張?jiān)礉?，胡迎芬，馬愛(ài)國(guó)，王艷平，劉 青

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021； 2.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266021)

油料蛋白

納豆桿菌固態(tài)發(fā)酵花生粕的工藝條件研究

張?jiān)礉?，胡迎芬2，馬愛(ài)國(guó)1，王艷平1，劉 青1

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021； 2.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266021)

以納豆桿菌固態(tài)發(fā)酵花生粕產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率為指標(biāo)，考察底物配比、接菌量、料液比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響，并通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最佳發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明最佳發(fā)酵條件為：底物配比m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麩皮)=7∶1.5∶1.5，接菌量0.3%，料液比10∶3，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間48.7 h。在最佳條件下發(fā)酵，上清液40倍稀釋液對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到74.7%，10倍稀釋液對(duì)羥自由基清除率高達(dá)85.2%，表明該條件下制備的發(fā)酵產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性。

花生粕；納豆桿菌；發(fā)酵產(chǎn)物；工藝條件；抗氧化活性

在我國(guó)花生的消耗量巨大，主要用于壓榨產(chǎn)油，而后形成大量的花生粕?；ㄉ芍泻腥梭w所需的多種氨基酸，且蛋白質(zhì)與動(dòng)物蛋白相近，可消化性高。相比于豆科植物，其胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較少，因此具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。同時(shí)花生肽具有很好的抗氧化作用，研究表明1 mg/mL的花生肽的抗氧化性相當(dāng)于0.02 mg/mL的VE[2]，因此從花生粕能得到抗氧化活性較高的產(chǎn)物，進(jìn)而能夠清除自由基，達(dá)到延緩衰老，預(yù)防疾病的目的。

有研究表明經(jīng)微生物發(fā)酵，花生粕中粗蛋白質(zhì)含量可由原來(lái)的48.31%提高到50.58%，必需氨基酸含量可提高16.43%，這表明微生物發(fā)酵能提高花生粕的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[3]。花生粕經(jīng)微生物發(fā)酵后抗氧化性能可得到提高，這對(duì)提高花生粕的附加值和利用價(jià)值具有重要意義。

納豆桿菌發(fā)酵后的產(chǎn)物具有多種有益的功能，如抗氧化、抗腫瘤、降血壓及溶血栓等，因此納豆桿菌是一種極具應(yīng)用價(jià)值的菌種[4-8]。本實(shí)驗(yàn)選用納豆桿菌發(fā)酵花生粕，利用微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶來(lái)降解底物中的蛋白質(zhì)，從而得到相應(yīng)的多肽和氨基酸等活性成分，提高花生粕的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑

川秀納豆桿菌(北京川秀公司)，市售花生粕，大豆粕，麩皮，DPPH(美國(guó)Sigma公司)，F(xiàn)eSO4、H2O2、水楊酸、無(wú)水乙醇、K3Fe(CN)6、FeCl3、三氯乙酸等試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：NaCl 5 g/L，牛肉浸膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂粉2 g/L，pH 7.4～7.6，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：一定質(zhì)量比的花生粕、大豆粕和麩皮，1.5%的蔗糖，0.4%MgSO4和0.4%CaCl2，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 儀器

電子天平，HZQ-X100A型恒溫振蕩器，壓力蒸汽滅菌器，離心機(jī)，721G可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程

菌種活化→初篩→復(fù)篩→選得活性最強(qiáng)的菌株→單因素實(shí)驗(yàn)→響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)→花生粕最優(yōu)發(fā)酵條件[9]。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基礎(chǔ)發(fā)酵條件：發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接菌量 0.5%，料液比10∶5，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。該條件下適當(dāng)調(diào)整進(jìn)行不同底物配比(m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麩皮)為7∶3∶0、7∶0∶3、7∶2∶1、7∶1.5∶1.5、7∶1∶2)、接菌量(0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%)、料液比(10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5、10∶6)、發(fā)酵溫度(29、33、37、41、45℃)、發(fā)酵時(shí)間(18、24、30、36、42、48、54 h)的單因素實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵結(jié)束后，加生理鹽水，4℃浸提2 h，3 000 r/min離心30 min，取上清液適當(dāng)稀釋?zhuān)瑴y(cè)定多肽含量(A值)以及DPPH自由基清除率。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，控制底物配比和料液比，研究發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)以及接菌量(C)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除率的影響。

1.2.4 多肽含量的測(cè)定

參照Cotton等[10]方法。

1.2.5 抗氧化活性的測(cè)定

羥自由基清除率測(cè)定，參照參考文獻(xiàn)[11]。DPPH自由基清除率測(cè)定，參照Orhan等[12]的方法。鐵還原力測(cè)定，參照參考文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 底物配比對(duì)發(fā)酵效果的影響(見(jiàn)圖1)

注：底物配比1～5分別代表m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麩皮)為7∶3∶0、7∶0∶3、7∶2∶1、7∶1.5∶1.5、7∶1∶2。

圖1 底物配比對(duì)發(fā)酵效果的影響

由圖1可見(jiàn)，當(dāng)?shù)孜锱浔萴(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麩皮)= 7∶1.5∶1.5時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量(A=0.332)和DPPH自由基清除率(38%)均最高，故最優(yōu)底物配比m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麩皮)為7∶1.5∶1.5。

2.1.2 接菌量對(duì)發(fā)酵效果的影響(見(jiàn)圖2)

圖2 接菌量對(duì)發(fā)酵效果的影響

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)接菌量為0.3%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量(A=0.35)和DPPH自由基清除率(49%)均最高，故最優(yōu)接菌量為0.3%。

2.1.3 料液比對(duì)發(fā)酵效果的影響(見(jiàn)圖3)

圖3 料液比對(duì)發(fā)酵效果的影響

由圖3可見(jiàn)，當(dāng)料液比為10∶3時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量(A=0.382)和DPPH自由基清除率(52%)均最高，故最優(yōu)料液比為10∶3。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響(見(jiàn)圖4)

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

不同溫度下酶的反應(yīng)速率不同。一般酶的反應(yīng)速率隨溫度升高而增大，生長(zhǎng)代謝加快，生產(chǎn)期提前。但酶很容易因溫度過(guò)高而失去活性，或表現(xiàn)為菌體的衰老，影響最終物質(zhì)代謝[14]。由圖4可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵溫度為37℃時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量(A=0.39)和DPPH自由基清除率(58%)均最高，故最優(yōu)發(fā)酵溫度為37℃。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響(見(jiàn)圖5)

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響

反應(yīng)體系中納豆桿菌的數(shù)量受發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)短的影響，進(jìn)而影響基質(zhì)底物的分解程度[14]。由圖5可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量(A=0.465)和DPPH自由基清除率(66%)均最高，故最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定發(fā)酵底物配比和料液比，以發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除率(X)為指標(biāo)，研究發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)以及接菌量(C)3個(gè)因素對(duì)發(fā)酵效果的影響。因素水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面方差分析

由統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到相應(yīng)預(yù)測(cè)值與A、B、C3個(gè)因素的二次回歸方程：

X=74.60+3.95A+3.26B-3.16C-5.43AB+3.82AC+5.10BC-13.90A2-13.73B2-12.23C2

表3為DPPH自由基清除率模型回歸與方差分析結(jié)果。

表3 模型回歸與方差分析結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面交互作用

圖6為各因素交互作用對(duì)DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖。由圖6可見(jiàn)，在本實(shí)驗(yàn)水平范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的升高，接菌量增加和發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率均呈先升高后下降。與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和接菌量?jī)梢蛩氐慕换プ饔蔑@著。

圖6 各因素交互作用對(duì)DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖

2.2.4 最佳發(fā)酵條件的確定與驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆治?，得到納豆桿菌固態(tài)發(fā)酵花生粕的最佳工藝條件為：底物配比m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麩皮)=7∶1.5∶1.5、料液比10∶3、發(fā)酵時(shí)間48.7 h、發(fā)酵溫度37℃、接菌量0.3%，DPPH自由基清除率的預(yù)測(cè)值為75.1%。為驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，做3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在最佳發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行發(fā)酵并測(cè)定DPPH自由基清除率平均值為74.7%，與理論預(yù)測(cè)值相比相對(duì)誤差在1%以?xún)?nèi)。表明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c實(shí)際情況擬合較好。

與未發(fā)酵的花生粕相比較，發(fā)酵前后對(duì)羥自由基的清除率分別為6%、85.2%，DPPH自由基清除率分別為4%、74.7%，多肽含量(A值)分別為0.07、0.467，鐵還原力(A值)分別為0.063、0.331?？梢?jiàn)發(fā)酵后花生粕提取物的多肽含量以及抗氧化活性比發(fā)酵前增加了幾倍到十幾倍不等。

3 結(jié) 論

納豆桿菌固態(tài)發(fā)酵花生粕的最佳工藝條件為：底物配比m(花生粕)∶m(大豆粕)∶m(麩皮)= 7∶1.5∶1.5，發(fā)酵時(shí)間48.7 h，發(fā)酵溫度37℃，接菌量0.3%，料液比10∶3。在最佳條件下發(fā)酵，得到上清液40倍稀釋液對(duì)DPPH自由基清除率74.7%，10倍稀釋液對(duì)羥自由基清除率高達(dá)85.2%，多肽含量(A值)和鐵還原力(A值)分別為0.467、0.331，發(fā)酵后大大提高了花生粕中多肽和抗氧化物的含量。采用納豆桿菌固態(tài)發(fā)酵花生粕為開(kāi)發(fā)具有高抗氧化性的健康食品提供了切實(shí)可行的途徑，得到的產(chǎn)物有較高的應(yīng)用價(jià)值和意義。

[1] 張巖，肖更生.花生粕的應(yīng)用進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2006(8):197-198.

[2] 王建化,熊柳,孫高飛.花生抗氧化活性肽制取工藝的研究[J].中國(guó)油脂，2008,33(6)：15-19.

[3] 蔡國(guó)林，鄭兵兵，王剛,等.微生物發(fā)酵提高花生粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的初步研究[J].中國(guó)油脂,2010,35(5):31-34.

[4] 任曉靜，蔡國(guó)林，朱德偉,等.花生粕飼用品質(zhì)改善的研究[J].中國(guó)油脂，2013,38(4)：18-21.

[5] 王溢，劉天倫，張文婧.花生肽的特性與應(yīng)用[J].中國(guó)食品工業(yè)，2015(1)：48-50.

[6] 明強(qiáng)強(qiáng).微生物固態(tài)發(fā)酵花生粕制備抗氧化肽的研究[D].濟(jì)南:山東師范大學(xué),2014.

[7] 徐會(huì)茹,初麗君,李秋,等.花生粕固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及品質(zhì)分析[J].糧食與食品工業(yè),2015,22(6):38-40,43.

[8] 劉冬梅，陳浩，胡小慧,等.花生粕的枯草芽孢桿菌BS H001發(fā)酵及產(chǎn)物性質(zhì)[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,42(11):129-134.

[9] 張友維,張暉,王立,等.枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備花生多肽及其自由基清除活力的研究[J].中國(guó)油脂,2011,36(10):25-29.

[10] COTTON F，DELOBBE E，GULBIS B. Assessment of a biuret method without concentration step for total protein determination in cerebrospinal fluid[J]. Clin Biochem，1997,30(4)：313-314.

[11] SMIRNOFF N, CUMBES Q J. Hydroxyl radial scavenging activity of compatible solutes [J].Phytochemistry, 1989,28(4):1057-1060.

[12] ORHAN I, KARTAL M, ABU-ASAKER M, et al. Free radical scavenging properties and phenolic characterization of some edible plants [J]. Food Chem, 2009, 114(1): 276-281.

[13] HWANG J Y, SHYU Y S, WANG Y T, et al. Antioxidative properties of protein hydrolysate from defatted peanut kernels treated with esperase[J]. Lebensm-Wiss Technol, 2010, 43(2):285-290.

[14] 祁紅兵,宋軍霞.納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆渣上清液的抗氧化功能研究[J].中國(guó)食品添加劑,2014(3):104-108.

Solid state fermentation conditions of peanut meal byBacillusnatto

ZHANG Yuanjie1, HU Yingfen2, MA Aiguo1,WANG Yanping1, LIU Qing1

(1.Medical College, Qingdao University, Qingdao 266021, Shandong, China；2.School of Life Science, Qingdao University, Qingdao 266021, Shandong, China)

With scavenging rate of solid state fermented peanut meal byBacillusnattoon DPPH free radical as index, the effects of ratio of subtrates, inoculation amount, ratio of material to liquid, fermentation temperature and fermentation time on fermentation result were investigated, and the optimal fermentation conditions were determined by response surface methodology. The results showed that the optimal fermentation conditions were obtained as follows：mass ratio of peanut meal to soybean meal to bran 7∶1.5∶1.5, inoculation amount 0.3%, ratio of material to liquid 10∶3, fermentation temperature 37℃ and fermentation time 48.7 h. Under these conditions, the scavenging rate of supernatant diluted by 40 times on DPPH free radical was 74.7%, and the scavenging rate of supernatant diluted by 10 times on hydroxy radical reached 85.2%, indicating that the antioxidant activity of fermentation product was higher.

peanut meal;Bacillusnatto; fermentation product; process condition; antioxidant activity

2016-07-28；

2016-11-30

山東省科技廳發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(2014GSF120011)

張?jiān)礉?1990)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称沸l(wèi)生與保健(E-mail)370793055@qq.com。

胡迎芬，教授，碩士生導(dǎo)師(E-mail)qingdahyf 2006@163.com。

TQ92；TS201.3

A

1003-7969(2017)03-0099-04