，體重350 g～400 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。動物的飼養(yǎng)應(yīng)用均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室相關(guān)規(guī)定，動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會核準(zhǔn)。

將20只 (Sprague–Dawley)SD大鼠按不同的三氯化鐵溶液濃度隨機(jī)分成四組：20%組、30%組、40%組和50%組。所有組均連續(xù)外敷大鼠單側(cè)頸總動脈20 min，并在10、15、20 min時(shí)用超聲檢測血管，評價(jià)在體血栓的形成情況。

1.2 血栓動物模型制備 用5%戊巴比妥鈉 (北京

韻邦生物科技有限公司)（50 mg/kg）經(jīng)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，大鼠仰臥位固定于鼠板上，于頸部正中切口，逐層鈍性分離皮下肌肉及組織，分離暴露右側(cè)頸總動脈約1 cm，并將一塊0.6 cm×0.8 cm大小的透明薄膜墊在血管下方，以保護(hù)周圍組織。將0.5 cm×0.5 cm大小浸泡在各個(gè)濃度三氯化鐵(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)溶液中的濾紙條取出，包裹住墊好薄膜的血管。

1.3 超聲評估 超聲操作人員經(jīng)過培訓(xùn)后，按照華盛頓大學(xué)醫(yī)院診斷標(biāo)準(zhǔn)，在專業(yè)超聲醫(yī)師指導(dǎo)下進(jìn)行圖像采集。動物模型制備完成后，以iuStar130 （United Imaging）超聲診斷儀，14 L探頭，頻率12.0 MHz，灰度46，深度2.0 cm，機(jī)械指數(shù)MI0.4探查。調(diào)整探頭與血管角度，獲得清晰血流信號圖。在二維超聲模式下，長軸切面觀察頸總動脈管壁及管腔情況后，啟動CDFI模式，觀察管腔內(nèi)彩色多普勒信號，留取儲存圖像。對各組頸總動脈處理前及處理后10、15、20 min圖像進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，獲取部分實(shí)驗(yàn)血管行病理分析。

1.4 自通檢測 超聲評價(jià)最優(yōu)組別進(jìn)行血管再通檢測，按大鼠10萬U/kg體重，尾靜脈給予尿激酶（南京南大藥業(yè)有限公司）進(jìn)行溶栓試驗(yàn)，30 min后，超聲檢測血管情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后截取部分實(shí)驗(yàn)血管，甲醛固定，病理分析。

1.5 病理結(jié)果分析 對收集標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，切片，HE染色。分別在100倍和400倍鏡下觀察血管腔內(nèi)血栓以及血管壁的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)數(shù)資料采用率表示，同一組不同時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測量方差分析，不同組同一時(shí)間點(diǎn)比較采用卡方檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05，雙側(cè)比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 三氯化鐵外敷頸總動脈造模情況 50%三氯化鐵濃度外敷頸總動脈20 min，血管閉塞率為100%，20%、30%組閉塞率為0，40%組閉塞率為20%（表1）。20%組，在開始外敷10 min后，血管壁開始有少量高回聲，血流信號稍有改變，15 min彩色多普勒信號尚未完全消失，20 min時(shí)彩色多普勒信號消失，管腔未閉塞。30%組，在開始外敷10 min后，血管壁開始有高回聲，血流信號改變明顯，15 min彩色多普勒信號完全消失，管腔有附壁血栓，20 min時(shí)彩色多普勒信號消失，管腔仍未完全閉塞。40%組，在開始外敷10 min后，血管壁開始有高回聲，血流信號改變明顯，15 min彩色多普勒信號完全消失，管腔有附壁血栓，20 min時(shí)彩色多普勒信號消失，20%大鼠血管官腔完全閉塞。50%組，在開始外敷10 min后，血管壁開始有高回聲，彩色多普勒信號完全消失，管腔有附壁血栓，15 min時(shí)候管腔變模糊，20 min時(shí)彩色多普勒信號消失，100%大鼠血管管腔閉塞（圖1A）。

表1 血管閉塞情況(n=5)

2.2 120 min后血管再通及溶栓實(shí)驗(yàn)情況 50%組三氯化鐵外敷SD大鼠頸總動脈20 min造模后，于120 min行自發(fā)再通檢測和尿激酶溶栓試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)5只SD大鼠均沒有發(fā)現(xiàn)自通現(xiàn)象（圖1B），而2只（2/5）SD大鼠尾靜脈注射尿激酶后發(fā)現(xiàn)血管部分再通（圖1C）。

2.3 病理分析 50%組鏡下可見動脈內(nèi)膜明顯損傷，結(jié)構(gòu)致密(圖1D)；40%組，動脈內(nèi)膜損傷輕，血栓結(jié)構(gòu)較松散。30%組，內(nèi)膜損傷輕，血栓結(jié)構(gòu)松散。20%組，動脈內(nèi)膜未見明顯損傷，血栓結(jié)構(gòu)明顯松散。2 h后自發(fā)再通檢測，病理結(jié)果顯示，50%血栓形態(tài)和此前無明顯變化(圖1E)。50%組，進(jìn)行尿激酶溶栓實(shí)驗(yàn)后，管腔部分再通，血栓明顯松散，可見淤滯紅細(xì)胞(圖1F)。

圖1 頸總動脈彩色多普勒圖像A.50%三氯化鐵外敷大鼠勁總動脈20 m i n血管超聲圖像（箭頭a,c透明薄膜兩端，b為薄膜和濾紙片）；B.50%外敷20 m i n，2 h后進(jìn)行自發(fā)再通檢測超聲圖像；C.50%外敷20 m i n后，立即給予UK溶栓2 h后超聲圖像；D.50%外敷20 m i n血管H E染色（100×）;E.50%外敷20 m i n,2 h后血管H E染色（100×）；F.50%外敷20 m i n,給予UK溶栓2 h后H E染色（100×）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，三氯化鐵溶液外敷大鼠頸總動脈，閉塞性血栓的形成呈三氯化鐵溶液濃度和外敷時(shí)間依賴型。即濃度越高，血栓形成越快；外敷時(shí)間越長，越易形成閉塞性血栓。50%濃度三氯化鐵外敷SD大鼠頸總動脈20 min，可以形成閉塞性血栓，無自發(fā)再通現(xiàn)象，溶栓后可血管再通，表明該動物模型適合溶栓研究。

三氯化鐵制備血栓模型存在諸多影響因素，基于不同的實(shí)驗(yàn)動物和目的，制備血栓模型條件沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。三氯化鐵血栓模型所涉及的實(shí)驗(yàn)動物包括小鼠、大鼠、兔子、豬等,涉及到的血管包括動脈、靜脈及微管系統(tǒng)。既往研究認(rèn)為根據(jù)動物的大小以及血管的狀況，制備血栓所需要的濃度和時(shí)間不同[4-5,9-11]。既往動物在體溶栓研究模型多數(shù)采用三氯化鐵直接外敷加超聲血流儀評價(jià)血栓閉塞[6,9-10,12-14]，而缺乏采用超聲評價(jià)三氯化鐵制備模型的血栓閉塞和再通情況相關(guān)研究。郭朝鋒等采用低濃度聯(lián)合夾閉動脈，血流儀聯(lián)合超聲評價(jià)的方法發(fā)現(xiàn)，10%濃度三氯化鐵溶液外敷20 min聯(lián)合夾閉股動脈7 min即可成功建立股動脈血栓模型，于此相比，本研究方法更為簡單易行。KWON等[15]采用血流儀檢測優(yōu)化三氯化鐵制備大鼠頸總動脈模型發(fā)現(xiàn)，10%濃度和20%濃度外敷均不能形成閉塞血栓，30%濃度和40%濃度可形成閉塞血栓，但是150 min內(nèi)都發(fā)生了自通現(xiàn)象，而50%濃度組所有大鼠都能形成閉塞血栓，連續(xù)150 min內(nèi)無自發(fā)再通，且溶栓藥物可以使其恢復(fù)再通，該實(shí)驗(yàn)，一方面與我們實(shí)驗(yàn)50%濃度的結(jié)果相符，即能形成閉塞血栓且無自發(fā)再通；另一方面其30%和40%可以形成閉塞血栓并未提到是在20 min時(shí)形成的，沒有表明不同濃度三氯化鐵外敷大鼠頸總動脈形成血栓的時(shí)間，且不能直接觀測到血栓的形態(tài)和血管的解剖結(jié)構(gòu)。WEI等[9]采用熒光標(biāo)記血小板，活體顯微鏡下聯(lián)合血流儀動態(tài)觀測不同三氯化鐵濃度作用不同時(shí)間小鼠頸總動脈血栓形成的情況，發(fā)現(xiàn)活體顯微鏡觀測血栓形成比血流儀準(zhǔn)確可靠，此方法運(yùn)用了更可靠的方法，但操作更為復(fù)雜，成本更高。既往研究認(rèn)為，三氯化鐵外敷血管制備血栓模型是損傷動脈內(nèi)膜繼而引發(fā)的一系列生理病理變化[1-2]，本研究發(fā)現(xiàn)，濃度越高動脈內(nèi)膜損傷程度更重，這可能是50%濃度組在20 min時(shí)，血管閉塞率最高的原因。

綜上，采用超聲連續(xù)監(jiān)測評價(jià)血栓形成，簡單方便，且能直接觀測到血栓的形態(tài)和血管的解剖結(jié)構(gòu)，更接近臨床，但也存在操作水平對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大等不足，可通過與經(jīng)典的血流儀評價(jià)，以及熒光標(biāo)記血小板，活體顯微鏡動態(tài)觀測等方法聯(lián)合，用于評估在體血栓制備效果。

采用50%三氯化鐵濃度外敷大鼠頸總動脈20 min，可能是在體血栓模型形成的有效條件，該動物模型可能適合溶栓研究。

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Optimization of a rat model of ferric chloride-induced carotid arterial thrombosis by ultrasonic continu-ous evaluation.

TENG Yuming,JIN Haiqiang,XING Haiying,FANG Chenghe,LIU Yuanyuan,NAN Ding,SUN Yongan,HUANG Yining.Department of Neurology,Peking University First Hospital,No.8 Xishiku Street,Xicheng District,Beijing 100034,China.Tel:010-83572857.

Objective The aim of this study was to establish a reasonable protocol for a rat model of ferric chloride-induced carotid arterial thrombosis by ultrasonic continuous evaluation.Methods Twenty SD rats were randomly divided into four groups and then treated with 20%,30%,40%or 50%concentrations of FeCl3,respectively. The vascular conditions were evaluated by 14L ultrasonic probe,at 10 mins,15 mins,and 20 mins.We then selected the best group through the examination of the rate of spontaneous reperfusion of blood vessels and the rate of reperfusion after intravenous injection of urokinase.At the end of the experiment,vessels were fixed in 10%formalin solution and stained with HE.Results After external application of FeCl3 on rat common carotid artery for 20 mins,the artery occlusion rate was 100%,20%,0%and 0%in animals receiving 50%,40%,30%and 20%FeCl3,respectively.After external application of FeCl3 on rat common carotid artery for 120 mins,the spontaneous revascularization rate was 0%in 50%concentration group whereas were 100%in rest other groups(P＜0.001).In 50%concentration group,the partial recanalization rate was 40%after intravenous injection of urokinase.HE staining revealed that the thrombuswas dense and the lumen was partially recanalized after the urokinase intervention in 50%concentration group.Conclusion By use of uultrasonic continuous evaluation of ferric chloride-induced thrombosis of rat common carotid artery,we have demonstrated that external application of 50%ferric chloride solution for 20 mins is effective for the formation of thrombus model,which may be suitable for the study of thrombolysis.

animal model ferric chloride-induced thrombus Thrombus Ultrasound Evaluation

R543.4

A

2016-11-23)

(責(zé)任編輯：李立)

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.02.001

☆國家自然科學(xué)基金（編號：H0906）

* 北京大學(xué)第一醫(yī)院（北京100034）