張海容，史振華

(1.忻州師范學(xué)院 生化所，山西 忻州 034000； 2.材料與計算化學(xué)山西省高等學(xué)校重點實驗室，山西 忻州 034000)

綜合利用

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取沙棘籽粕中黃酮工藝

張海容1，2，史振華1

(1.忻州師范學(xué)院 生化所，山西 忻州 034000； 2.材料與計算化學(xué)山西省高等學(xué)校重點實驗室，山西 忻州 034000)

研究了沙棘籽粕中黃酮的超聲波輔助提取工藝。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對影響黃酮得率的超聲功率、提取時間、液料比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了二次多項式回歸方程的預(yù)測模型。結(jié)果表明：超聲波輔助提取沙棘籽粕中黃酮的最佳工藝條件為超聲功率60 W、提取時間20 min、液料比30∶1、提取溫度54℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)59%、提取次數(shù)2次，在最佳工藝條件下黃酮得率為7.11%，與模型理論值7.08%基本一致。

沙棘黃酮；超聲波輔助提取；響應(yīng)面法

沙棘為胡頹子科沙棘屬，多年生落葉灌木或喬木，含有豐富而復(fù)雜的天然活性成分[1-2]。每年有大量的沙棘籽被榨油，提油之后的沙棘籽粕多數(shù)用于牲畜飼料或被丟棄，而含有豐富黃酮類化合物的沙棘籽粕不僅污染環(huán)境，而且造成了沙棘黃酮資源的極大浪費。據(jù)文獻(xiàn)報道[3-6]，沙棘籽粕中含有蛋白質(zhì)、糖類化合物、脂肪類物質(zhì)、植物堿和黃酮類物質(zhì)等多種生理活性成分。沙棘黃酮具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和抗菌、抗病毒及增強免疫等多種生理功效[7]，開發(fā)和提取沙棘籽粕中豐富的黃酮類化合物意義重大。

黃酮類物質(zhì)的提取方法主要有浸提法[8]、索氏提取法[9]、微波提取法[10-11]，少數(shù)報道超聲提取黃酮[12]等，并通過單因素實驗確定最佳提取條件。然而單因素實驗無法考慮不同影響因素之間的相互作用對響應(yīng)值的影響，更無法預(yù)測最優(yōu)實驗條件下黃酮的最大得率[13-14]。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，本文采用響應(yīng)面分析法，對沙棘籽粕中黃酮的超聲波輔助提取工藝條件如超聲功率、提取時間、液料比、提取溫度等因素實現(xiàn)不同參數(shù)的優(yōu)化組合，建立了超聲波輔助提取沙棘籽粕中黃酮二次多項式回歸模型，為沙棘籽粕中黃酮資源更好地開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

沙棘籽粕，購自山西省岢嵐縣酸溜溜飲料廠。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京化學(xué)試劑公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇、無水乙醇，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

植物粉碎機；722型分光光度計，上海青華科技儀器有限公司；AB204-N型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取0.100 0 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，制成1.0 mg/mL儲備液，然后稀釋成100g/mL工作液；分別吸取蘆丁工作液1、2、3、4 mL和5 mL于10 mL的比色管中，按照1.2.2方法依次加入一定體積NaNO2、Al(NO3)3和NaOH溶液，用80%乙醇定容，靜置15 min，以試劑空白作參比，在最大吸收波長510 nm處測其吸光度，并以吸光度A為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：A=0.008 7C+0.013 9，R2=0.998 3。

1.2.2 沙棘籽粕中黃酮的提取與測定

準(zhǔn)確稱取沙棘籽粕干粉0.2 g于100 mL三角瓶中，加入一定體積及一定體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液為溶劑，超聲波提取、離心，取上清液。所有實驗重復(fù)2次，合并2次提取液，用95%乙醇定容到100 mL容量瓶中。吸取2 mL該溶液于10 mL比色管中，依次加入5% NaNO20.5 mL、10%Al(NO3)30.5 mL，再加入4%的NaOH溶液4 mL，用80%乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置15 min；在波長510 nm處測定吸光度，按回歸方程計算提取液中黃酮質(zhì)量濃度，并計算黃酮得率。黃酮得率的計算公式如下：

式中：c為沙棘籽粕提取液測得的黃酮質(zhì)量濃度，μg/mL；E為稀釋倍數(shù)；F為沙棘籽粕提取液體積，mL；W為沙棘籽粕干粉質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲功率的影響

在提取時間20 min、液料比30∶1、提取溫度55℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取次數(shù)2次條件下，不同超聲功率對黃酮得率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對黃酮得率的影響

由圖1可知，超聲功率達(dá)60 W時，黃酮得率最大；超聲功率超過60 W后，黃酮得率略有下降；當(dāng)超聲功率超過80 W時，黃酮得率略有上升，但變化不大。因此，確定提取沙棘籽粕中黃酮的最佳超聲功率為60 W。

2.1.2 提取時間的影響

在超聲功率60 W、液料比30∶1、提取溫度55℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取次數(shù)2次的條件下，不同提取時間對黃酮得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對黃酮得率的影響

由圖2可知，當(dāng)提取時間從10 min延長到20 min，黃酮得率迅速增大。提取時間超過 20 min 后，黃酮得率的總體變化趨勢不斷下降。因此，確定提取沙棘籽粕中黃酮的最佳提取時間為20 min。

2.1.3 液料比的影響

在超聲功率60 W、提取時間20 min、提取溫度55℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取次數(shù)2次的條件下，不同液料比對黃酮得率的影響見圖3。

由圖3可知，黃酮得率隨著液料比增大呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢。當(dāng)液料比超過30∶1后，黃酮得率隨液料比增大不斷下降；當(dāng)液料比超過50∶1時，黃酮得率略有上升，但變化不大?？紤]節(jié)省提取溶劑，確定提取最佳液料比為30∶1。

圖3 液料比對黃酮得率的影響

2.1.4 提取溫度的影響

在超聲功率60 W、提取時間20 min、液料比30∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取次數(shù)2次條件下，不同提取溫度對黃酮得率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對黃酮得率的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的增加，黃酮得率呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢。當(dāng)提取溫度達(dá)55℃時，黃酮得率最大。超過55℃時，隨提取溫度增大黃酮得率明顯減少，這可能與過高的溫度使乙醇溶劑揮發(fā)有關(guān)。因此，確定提取沙棘籽粕中黃酮的最佳提取溫度為55℃。

2.1.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

在超聲功率60 W、提取時間20 min、提取溫度55℃、液料比30∶1、提取次數(shù)2次條件下，不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響見圖5。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的影響

由圖5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，黃酮得率呈現(xiàn)先增大后逐漸減小的趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～60%，黃酮得率呈現(xiàn)平緩變化，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，黃酮得率最大。這可能與沙棘籽粕中黃酮和提取溶劑的極性有關(guān)[15]。因此，確定提取沙棘籽粕中黃酮的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.2 響應(yīng)面實驗

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，采用五因素三水平的響應(yīng)面分析法，確定超聲法輔助提取沙棘籽粕中黃酮的最佳工藝條件。響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平及編碼

2.2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

以黃酮得率(Y)為響應(yīng)值，對超聲波輔助提取沙棘籽粕中黃酮的各個影響因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面實驗結(jié)果見表2，回歸模型顯著性及方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

續(xù)表2

實驗號 A B C D EY/%3100-1016.1832001016.2133-1000-16.34341000-16.2435-100016.5436100016.34370-10-106.2538010-106.04390-10106.1540010106.2141000006.8842000007.1143000007.0744000006.8745000007.1146000007.18

表3 回歸模型顯著性及方差分析

以黃酮得率為響應(yīng)值(Y)，得到黃酮得率對各影響因素的二次多項式回歸模型為：Y=7.04-0.011A-0.005B-0.056C-0.045D+0.017E-0.005AB-0.007 5AC+0.17AD-0.025AE+0.07BC+0.067BD+0.057BE+0.12CD+0.062CE-0.002 5DE-0.25A2-0.17B2-0.44C2-0.53D2-0.35E2。對多元二次回歸方程取一階偏導(dǎo)得零，得到A=-0.037 4，B=-0.032，C=-0.069 7，D=-0.056 2，E=0.016。故最佳超聲功率為60 W，提取時間為20 min，液料比為30∶1，提取溫度為54℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為59%，提取次數(shù)為2次。

由表3可知，本實驗所選模型差異極顯著(模型的P<0.01)，說明回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其應(yīng)變量與全體自變量之間的線性關(guān)系是顯著的，實驗方法是可靠的；變異系數(shù)(2.41%)較低，說明實驗有良好的穩(wěn)定性；模型失擬項P=0.291 8>0.05，差異不顯著；模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.924 0，說明實驗值與理論模型有92.40% 是相符的，該模型與實驗擬合較好。

由表3還可知，模型一次項不顯著，交互項AD差異顯著，其余交互項差異不顯著；各因素的二次項均差異極顯著。通過P值分析可知，各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>超聲功率>提取時間>液料比，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率的主效應(yīng)明顯。

2.2.3 驗證實驗

在響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳條件下對沙棘籽粕進(jìn)行超聲波輔助提取實驗，黃酮得率達(dá)7.11%，與理論黃酮得率7.08%基本一致，相對誤差0.42%(n=3)?？梢?，驗證值與回歸方程理論值相吻合。

2.2.4 超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)浸提法對黃酮得率影響比較

超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)浸提法的提取條件及黃酮得率的對比結(jié)果見表4。

表4 超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)浸提法提取沙棘籽粕中

由表4可知，超聲波輔助提取沙棘籽粕中的黃酮，其得率優(yōu)于傳統(tǒng)浸提法。可能的原因是超聲波能產(chǎn)生強烈空化效應(yīng)和攪拌作用，從而增加溶劑穿透力，加速黃酮溶出，黃酮得率較高；而傳統(tǒng)浸提法很難破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，提取時間較長。因此，超聲波輔助提取具有一定的優(yōu)越性。

3 結(jié) 論

(1)采用響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘籽粕中黃酮的超聲波輔助提取工藝，得到最佳工藝條件為：超聲功率60 W，液料比30∶1，提取時間20 min，提取溫度54℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)59%，提取次數(shù)2次。在最佳條件下，黃酮得率為7.11%，與理論值(7.08%)的相對誤差為0.42%。

(2)本實驗采用超聲波輔助提取沙棘籽粕中的黃酮，其得率優(yōu)于傳統(tǒng)浸提法，研究結(jié)果對沙棘籽粕綜合利用和藥物開發(fā)研究具有一定的參考價值。

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Optimization of ultrasound-assisted extraction of flavonoids from seabuckthorn seed meal by response surface methodology

ZHANG Hairong1，2， SHI Zhenhua1

(1.Laboratory of Biochemical Analysis， Xinzhou Teachers University， Xinzhou 034000， Shanxi， China；2.Higher Education Key Labortory of Materials and Computational Chemistry in Shanxi Province，Xinzhou 034000， Shanxi， China)

The ultrasound-assisted extraction of flavonoids from seabuckthorn seed meal was investigated. Based on single factor experiment， the factors such as ultrasonic power， extraction time， ratio of liquid to material， extraction temperature and volume fraction of ethanol， influencing yield of flavonoids were optimized by response surface methodology， and predictive polynomial quadratic equation model was established. The results showed that the optimal extraction conditions were obtained as follows：ultrasonic power 60 W， extraction time 20 min， ratio of liquid to material 30∶1， extraction temperature 54℃， volume fraction of ethanol 59%， extraction times twice. Under these conditions， the yield of flavonoids reached 7.11%， and it was consistent with model theoretical value of 7.08%.

seabuckthorn flavonoids； ultrasound-assisted extraction； response surface methodology

2016-05-24；

2016-12-09

忻州師范學(xué)院重點學(xué)科建設(shè)項目(xk201402)；忻州師范學(xué)院應(yīng)用化學(xué)創(chuàng)新實踐基地項目

張海容(1957)，男，教授，博士，研究方向為有機分析(E-mail)hairong1015@163.com。

TS229；Q58

A

1003-7969(2017)03-0117-05