龐永冰，王琳琳＊，校晗

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤274000;*嘉祥縣人民醫(yī)院，山東嘉祥272400）

陰莖海綿神經(jīng)損傷采用蠶絲蛋白膜聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究

龐永冰，王琳琳＊，校晗

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東菏澤274000;*嘉祥縣人民醫(yī)院，山東嘉祥272400）

目的探討陰莖海綿體內(nèi)損傷結(jié)合絲素蛋白膜神經(jīng)修復(fù)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的療效。方法將36只雄性健康SD大鼠隨機(jī)分成三組，海綿體神經(jīng)切斷組、絲素蛋白膜聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子組及絲素蛋白膜修復(fù)組。每組12只。海綿體神經(jīng)切斷組大鼠單純切斷雙側(cè)的海綿體神經(jīng)，不做其他處理；對(duì)絲素蛋白膜聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子F組大鼠先制作海綿體神經(jīng)缺損的模型，然后用絲素蛋白膜橋接進(jìn)行修復(fù)，局部注入神經(jīng)生長(zhǎng)因子30 μl；絲素蛋白膜修復(fù)組僅用絲素蛋白膜對(duì)缺損的海綿體神經(jīng)進(jìn)行橋接修復(fù)；術(shù)后90天對(duì)三組大鼠進(jìn)行：阿樸嗎啡試驗(yàn)，計(jì)數(shù)SD大鼠陰莖勃起次數(shù)、勃起率。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)大鼠陰莖中后部海綿體組織中神經(jīng)型一氧化氮合酶的表達(dá)。應(yīng)用SPSS17.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析、t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。結(jié)果陰莖勃起率A組與B組、A組與C組比較，P均＜0.005;B組與C組比較，P＞0.05。勃起次數(shù)A組與B組、A組與C組比較，P均＜0.0005;B組與C組比較，P＜0.001。對(duì)缺損的海綿體神經(jīng)斷端進(jìn)行橋接修復(fù)后將自制的神經(jīng)生長(zhǎng)因子90天后NOS神經(jīng)纖維染色最為明顯。陽(yáng)性纖維數(shù)目A組與B組、A組與C組、B組與C組數(shù)目比較，P均＜0.0005。結(jié)論絲素蛋白膜聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)海綿體神經(jīng)修復(fù)與再生具有明顯的促進(jìn)作用，為海綿體神經(jīng)缺損的臨床治療提供了新的方向及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

絲素蛋白膜/治療應(yīng)用；神經(jīng)生長(zhǎng)因子/治療應(yīng)用；海綿體神經(jīng)損傷/治療

前列腺癌的發(fā)病率在我國(guó)逐漸上升，成為男性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前對(duì)該病最好的治療方法仍然是前列腺癌根治手術(shù)，但在手術(shù)過(guò)程中，對(duì)前列腺的周圍神經(jīng)血管的損傷是不可避免的，其中的海綿體神經(jīng)被損傷后會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)勃起功能障礙（ED），使患者術(shù)后的生活質(zhì)量下降。我們應(yīng)用SD大鼠模擬外科手術(shù)對(duì)海綿體神經(jīng)所形成的損傷，然后應(yīng)用絲素蛋白膜(SF)聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)，在手術(shù)后的90天對(duì)其修復(fù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組36只健康SD雄性大鼠，體重180～260 g(解放軍第八十九醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，隨機(jī)分為3組，每組12只。A組：海綿體神經(jīng)切斷組；B組：SF聯(lián)合NGF組；C組：SF修復(fù)組。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料純度百分之百的絲素蛋白膜，剪成0.5 cm×0.8 cm備用；在牛精液中自行純化的N G F溶液，每毫升中約神經(jīng)生長(zhǎng)因子約1 mg。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理SD大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，用濃度為2.5%的戊巴比妥鈉（北京普博斯生物科技有限公司，P3761）按每公斤體重約40 mg～45 mg行腹腔麻醉。成功以后取下腹部正中切口，依次找到睪丸、精囊腺等組織，將這些盆腔組織進(jìn)行外翻，在前列腺和直腸前外側(cè)壁間應(yīng)用外科顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司，F(xiàn)40）尋找海綿體神經(jīng)，找到了海綿體神經(jīng)后進(jìn)行游離，為證實(shí)其為海綿體神經(jīng)可用自制的電極對(duì)該神經(jīng)進(jìn)行刺激，證實(shí)以后按照實(shí)驗(yàn)分組處理。處理方法：A組大鼠先找到海綿體神經(jīng)，然后將兩側(cè)的神經(jīng)分別切除約8 mm左右，然后縫合切口，不做其它處理；B組大鼠將海綿體神經(jīng)切除8 mm后，在外科手術(shù)顯微鏡底下用9-0的尼龍線將SF與海綿體神經(jīng)的兩個(gè)斷端進(jìn)行橋接修復(fù)；C組大鼠雙側(cè)海綿體神經(jīng)被切除8 mm后以SF單純進(jìn)行橋接修復(fù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)定指標(biāo)（1）阿樸嗎啡試驗(yàn)：手術(shù)后90天，對(duì)各組大鼠進(jìn)行阿樸嗎啡試驗(yàn)，具體方法是在大鼠的頸部用自制阿樸嗎啡溶液(上海靜融生物科技有限公司，100839-200601)以每公斤體重150 μg進(jìn)行注射，在注射后的30 min內(nèi)對(duì)大鼠陰莖勃起情況進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)勃起的次數(shù)。（2）免疫組化方法：計(jì)數(shù)神經(jīng)性一氧化氮合酶神經(jīng)纖維的數(shù)目：手術(shù)后90天，取實(shí)驗(yàn)大鼠陰莖中后部的海綿體，將所得海綿體組織運(yùn)用常規(guī)方法制成石蠟切片，將石蠟切片脫蠟后進(jìn)行抗原的修復(fù)，修復(fù)后在室溫下用山羊血清封閉液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)封閉20 min，然后將封閉液甩掉，加1∶150濃度的一抗(快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物,北京博奧森生物公司)，在4℃條件下過(guò)夜后用PBS進(jìn)行沖洗，沖洗后加1：100的二抗(大鼠NOS1免疫組化試劑盒,北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，后在室溫下進(jìn)行20 min的孵育，孵育后應(yīng)用PBS液進(jìn)行沖洗，沖洗后滴加新配的DAB液，放在顯微鏡下進(jìn)行觀察，大約10～20 min左右即發(fā)生著色，著色后立即進(jìn)行沖洗，沖洗后用蘇木素進(jìn)行復(fù)染，再進(jìn)行一次脫水后用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，最后將切片放在顯微鏡(BX51型生物光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng),日本Olympus公司)下觀察被染成棕黃色的神經(jīng)纖維，并在400×下隨機(jī)選取6個(gè)視野，對(duì)視野中陽(yáng)性的神經(jīng)性一氧化氮合酶陽(yáng)性的神經(jīng)纖維進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析、t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 計(jì)數(shù)神經(jīng)型一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)纖維的數(shù)目見(jiàn)表1。

表1 一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)纖維的數(shù)目比較（個(gè)

表1 一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)纖維的數(shù)目比較（個(gè)

陽(yáng)性纖維數(shù)目A組與B組、A組與C組、B組與C組，數(shù)目比較，t=67.008、25.738、8.9101,P均＜0.0005。

?

2.2 阿撲嗎啡實(shí)驗(yàn)A組大鼠在陰莖勃起次數(shù)、勃起率上明顯低于B組、C組，差別具有顯著性，B、C大鼠間的差別也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.3 免疫組化法觀察nNOS神經(jīng)纖維染色結(jié)果術(shù)后90天，取各只大鼠陰莖海綿體中部海綿體組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，nNOS陽(yáng)性神經(jīng)纖維被染成棕黃色，其中A組大鼠棕黃色神經(jīng)纖維數(shù)明顯低B組和C組，B組亦明顯多于C。見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

表2 三組阿撲嗎啡結(jié)果比較

表2 三組阿撲嗎啡結(jié)果比較

陰莖勃起率A組與B組、A組與C組比較，χ2=20.307、17.142，P＜0.005;B組與C組比較，χ2=0,P＞0.05。勃起次數(shù)A組與B組、A組與C組比較，t=8.2272、6.5206，P＜0.0005;B組與C組比較，t=3.6484，P＜0.001。

圖1 A組大鼠nNOS神經(jīng)纖維染色結(jié)果

圖2 B組大鼠nNOS神經(jīng)纖維染色結(jié)果

圖3 C組大鼠nNOS神經(jīng)纖維染色結(jié)果

3 討論

神經(jīng)生長(zhǎng)因子是在20世紀(jì)50年代初被最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，關(guān)于它的研究最為清楚，神經(jīng)生長(zhǎng)因子在維持神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及神經(jīng)系統(tǒng)功能方面起著非常重要的作用。有研究表明[1]，神經(jīng)生長(zhǎng)因子在周圍神經(jīng)的再生過(guò)程中起著重要的作用，其與神經(jīng)再生的關(guān)系非常密切，在周圍神經(jīng)損傷缺損處局部給予外源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子，經(jīng)過(guò)一系列的作用后最終會(huì)引起神經(jīng)的功能、生理的變化[2]。當(dāng)周圍神經(jīng)發(fā)生損傷后，該神經(jīng)的神經(jīng)元將發(fā)生死亡等一系列的病理生理改變[3]，在神經(jīng)損傷處給于外源性的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，不僅可以保護(hù)神經(jīng)元，防止神經(jīng)元死亡，而且還可以促進(jìn)突起的生長(zhǎng)。損傷金魚(yú)的視神經(jīng)，后在神經(jīng)損傷局部給予外源性的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，發(fā)現(xiàn)損傷的視神經(jīng)的神經(jīng)纖維在數(shù)量、長(zhǎng)度上明顯增加，表明該因子具有促進(jìn)神經(jīng)纖維再生的作用，而且可以促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[4]。

絲素蛋白膜是一種純天然的高分子生物蛋白，它主要有丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸組成，其有較好的化學(xué)、物理性能，而且具有良好的人體親和性[5]、生物相容性[6]、在體內(nèi)可以發(fā)生生物降解[7]。近十幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)絲素蛋白膜在人工血管[8]、藥物載體[9]、人工皮膚[10]、骨組織修復(fù)[11]，尿道修復(fù)[12]等方面進(jìn)行了廣泛的研究，并獲得可觀的結(jié)果。在神經(jīng)組織工程運(yùn)用方面，國(guó)內(nèi)外都有大量研究，在面神經(jīng)的缺損上首先應(yīng)用了絲素蛋白膜導(dǎo)管對(duì)缺損進(jìn)行了修復(fù)，修復(fù)效果比較理想[13]。我們也曾運(yùn)用絲素蛋白膜對(duì)大鼠的海綿體神經(jīng)缺損進(jìn)行修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，取得滿意結(jié)果。故絲素蛋白膜、神經(jīng)生長(zhǎng)因子在周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)上都有著一定的作用，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用絲素蛋白膜聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠的海綿體神經(jīng)缺損進(jìn)行了修復(fù)，結(jié)果表明絲素蛋白膜聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠海綿體神經(jīng)的修復(fù)、再生具有明顯的促進(jìn)作用，這為臨床上周圍神經(jīng)的損傷修復(fù)提供新的治療方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Sponge Nerve Injury Using Fibroin Membrane Joint Repair Nerve Growth Factor Experiments

Pang Yongbing,Wang Linlin?，Xiao Han
(Heze Medical College,Heze 274000,Shandong；*People's Hospital of Jiaxiang,Jiaxiang 272400,Shandong)

ObjectiveTo discuss Inside the penis sponge body damage combined with silk fibroin membrane the curative effect of nerve repair nerve growth factor.Methods36 healthy male SD rats were randomly divided into three groups,cavernous nerve cut group,the silk fibroin membrane joint nerve growth factor and silk fibroin membrane repair group.12 in each group.Cavernous nerve to cut off the set of simple cut bilateral cavernous nerve of rats,don't do other processing.Of silk fibroin membrane joint nerve growth factor group F rat cavernous nerve defect model,first and then use silk fibroin membrane bridge repair,30 μL local injection of nerve growth factor.Silk fibroin membrane repair group only with silk fibroin membrane for bridge repair the defect of the cavernous nerve.After 90 days on three groups of rats：apomorphine test,counting rate of SD rats penile erectile times,erectile.In the application of immunohistochemical method to detect the rat penis sponge tissue at the back of the nerves in the expression of nitric oxide synthase.The obtained data analyzed by variance,ttest andχ2test with the SPSS17.0 software.ResultsThe rate of penile erectile group A and group B, group A compared with group C,P＜0.005.Group B compared with group C,P＞0.05.Erectile times in group A and group B,group A compared with group C,P＜0.0005.Group B compared with group C,P＜0.001.To bridge the defect cavernous nerve end after repair will be homemade nerve growth factor 90 days NOS nerve fiber dyeing is most obvious.Number of positive fibers in group A and group B,group A and group C,group B compared with group C number,P＜0.0005.Con-clusionSilk fibroin membrane joint nerve growth factor of cavernous nerve repair and regeneration has an obvious role in promoting,for cavernous nerve defects and provides a new direction and experimental basis for clinical treatment.

Silk fibroin membrane/therapeutic use；Nerve growth factor/therapeutic use；Cavernous nerve injury/ therapy

R697.5

A

1008-4118（2017）01-0001-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2017.01.001

2016-11-25