蘇 怡 高保燕 黃羅冬 吳曼曼 李愛芬 張成武

(暨南大學(xué)水生生物研究中心生態(tài)學(xué)系, 廣州 510632)

不同氮源及氮濃度對真眼點(diǎn)藻綱微藻生長及油脂積累的影響

蘇 怡 高保燕 黃羅冬 吳曼曼 李愛芬 張成武

(暨南大學(xué)水生生物研究中心生態(tài)學(xué)系, 廣州 510632)

以真眼點(diǎn)藻綱8株微藻(類波氏真眼點(diǎn)藻(Eustigmatos cf. polyphem)、大真眼點(diǎn)藻(Eustigmatos magnus)、波氏真眼點(diǎn)藻(Eustigmatos polyphem)、魏氏真眼點(diǎn)藻(Eustigmatos vischeri)、斧形魏氏藻(Vischeria helvetica)、點(diǎn)狀魏氏藻(Vischeria punctata)、星形魏氏藻(Vischeria stellata)和眼點(diǎn)擬微綠球藻(Nannochloropsis oculata))為研究材料, 用3種氮源(硝酸鈉、碳酸氫銨或尿素)和4種氮濃度(18、9、6和3 mmol) 在改良的BG-11培養(yǎng)基中對藻細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。比較分析這8株微藻在不同培養(yǎng)條件下的藻液pH、生物量、油脂含量、脂肪酸組成的差異, 從而篩選出適合該類微藻生長和油脂積累的最適氮源與最佳氮濃度。結(jié)果表明,這8株微藻均能在3種氮源中生長, 但是隨著培養(yǎng)時(shí)間延長, 以碳酸氫銨和尿素為氮源時(shí)藻液pH逐漸降低, 其變化范圍為5.0—6.0, 而以硝酸鈉為氮源時(shí)藻液pH保持在7.0—8.0, 變化不大。當(dāng)以尿素為氮源培養(yǎng)時(shí), 能獲得較高的生物量, 但是不同藻株在不同尿素濃度時(shí)達(dá)到最高生物量。最高生物量是波氏真眼點(diǎn)藻(E. polyphem)在9 mmol時(shí)達(dá)到, 為10.96 g/L?？傊糠治霭l(fā)現(xiàn), 在低氮濃度下均能促進(jìn)8株微藻油脂的積累, 真眼點(diǎn)藻屬中的魏氏真眼點(diǎn)藻(E. vischeri)在8株藻中獲得最高油脂含量, 達(dá)到59.24%。進(jìn)一步對脂肪酸分析發(fā)現(xiàn), 8株微藻總脂肪酸含量為細(xì)胞干重的50%—58%, 主要脂肪酸組成為豆蔻酸(C14：0)、棕櫚酸(C16：0)、棕櫚油酸(C16：1)、油酸(C18：1)和二十碳五烯酸(C20：5), 其中擬微綠球藻(N. oculata)細(xì)胞中棕櫚酸的含量最高占總脂肪酸50%左右; 其他7株微藻細(xì)胞中棕櫚油酸的含量較高, 其占總脂肪酸含量范圍在40%—60%。8株微藻均表現(xiàn)出較高的生物量與油脂積累能力, 以尿素為氮源, 氮濃度為6 mmol時(shí)更有利于該類微藻生物量和油脂的積累?？傮w來說, 真眼點(diǎn)藻綱的微藻是一類極具潛力適合于微藻生物燃料生產(chǎn)的微藻, 而真眼點(diǎn)藻屬藻株表現(xiàn)更為明顯的優(yōu)勢。

真眼點(diǎn)藻綱; 氮源; 藻液pH; 油脂; 脂肪酸

微藻由于其能夠大量積累油脂被認(rèn)為是一種非常有潛質(zhì)的生物燃料的原料來源。研究表明, 氮是影響微藻生長和調(diào)控油脂代謝最重要的營養(yǎng)因子之一[1], 在氮脅迫條件下可以促進(jìn)油脂積累 , 但與此同時(shí)生物量會(huì)有所降低[2]。何思思等[3]利用不同濃度硝酸鈉對魏氏真眼點(diǎn)藻進(jìn)行培養(yǎng), 結(jié)果發(fā)現(xiàn),魏氏真眼點(diǎn)藻在17.6 mmol/L氮濃度培養(yǎng)下生物量達(dá)到最高9.14 g/L, 但其總脂僅達(dá)到了較低。隨著氮濃度的降低, 油脂含量逐漸增加, 在3.0 mmol/L氮濃度下達(dá)到最高為60.82%。在5.9 mmol/L濃度下油脂產(chǎn)率為0.24 g/(L·d), 為最適培養(yǎng)條件。因此,氮濃度能顯著地影響藻細(xì)胞生長與油脂積累, 調(diào)控生物量與油脂含量。

微藻可利用多種形式的氮源, 主要包括硝態(tài)氮、銨態(tài)氮和有機(jī)氮, 對于不同形式的氮源, 藻類所對應(yīng)的吸收代謝機(jī)制也有所不同[4]。硝酸鹽由于其價(jià)格低, 優(yōu)勢較為明顯, 是常用的氮源形式[5]。銨態(tài)氮能直接在谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶的催化下, 通過轉(zhuǎn)氨基作用直接合成氨基酸而被吸收,而硝態(tài)氮?jiǎng)t需要硝酸還原酶將其轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮才能被利用, 尿素也需要尿素酶酶解后才能被利用,因此, 從能量消耗角度來看, 藻類會(huì)優(yōu)先利用銨氮,但過高濃度的氨則會(huì)對藻細(xì)胞有毒害作用。但由于不同藻株具有不同的生理特性, 對氮源種類和氮濃度具有不同的耐受性, 需要尋找最合適藻細(xì)胞生長的氮源種類與氮源濃度, 實(shí)現(xiàn)藻細(xì)胞的快速生長與高油脂積累。Sourish Bhattacharya等[6]研究發(fā)現(xiàn)用碳酸氫銨代替碳酸氫鈉作為氮源培養(yǎng)小球藻(Chlorella variabilis ATCC PTA 12198)可以有效的提高其生物量和總脂產(chǎn)率。比較分析標(biāo)志鏈帶藻(Desmodesmus insignis)在不同氮源及其氮濃度培養(yǎng)下, 藻細(xì)胞生長及油脂、碳水化合物和淀粉積累的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞均能在硝酸鈉、碳酸氫銨和尿素中進(jìn)行生長, 硝酸鈉作為氮源時(shí), 在低氮濃度(3 mmol/L)下, 油脂積累量最高達(dá)到32.61%。在高氮濃度下均能促進(jìn)該藻淀粉的積累, 但油脂含量較低, 當(dāng)以碳酸氫銨為氮源, 氮濃度為18 mmol/L培養(yǎng)時(shí)淀粉含量達(dá)到最高為55.33%[7]。因此, 不同種類的氮源及氮濃度對微藻在生長和油脂積累有較大影響, 不同藻株的生長和生物質(zhì)的積累情況也和氮源的形式有關(guān)。同時(shí)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及光照、溫度、pH等理化因素也會(huì)影響微藻細(xì)胞的油脂積累量[8]。故需要優(yōu)化培養(yǎng)條件, 獲得高生物量與高油脂積累的培養(yǎng)條件, 找到生物量和油脂積累之間找到最優(yōu)的平衡點(diǎn)[2]。

真眼點(diǎn)藻綱是1970 年Hibberd和Leedale根據(jù)其細(xì)胞學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的特征, 將原黃藻綱(Xanthophyceae)中的一些成員重新調(diào)整而成立的一個(gè)新綱, 目前僅有兩個(gè)目——真眼點(diǎn)藻目(Eustigmatales Hibberd)和角綠藻目(Goniochloriales), 報(bào)道的有6個(gè)科, 14個(gè)屬, 30多個(gè)種。而隨著越來越多的研究發(fā)現(xiàn), 真眼點(diǎn)藻綱是一個(gè)高度多樣化的綱, 有越來越多的新種等待被發(fā)現(xiàn)和鑒定[9]。真眼點(diǎn)藻綱的藻分布廣泛, 在淡水、海水和土壤表面等環(huán)境都可生存[10]。真眼點(diǎn)藻綱的色素組成也十分特別, 用于光合作用的葉綠素成分僅有葉綠素a, 不含葉綠素b和c, 另外還含有特殊的類胡蘿卜素, 如: 堇菜黃素(violaxanthin)、無隔藻黃素(vaucheriaxanthin)等[10]。研究表明, 該綱的大多數(shù)種類能積累大量的儲(chǔ)藏性油脂,特別是生產(chǎn)生物柴油的重要原料三酰甘油(TAG),且真眼點(diǎn)藻綱的藻株均含有二十碳五烯酸(EPA),是極具微藻生物能源開發(fā)潛力的藻種資源[11]。其中, 擬微綠球藻屬不僅具有高的生物量、油脂產(chǎn)量、光合作用效率并且能夠非常好的進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng), 被認(rèn)為是最有潛力的工業(yè)產(chǎn)油的模式研究藻種, 尤其是該屬中的海水種由于其可觀的中性脂產(chǎn)量和對人體有益的多不飽和脂肪酸產(chǎn)量被廣泛關(guān)注。然而, 目前對真眼點(diǎn)藻綱中的其他株系研究較少, 但研究價(jià)值更大[12]。

因此, 本研究選擇了真眼點(diǎn)藻綱中2個(gè)科3個(gè)屬的8株微藻作為研究對象, 利用3種氮源(硝酸鈉、碳酸氫銨和尿素)及4種氮濃度(18、9、6和3 mmol)這4種氮濃度條件下進(jìn)行培養(yǎng), 比較分析8株真眼點(diǎn)藻在不同培養(yǎng)條件下藻液pH變化, 生物量、總脂含量、中性脂含量、脂肪酸種類及含量的差異, 獲得有利于真眼點(diǎn)藻高生物量和高油脂積累的氮源和氮濃度, 對微藻的規(guī)模化培養(yǎng)和工業(yè)化應(yīng)用提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

真眼點(diǎn)藻綱的8株微藻如表 1所示, 保藏于暨南大學(xué)水生生物研究中心微藻生物技術(shù)與生物能源實(shí)驗(yàn)室[購于美國德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校藻種庫(UTEX)]。

表 1 八株真眼點(diǎn)藻Tab. 1 The eight strains microalgae of Eustgmatophyceae

1.2 主要儀器及試劑

高壓蒸汽滅菌鍋(D-1)、恒溫干燥箱(DHG-9140)、電子天平(Sartorius BS224S)、高速冷凍離心機(jī)(SORVALL biofuge)、冷凍干燥機(jī)(VirTis wizard 2.0)、恒溫磁力攪拌器(94-2 ThermoFinnigan)、氮吹儀(NEVAPTM 111)、pHB-3型pH計(jì)(上海三信儀表廠)、氣相色譜(Agilent6890N)。分析純: 硝酸鈉、碳酸氫銨、尿素、二甲基亞砜、甲醇、乙醚、氯仿、丙酮; 色譜純: 正己烷。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

藻細(xì)胞的培養(yǎng) 眼點(diǎn)擬微綠球藻選用海水培養(yǎng)基, 其余7株微藻采用改良BG-11培養(yǎng)基。氮源分別為硝酸鈉、碳酸氫銨和尿素, 氮濃度分別為18、9、6和3 mmol, 每組設(shè)置3個(gè)平行。將培養(yǎng)至對數(shù)生長中期的藻細(xì)胞離心(3500 r/min, 5min)收集, 用無菌水洗滌后接種, 初始接種密度為A750=0.6±0.02,微藻培養(yǎng)采用內(nèi)徑為3 cm(體積 約300 mL)的柱狀光生物反應(yīng)器, 通入1% CO2的壓縮空氣攪拌, 采用日光燈提供持續(xù)光照, 光強(qiáng)為300 μmol photons/(m2·s)的, 培養(yǎng)溫度為(25±1)℃, 培養(yǎng)周期為15d。收獲培養(yǎng)至第15天的藻液于3000 r/min離心5min, 收獲的藻泥放置于?20℃的冰箱冷凍結(jié)冰, 再放入冷凍干燥機(jī)干燥48h。凍干的藻粉于4℃保存待用。

pH測定 每24h取約5 mL藻液置于潔凈的小玻璃瓶中, 將pHB-3型pH計(jì)的測試電極放入藻液中, 攪動(dòng)后靜置, 待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄顯示值。

生物量測定 將孔徑為0.45 μm的混合纖維膜放入恒溫烘箱中進(jìn)行干燥, 干燥至恒重(W1)。取培養(yǎng)至15天時(shí)的藻液5 mL, 用預(yù)先烘干的濾膜進(jìn)行抽濾, 再次放入恒溫烘箱中干燥至恒重, 放置于干燥器中冷卻后稱重(W2), 生物量(g/L)計(jì)算公式為：

總脂含量的測定 取凍干的藻粉, 按照改進(jìn)的Khozin-Goldberg等[13]提供的總脂提取方法進(jìn)行總脂含量的測定。稱取藻粉M0(80—100 mg), 放入預(yù)先放置有磁力攪拌轉(zhuǎn)子玻璃離心管中, 每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)平行, 分別向管中加入2 mL的二甲基亞砜-甲醇溶液(v：v=1：9), 放入磁力攪拌水浴鍋中50℃下攪拌提取1.5h后3000 r/min下離心5min, 并將上清液倒入潔凈干燥的玻璃小瓶中, 再向剩余的藻渣中加4 mL乙醚-正己烷溶液(v：v=1：1), 繼續(xù)在磁力攪拌鍋中冰浴攪拌1.5h, 3000 r/min離心5min, 取上清液。上述過程再重復(fù)一次直至藻渣變?yōu)榛野咨㈦x心后的上清液全部倒入上述玻璃小瓶中, 并向其中加入4 mL蒸餾水, 靜置分層。將上層的有機(jī)相轉(zhuǎn)移到另一干凈的玻璃離心管中, 3000 r/min離心5min, 取上清液置于另一干凈的小玻璃瓶中并用氮吹儀吹干。取對應(yīng)樣品的2 mL Eppendorf管, 稱重(管重記為M1), 將小玻璃瓶中吹干的脂質(zhì)用乙醚溶解后轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中, 并用氮吹儀吹干, 稱重(記為M2)。利用差量法計(jì)算干藻粉中總脂的含量。計(jì)算公式為

總脂分級 參考Alonzo等[14,15]的方法并加以改進(jìn), 利用硅膠層析柱將總脂進(jìn)一步分級分離,分離出中性脂。用氯仿對樣品進(jìn)行洗脫, 得到中性脂(NLs), 將分離得到的中性脂用氮?dú)獯抵凛^小體積后轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱重的2 mL Eppendorf管中, 用氮?dú)獯蹈芍梁阒? 利用差量法計(jì)算中性脂分別占總脂和干藻粉的百分含量。

脂肪酸組成分析 參考Bigogno等[16]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取凍干藻粉25 mg, 置于預(yù)先加入轉(zhuǎn)子的玻璃離心管中, 加入2 mL含有2% H2SO4的無水甲醇-甲苯混合液(v：v=1：1), 同時(shí)加入50 μL 0.5%的十七烷酸標(biāo)樣, 充氬氣后, 置于80℃恒溫磁力攪拌水浴鍋中抽提1.5h, 冷卻后加入1 mL純水和1 mL正己烷, 振蕩混勻后3000 r/min, 離心5min, 將上層有機(jī)相移至另一干凈玻璃小瓶中, 用氮?dú)獯蹈? 再用200 μL正己烷轉(zhuǎn)移至氣相色譜樣品瓶中, 密封保存于–20℃冰箱中待測。利用氣相色譜儀(Agilent6890N)分析測定脂肪酸組成及其相對含量。

單位體積總脂、中性脂和總脂肪酸產(chǎn)率的計(jì)算

其中, mt為生物質(zhì)濃度(g/L), T分別為總脂、中性脂或總脂肪酸占干重的比例(%DW), t為培養(yǎng)時(shí)間(d)。

數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel和Origin8.6對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。并用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析, P＜0.05表示顯著水平差異。

2 結(jié)果

2.1 不同氮源及其氮濃度條件下藻液的pH變化

圖 1 不同氮源及氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻培養(yǎng)液pH的影響Fig. 1 Effects of different nitrogen source and nitrogen concentration on the pH value of culture medium of eight species of Eustigmatophyceaea. 類波氏真眼點(diǎn)藻; b. 大真眼點(diǎn)藻; c. 波氏真眼點(diǎn)藻; d. 魏氏真眼點(diǎn)藻; e. 斧型魏氏藻; f. 點(diǎn)狀魏氏藻; g. 星形魏氏藻; h. 眼點(diǎn)擬微綠球藻; 下同a. E. cf. polyphem; b. E. magnus; c. E. polyphem; d. E. vischeri; e. V. helvetica; f. V. punctata; g. V. stellata; h. N. oculata; the same applies below

如圖 1所示, 擬微綠球藻、斧形魏氏藻、點(diǎn)狀魏氏藻的培養(yǎng)液在碳酸氫銨為氮源時(shí)初始的pH偏堿性在7.5—8.0, 而硝酸鈉、尿素作為氮源時(shí)初始pH偏酸性大約在6.0左右; 另外5株微藻培養(yǎng)液在剛培養(yǎng)時(shí)pH都比較高在8.0—9.0, 呈堿性。在培養(yǎng)15d的過程中, 8株藻的pH在第0到第1天都有一個(gè)快速的下降, 第1天之后硝酸鈉培養(yǎng)條件下pH略有增長, 然后趨于平穩(wěn); 在另外兩種培養(yǎng)條件下pH繼續(xù)降低然后趨于平穩(wěn)。在硝酸鈉培養(yǎng)條件下pH變化幅度比較小, 最后一天的pH (大約在7.0左右)明顯高于在碳酸氫銨及尿素條件下培養(yǎng)的最后一天的pH (大約在5.0—6.0)。在硝酸鈉培養(yǎng)條件下高氮濃度(18和9 mmol)比低氮濃度(6和3 mmol) pH高, 在另外兩種氮源條件下低氮濃度比高氮濃度的pH高,尤其在3種魏氏藻中十分明顯。

2.2 不同氮源及其氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻綱微藻生長的影響

從圖 2中可以看出, 眼點(diǎn)擬微綠球藻第15天的生物量隨氮濃度的降低而降低, 最大值出現(xiàn)在18 mmol氮濃度下, 而另外7株真眼點(diǎn)藻第15天的生物量在9及6 mmol氮濃度下明顯比18和3 mmol氮濃度條件下高。在尿素作為氮源的培養(yǎng)條件下生物量普遍較另外兩種氮源高。8株真眼點(diǎn)藻綱微藻第15天的生物量最大值分別為: 大真眼點(diǎn)藻、點(diǎn)狀魏氏藻和類波氏真眼點(diǎn)藻均在6 mmol的尿素條件下生物量最高, 分別達(dá)到達(dá)到10.22、10.02和8.8 g/L。波氏真眼點(diǎn)藻、斧形魏氏藻、魏氏真眼點(diǎn)藻和星形魏氏藻在9 mmol的尿素條件下生物量最高分別為10.96、8.86、8.53和8.5 g/L, 眼點(diǎn)擬微綠球藻在18 mmol的尿素條件下達(dá)到9.22 g/L。單因素方差分析表明, 不同氮源培養(yǎng)條件下差異不顯著(P＞0.05), 各濃度組間的生物質(zhì)濃度也沒有明顯差異(P＞0.05)。

2.3 不同氮源及氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻總脂含量的影響

對在不同氮源及氮濃度培養(yǎng)條件下8株真眼點(diǎn)藻綱微藻培養(yǎng)到第15天時(shí)細(xì)胞內(nèi)總脂的含量進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn), 不同氮源培養(yǎng)條件下差異不顯著(P＞0.05), 低氮組(3 mmol)和高氮組(18 mmol)之間差異極顯著(P＜0.01)。由圖 3可知, 總脂含量隨著氮濃度降低而增加, 最高總脂含量均在3 mmol氮濃度時(shí)達(dá)到。8株藻最高總脂含量最大值分別為: 波氏真眼點(diǎn)藻、類波氏真眼點(diǎn)藻在尿素為氮源時(shí), 總脂含量分別占細(xì)胞干重的59.03%和58.87%;魏氏真眼點(diǎn)藻、大真眼點(diǎn)藻、眼點(diǎn)擬微綠球藻、星形魏氏藻在碳酸氫銨條件下分別達(dá)到59.24%、58.77%、56.31%和56.08%; 斧型魏氏藻、點(diǎn)狀魏氏藻在硝酸鈉條件下最大值分別為57.52%和53.55%?？傮w來說, 8株真眼點(diǎn)藻的總脂含量都非常高, 全都占細(xì)胞干重的50%以上, 其中真眼點(diǎn)藻屬的總脂含量整體較高, 而魏氏藻屬和眼點(diǎn)擬微綠球藻的則相對較低。

2.4 不同氮源及氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻中性脂含量的影響

參照總脂分級方法, 對獲得的總脂進(jìn)行分級,分離出中性脂。由圖 4可知, 培養(yǎng)到第15天時(shí)中性脂含量都非常高, 且隨著氮濃度的降低中性脂含量增加, 在3 mmol氮濃度條件下8株真眼點(diǎn)藻綱微藻都獲得了最大中性脂含量, 分別為波氏真眼點(diǎn)藻、類波氏真眼點(diǎn)藻、大真眼點(diǎn)藻和斧型魏氏藻在尿素條件下分別可達(dá)57.42%、55.02%、52.93%和48.90%; 點(diǎn)狀魏氏藻、魏氏真眼點(diǎn)藻和眼點(diǎn)擬微綠球藻在碳酸氫銨條件下分別可達(dá): 52.47%、49.75%和48.06%。星形魏氏藻在硝酸鈉條件下達(dá)50.48%; 在4種真眼點(diǎn)藻屬中波氏真眼點(diǎn)藻的中性脂含量最高達(dá)57.42%; 在3種魏氏藻屬中點(diǎn)狀魏氏藻的中性脂含量最高達(dá)52.47%。對其進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn), 在不同氮源培養(yǎng)條件下差異不顯著(P＞0.05), 不同氮濃度之間差異顯著(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明了此8株真眼點(diǎn)藻綱微藻都是高產(chǎn)油的微藻。

2.5 不同氮源及氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻綱微藻脂肪酸含量的影響

表 2表示在3種氮源及4種氮濃度培養(yǎng)條件下8株真眼點(diǎn)藻綱微藻細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸組分及其相對含量(占總脂肪酸的百分比), 圖 5表示其脂肪酸絕對含量(占細(xì)胞干重的百分比)。如表 2所示真眼點(diǎn)藻所含主要的脂肪酸成分有飽和脂肪酸[包括C14∶0(豆蔻酸)、C16∶0(棕櫚酸)], 單不飽和脂肪酸[包括C16∶1(棕櫚油酸)、C18∶1(油酸)]和多不飽和脂肪酸[包括C18∶2(亞油酸)、C20∶4(花生四烯酸)、C20∶5(EPA)]。其中, 眼點(diǎn)擬微綠球藻中相對含量最高的是棕櫚酸約占總脂肪酸的50%左右其次是棕櫚油酸和油酸, 而其他真眼點(diǎn)藻中相對含量最高的是棕櫚油酸占總脂肪酸含量在40%—60%。棕櫚油酸的相對含量隨著氮濃度的降低而增高, 而亞油酸、花生四烯酸和EPA隨著氮濃度降低有降低趨勢。另外, 由圖 5可以看出, 各脂肪酸組分占細(xì)胞干重的含量隨氮濃度的降低而增加,在氮濃度3 mmol時(shí)達(dá)到最大, 與總脂含量與中性脂含量的變化趨勢一致。8株微藻的最高總脂肪酸絕對含量分別為: 魏氏真眼點(diǎn)藻、類波氏真眼點(diǎn)藻、波氏真眼點(diǎn)藻和斧形魏氏藻在尿素條件下分別達(dá)56.50%、54.65%、54.64%和50.00%; 點(diǎn)狀魏氏藻、星形魏氏藻和大真眼點(diǎn)藻在碳酸氫銨條件下分別達(dá): 53.19%、52.35%和49.26%; 眼點(diǎn)擬微綠球藻總脂肪酸絕對含量最高的在是3 mmol硝酸鈉條件下, 達(dá)48.54%。在4種真眼點(diǎn)藻屬中, 總脂肪酸絕對含量最高魏氏真眼點(diǎn)藻, 達(dá)到56.50%。在魏氏藻屬的3個(gè)種中, 總脂肪酸絕對含量最高是點(diǎn)狀魏氏藻, 達(dá)到53.19%。研究表明[17], 富含單不飽和脂肪酸的原料更適合于生產(chǎn)生物柴油, 另外, 飽和脂肪酸的存在也具有重要作用。由脂肪酸分析可以看出, 8株真眼點(diǎn)藻脂肪酸的主要組成成分都是棕櫚酸棕櫚油酸和油酸, 尤其是真眼點(diǎn)藻科的7株藻, 在低氮(3 mmol)條件下棕櫚油酸和油酸的相對含量都占總脂肪酸的60%以上, 突顯出了其作為生物柴油生產(chǎn)原料的天然優(yōu)勢性。

圖 2 不同氮源及氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻第15天生物量的影響Fig. 2 Effects of different nitrogen source and nitrogen concentration on the growth of eight species of Eustigmatophyceae on day 15

圖 3 不同氮源及氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻第15天總脂含量的影響Fig. 3 Effects of different nitrogen source and nitrogen concentration on the total lipid contents of eight species of Eustigmatophyceae on day 15

圖 4 不同氮源及氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻第15天中性脂的絕對含量(占細(xì)胞干重)的影響Fig. 4 Effects of different nitrogen source and nitrogen concentration on the neutral lipid contents of eight species of Eustigmatophyceae on day 15

2.6 不同氮源及氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻單位體積總脂、中性脂和總脂肪酸產(chǎn)率的影響

由圖 6可知, 在一般情況下中間氮濃度(9和6 mmol)培養(yǎng)條件下產(chǎn)率較高, 高氮(18 mmol)條件下產(chǎn)率最低。第15天的總脂、中性脂及總脂肪酸產(chǎn)率最大值如下: 類波氏真眼點(diǎn)藻分別達(dá)0.30、0.30和0.26 g/(L·d), 大真眼點(diǎn)藻分別達(dá): 0.32、 0.32和0.29 g/(L·d), 波氏真眼點(diǎn)藻分別達(dá)0.40、0.36和0.36 g/(L·d), 魏氏真眼點(diǎn)藻分別達(dá)0.23、0.21和0.23 g/(L·d), 斧型魏氏藻分別達(dá)0.28、0.24和0.25 g/(L·d), 點(diǎn)狀魏氏藻分別達(dá)0.31、0.31和0.31 g/ (L·d), 星形魏氏藻分別達(dá)0.27、0.22和0.26 g/(L·d),眼點(diǎn)擬微綠球藻分別達(dá)0.29、0.25和0.19 g/(L·d)。

3 討論

3.1 氮源種類對8株真眼點(diǎn)藻的生長及油脂積累的影響

在自然界中, 除了少數(shù)藍(lán)藻具有固氮能力之外大多數(shù)微藻必須利用其生長環(huán)境中的氮源來滿足自身的生長、繁殖所需, 且不同的藻種對氮源的種類和濃度需求不同[18]。有報(bào)道指出, 不同藻類對氮的吸收利用途徑會(huì)有所不同, 進(jìn)而引起培養(yǎng)基pH的變化, 在吸收利用時(shí)會(huì)釋放出OH–導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH升高, 吸收利用時(shí)會(huì)釋放出H+使得培養(yǎng)液的pH降低, 而在吸收利用CO(NH2)2時(shí)培養(yǎng)液pH變化不大[19]。而培養(yǎng)基的pH會(huì)影響光合作用中CO2的可利用性以及微藻對有機(jī)碳源的利用效率;另外pH直接影響細(xì)胞膜的滲透性, 影響微藻細(xì)胞對培養(yǎng)液中離子的吸收和利用, 故pH是影響藻類生長代謝的重要因子之一[20]。本研究利用了硝酸鹽、銨鹽、尿素3種不同類型的氮源對8株真眼點(diǎn)藻綱的微藻進(jìn)行了培養(yǎng), 研究發(fā)現(xiàn), 這8株微藻在不同氮源種類的培養(yǎng)條件下, 初始的pH差別較大, 擬微綠球藻、斧形魏氏藻、點(diǎn)狀魏氏藻的培養(yǎng)液在硝酸鈉、尿素作為氮源時(shí)初始pH偏酸性, 其他培養(yǎng)條件下大都呈堿性, 而真眼點(diǎn)藻屬的幾株微藻, 培養(yǎng)液的初始pH呈較強(qiáng)的堿性。培養(yǎng)1d后, pH都有一個(gè)大幅的降低, 培養(yǎng)至第15天時(shí), 除硝酸鈉培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)液pH約呈中性, 在另外兩種氮源條件下培養(yǎng)液的pH都呈弱酸性, 結(jié)合對第15天生物量和油脂含量的測定, 可以得出弱酸性的環(huán)境更加適合此8株真眼點(diǎn)藻綱微藻的生長代謝及油脂積累。

有研究表明, 氮源種類還會(huì)對細(xì)胞的生長和繁殖產(chǎn)生影響, Mulholland等[21]發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻門中的束毛藻不僅在尿素中比在其他氮源中生長速度快, 而且在有尿素可利用的情況下, 優(yōu)先使用尿素作為其所需的氮源。另外, 在不同氮源培養(yǎng)條件下其細(xì)胞內(nèi)總脂的含量也有很大的變化, 陳小妹[22]研究了尖狀柵藻在尿素和硝酸鈉培養(yǎng)下總脂積累的情況, 發(fā)現(xiàn)在尿素培養(yǎng)下的尖狀柵藻其細(xì)胞內(nèi)總脂積累速度要明顯快于硝酸鈉培養(yǎng)下的積累速度。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示在尿素作為氮源的情況下8株真眼點(diǎn)藻綱的微藻普遍生長更好些, 可獲得更大的生物量。眼點(diǎn)擬微綠球藻在18 mmol的尿素條件下獲得最大生物量達(dá)到9.22 g/L; 在魏氏藻屬的3個(gè)種中,第15天生物量最高的是在6 mmol的尿素條件下培養(yǎng)的點(diǎn)狀魏氏藻, 達(dá)到10.02 g/L; 在真眼點(diǎn)藻屬4個(gè)種中, 第15天生物量最高的是在9 mmol的尿素條件下培養(yǎng)的波氏真眼點(diǎn)藻, 達(dá)到10.96 g/L。另外, 在培養(yǎng)到第15天時(shí)真眼點(diǎn)藻綱的8株微藻的總脂含量都較高, 在不同氮源條件下獲得的總脂含量差異不大, 眼點(diǎn)擬微綠球藻在碳酸氫銨條件下, 獲得最大總脂含量為56.31%; 在魏氏藻屬的3個(gè)種當(dāng)中, 總脂含量最高的是在3 mmol的硝酸鈉條件下培養(yǎng)的斧形魏氏藻, 達(dá)到57.52%。在真眼點(diǎn)藻屬的4個(gè)種中,總脂含量最高的是3 mmol的碳酸氫銨條件下培養(yǎng)的魏氏真眼點(diǎn)藻, 達(dá)到59.24%。因而可以推斷不同氮源對此真眼點(diǎn)藻綱的8株微藻總脂含量的影響不顯著。

表 2 不同氮源及氮濃度條件下8株真眼點(diǎn)藻脂肪酸組成及相對含量變化Tab. 2 The fatty acid profiles and relative contents in eight species of Eustigmatophyceae under different nitrogen source and nitrogen concentration

續(xù)表2

續(xù)表2

3.2 氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻的生長及油脂積累的影響

氮源是微藻細(xì)胞內(nèi)合成氨基酸的重要來源, 在一定的氮濃度條件下微藻才能正常生長及繁殖, 過低的氮濃度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞營養(yǎng)不足, 細(xì)胞生長代謝停滯[23]。而過高的氮源濃度則會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)通過同化過程而產(chǎn)生的過多銨離子無法迅速轉(zhuǎn)移到氨基酸的合成中去, 從而引起藻細(xì)胞銨中毒, 進(jìn)而影響微藻的生長, 甚至?xí)苯訉?dǎo)致微藻的死亡[24]。在本研究中, 7株真眼點(diǎn)藻科的微藻在高氮(18 mmol)和低氮(3 mmol)條件下的生物量都不如中等氮濃度(9和6 mmol)的生物量高, 而擬單胞藻科的擬微綠球藻卻在高氮條件下獲得了最大的生物量, 說明這兩個(gè)科的藻在氮濃度的耐受性上有較大的差異。此外, 同一種氮源的不同濃度同樣會(huì)影響微藻細(xì)胞內(nèi)油脂的積累, 在氮脅迫的條件下微藻細(xì)胞能積累大量的油脂。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 8株微藻均在低氮條件下獲得最大的總脂、中性脂、脂肪酸含量, 與其他文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相一致。

3.3 氮濃度對真眼點(diǎn)藻綱微藻脂肪酸組成的影響

微藻細(xì)胞中含有的脂肪酸種類多種多樣, 不同種類的藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的種類有很大差異, 同一種微藻在不同的培養(yǎng)條件下脂肪酸的種類也會(huì)有差異[25]。真眼點(diǎn)藻綱藻類的主要脂肪酸組成為豆蔻酸(Myristic acid, C14：0)、棕櫚酸(Palmitic acid, C16：0)、棕櫚油酸(Palmitoleic acid, C16：1)、油酸(Oleic acid, C18：1)、亞油酸(Linoleic acid, C18：2)、花生四烯酸(Arachidonic acid, C20：4) 和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA, C20：5), 真眼點(diǎn)藻綱的藻類富含長鏈多不飽和脂肪酸, 特別是EPA[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在眼點(diǎn)擬微綠球藻中脂肪酸含量最高的是棕櫚酸約占總脂肪酸含量的50%左右, 且隨著氮濃度的降低而增加, 真眼點(diǎn)藻綱的另外7株微藻中脂肪酸含量最高的是棕櫚油酸占總脂肪酸含量的40%—60%, 隨著氮濃度的降低有所增加的趨勢。但是亞油酸、花生四烯酸和EPA這幾種多不飽和脂肪酸含量隨著氮濃度降低有降低趨勢。

本文的主要研究目的是比較真眼點(diǎn)藻綱的8株微藻在3種氮源4種氮濃度條件下的生長情況及油脂產(chǎn)率, 以便能更好地對真眼點(diǎn)藻綱的微藻進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)與利用。研究結(jié)果表明此真眼點(diǎn)藻綱的這8株微藻都是高產(chǎn)油的微藻, 尿素在3種氮源當(dāng)中是最有利于其生長的氮源, 中等氮濃度(9和6 mmol)能獲得更高的生物量, 低氮濃度(3 mmol)能獲得更高的油脂含量, 而在中等氮濃度條件下能夠獲得最大的油脂產(chǎn)率。比較油脂產(chǎn)率、中性脂產(chǎn)率以及總脂肪酸產(chǎn)率發(fā)現(xiàn)在真眼點(diǎn)藻屬中, 波氏真眼點(diǎn)藻的這3種產(chǎn)率最高, 分別達(dá)0.40、0.36和0.36 g/(L·d);在魏氏藻屬中, 點(diǎn)狀魏氏藻的這3種產(chǎn)率也是最高,分別達(dá)0.31、0.31和0.31 g/(L·d)。此兩株藻分別在屬內(nèi)具有明顯的優(yōu)勢, 具有非常高的深入研究價(jià)值。

圖 5 不同氮源及氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻第15天脂肪酸絕對含量的影響Fig. 5 Effects of different nitrogen source and nitrogen concentration on the fatty acid absolute contents of eight species of Eustigmatophyceae on day 15

圖 6 不同氮源及氮濃度對8株真眼點(diǎn)藻第15天單位體積總脂、中性脂和總脂肪酸產(chǎn)率的影響Fig. 6 Effects of different nitrogen source and nitrogen concentration on the volumetric productivity of total lipids, neutral lipids and total fatty acids of eight species of Eustigmatophyceae on day 15

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EFFECTS OF DIFFERENT NITROGEN SOURCE AND CONCENTRATION SUPPLIES ON THE GROWTH AND LIPID ACCUMULATION OF EUSTGMATOPHYCEAN MICROALGAE

SU Yi, GAO Bao-Yan, HUANG Luo-Dong, WU Man-Man, LI Ai-Fen and ZHANG Cheng-Wu
(Research Center for Hydrobiology, Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

To investigate the effects of nitrogen on the growth and lipids accumulation of Eustgmatophyceae, three different nitrogen sources (sodium nitrate, ammonium bicarbonate and urea) and four different initial nitrogen concentrations (18 mmol, 9 mmol, 6 mmol and 3 mmol) were used to culture eight species of Eustgmatophyceae (Eustigmatos cf. polyphem, Eustigmatos magnus, Eustigmatos polyphem, Eustigmatos vischeri, Vischeria helvetica, Vischeria punctata, Vischeria stellata and Nannochloropsis oculata) to select the best culture condition. The pH values of culture medium, biomass, lipids accumulation and fatty acid composition of Eustgmatophyceae were utilized to assess its effects. The results showed that three kinds of nitrogen sources were suitable for the eight species. For the prolong culture, the pH values of culture medium gradually reduced to 5.0—6.0 when ammonium bicarbonate and urea were used as nitrogen sources, and the pH values of culture medium remained at 7.0—8.0 when sodium nitrate was used as nitrogen sources. Meanwhile, the higher biomass could be obtained when urea was used as nitrogen source, but different species reached to the highest biomass under different nitrogen concentrations. The highest biomass of 10.96 g/L was achieved in E. Polyphem at 9 mmol. Low nitrogen level could stimulate the lipids accumulation in all species with the highest lipid content of 59.24% of dry weight in E. vischeri. The total fatty acid contents of the eight species were about 50%—58% of dry weight, and the mainly fatty acids were myristic acid (C14：0), palmic acid (C16：0), palmitoleic acid (C16：1), oleic acid (C18：1) and eicosapentaenoic (C20：5). In N. oculata, the content of palmic acid was the highest one, which was about 50% of total fatty acids. However, in other seven species, the content of palmitoleic acid reached about 40%—60% of total fatty acids. In conclusion, urea (at 6 mmol nitrogen concentrations) is the best condition for the eustigmatophycean microalgae to accumulate biomass and oil. In general, all eight species of Eustgmatophyceae can accumulate large contents of lipids, and Eustigmatos showed the best potential to produce biofuels.

Eustigmatophyceae; Nitrogen source; pH; Lipids; Fatty acid

S968.4

A

1000-3207(2017)03-0677-15

10.7541/2017.86

2016-08-26;

2016-11-24

國家“863”計(jì)劃(2009AA06440, 2013AA065805); 國家“973”計(jì)劃(2011CB2009001); 國家自然科學(xué)基金(31170337, 41176105);廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2010A090200008); 廣東省發(fā)改委低碳專項(xiàng)資金(2011-051); 珠海市科技重點(diǎn)項(xiàng)目(PC20081008)資助 [Supported by Grants from National High Technology Research and Development Program of China (863 Program, 2009AA06440, 2013AA065805); the National Basic Research Program of China (973 Program, 2011CB2009001); the National Natural Science Foundation of China (31170337, 41176105); Special Project on the Integration of Industry, Education and Research of Guangdong Province (2010A090200008); Special Program for Low-Carbon, Reform and Development Commission of Guangdong Province (2011-051); Scientific and Technical R & D Program of Zhuhai City (PC20081008)]

蘇怡(1991—), 女, 湖南岳陽人; 碩士研究生; 研究方向?yàn)槲⒃迳锬茉磁c生物技術(shù)。E-mail: 499035782@qq.com

張成武(1963—), 男, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師; 研究方向?yàn)槲⒃迳飳W(xué)與生物技術(shù)。E-mail: tzhangcw@jnu.edu.cn