肖信錦，李陽洋，鐘盛華

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，南昌330045; 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 國土資源與環(huán)境學(xué)院，南昌330045)

油料蛋白

超聲波輔助SDS反膠束體系前萃米糠蛋白的工藝研究

肖信錦1，李陽洋2，鐘盛華1

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，南昌330045; 2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 國土資源與環(huán)境學(xué)院，南昌330045)

利用超聲波輔助SDS(十二烷基磺酸鈉)/異辛烷-正辛醇反膠束體系萃取米糠蛋白。主要考察了料液比、SDS質(zhì)量濃度、WO值、超聲功率、前萃時間、增溶水pH和KCl濃度對米糠蛋白前萃率的影響。通過正交實驗設(shè)計優(yōu)化得到超聲波輔助最佳萃取工藝條件為料液比0.015∶1、SDS質(zhì)量濃度0.08 g/mL、WO值30、超聲功率225 W、前萃時間40 min、增溶水pH 7.5和KCl濃度0.25 mol/L。在最佳條件下，米糠蛋白前萃率為86.96%，比常規(guī)振蕩萃取的高17.14個百分點。

米糠蛋白；超聲波輔助；反膠束萃取

在稻谷加工成精米的過程中，除掉外殼外，還會有約占稻谷總質(zhì)量6%的胚、糊粉層和外層胚乳產(chǎn)生，其混合物稱之為米糠，也可稱之為“米珍”或是“米粕”[1]。由于加工條件的限制，米糠中會混有少量的果皮、種皮及灰塵等。研究[2-3]表明，米糠富含各種營養(yǎng)物質(zhì)，新鮮米糠含12%～18%的蛋白質(zhì)和14%～24%的油脂，此外還含有生育酚、生育三烯酚、脂多糖、谷維素、二十八碳烷醇、α-硫辛酸、角鯊烯、神經(jīng)酰胺等多種天然抗氧化劑和生物活性物質(zhì)。根據(jù)國家統(tǒng)計局糧食產(chǎn)量公告[4]，我國2016年稻谷產(chǎn)量20 693.4萬t，單就米糠中蛋白質(zhì)與油脂的利用而言，保守估計可提供約160萬t米糠油和140萬t米糠蛋白，對我國而言是一筆重要的資源與財富。

1989年Leser等[5]成功利用AOT/異辛烷反膠束體系對大豆和向日葵的油脂與蛋白質(zhì)進(jìn)行了萃取分離實驗。張淑霞[6]、高艷秀[7-8]等對大豆、花生等主要油料作物的萃取分離效果進(jìn)行了研究，其萃取工藝流程較為成熟，并與超聲波和微波等物理方法相結(jié)合的研究也有所報道[9]。陳復(fù)生等[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過超聲波輔助SDS/異辛烷-正辛醇反膠束體系萃取，大豆蛋白萃取率可提高23%。但利用反膠束體系對米糠油與米糠蛋白同步分離的研究還未見報道。

本研究利用超聲波輔助SDS/異辛烷-正辛醇反膠束體系對米糠蛋白進(jìn)行前萃，研究了料液比(米糠質(zhì)量與反膠束溶液體積比，下同)、SDS質(zhì)量濃度、WO值、超聲功率、前萃時間、增溶水pH和KCl濃度對米糠蛋白前萃率的影響，通過正交實驗設(shè)計確定了SDS反膠束萃取米糠蛋白的最佳前萃工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮米糠，由南昌市蔣巷鎮(zhèn)長期精制米廠提供；牛血清蛋白，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；SDS(十二烷基磺酸鈉)、異辛烷、正辛醇、十二水合磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、均為分析純。

AR2140型電子分析天平，HC-200型高速多功能粉碎機，UV755B型紫外分光光度計，DGX-9053B-1 型鼓風(fēng)干燥器，Hitachi(日立)高速冷凍離心機，K-9860全自動凱氏定氮儀，EM-F2116EB1型微波爐，KS型康氏振蕩器，KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗機。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠預(yù)處理

在米糠存儲過程中米糠中脂肪酶保持著很高的活性，易造成酸敗，因此要對米糠中的脂肪酶進(jìn)行失活處理。微波穩(wěn)定法[11]是一種簡單易操作的方法。將新鮮米糠粉碎過40目篩后，按4.5 kW/kg在微波爐內(nèi)處理150 s，使米糠中的脂肪酶失活，后將米糠放入干燥箱中40℃干燥1 h，封口放入冰箱4℃保存。

1.2.2 米糠中主要成分測定

粗蛋白質(zhì)含量測定，GB 5009.5—2010凱氏定氮法；粗脂肪含量測定，GB/T 14772—2008索氏抽提法；水分含量測定，GB 5009.4—2010灼燒重量法；灰分含量測定，GB 5009.3—2010常壓干燥法。

1.2.3 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

通過紫外分光光度法[12]測定前萃液中的米糠蛋白含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，通過測定不同質(zhì)量濃度牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液在280 nm處的吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到y(tǒng)=0.652 3x-0.011 1(R2=0.998 3)。

1.2.4 SDS/異辛烷-正辛醇反膠束溶液的配制

用電子分析天平(精確到0.000 1 g)稱取1.6 g SDS粉末，置于100 mL錐形瓶中，加入異辛烷-正辛醇(體積比4∶1)混合液，超聲25 min使SDS充分溶解，后加入適量質(zhì)量濃度的KCl磷酸緩沖液，繼續(xù)超聲10 min，溶液變?yōu)槌吻逋该骷礊榉茨z束溶液。

1.2.5 反膠束體系中含水量WO值的測定

采用卡爾費休法[13]，計算公式如下：

WO值=反膠束溶液中增溶水分的摩爾數(shù)/反膠束溶液中表面活性劑的摩爾數(shù)

1.2.6 SDS反膠束法前萃米糠蛋白工藝流程

取一定量處理的米糠樣品于具塞錐形瓶中，按一定的料液比加入SDS反膠束溶液，在超聲波輔助條件下進(jìn)行萃取，完成后轉(zhuǎn)入離心機中4 000 r/min離心10 min，取出靜置后取上清液用紫外分光光度計在280 nm波長下以萃取前反膠束溶液為空白測定前萃液中的蛋白質(zhì)含量。

1.2.7 米糠蛋白前萃率的計算

前萃率=反膠束前萃液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/(樣品加入量×蛋白質(zhì)含量)×100%

1.2.8 單因素實驗

按1.2.6方法，通過控制單一變量，分別研究SDS反膠束前萃米糠蛋白過程中超聲功率、料液比、SDS質(zhì)量濃度、WO值、前萃時間、增溶水pH和KCl濃度對米糠蛋白前萃率的影響。單因素實驗中除單一變量外其他影響因素條件不變，控制各因素條件分別為：SDS質(zhì)量濃度0.08 g/mL、WO值30、料液比0.02∶1、超聲功率200 W、前萃時間30 min、增溶水pH 7.0和 KCl 濃度0.25 mol/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠中的主要組成成分

測得米糠中主要組成成分如表1所示。

表1 米糠主要組成成分 %

從表1可以看出，米糠中粗脂肪和粗蛋白質(zhì)含量較高，具有進(jìn)一步開發(fā)利用的價值。

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲功率對米糠蛋白前萃率的影響(見圖1)

圖1 超聲功率對米糠蛋白前萃率的影響

從圖1可以看出，米糠蛋白前萃率隨著超聲功率的增加呈先增大后減小的趨勢。這可能是因為超聲波所產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機械效應(yīng)等可以對蛋白質(zhì)的萃取產(chǎn)生推動作用，通過破碎組織細(xì)胞壁和改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)從而促使米糠蛋白更快浸出和進(jìn)入反膠束溶液中，當(dāng)超聲功率偏小時對米糠蛋白的萃取不夠充分，功率過大時又會促使其他非蛋白質(zhì)物質(zhì)的溶出，反倒阻礙了反膠束溶液對蛋白質(zhì)的萃取。因此，選擇超聲功率為225 W。

2.2.2 料液比對米糠蛋白前萃率的影響(見圖2)

圖2 料液比對米糠蛋白前萃率的影響

從圖2可以看出，米糠蛋白前萃率隨著料液比的增加呈先升高后降低的趨勢，在料液比0.015∶1處有最優(yōu)值。這可能是因為反膠束內(nèi)核中“水池”數(shù)量是一定的，溶解蛋白質(zhì)的能力也有限，米糠樣品量過少時萃取的蛋白質(zhì)的量也很少，但過多的樣品加入反而又使蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠束內(nèi)核“水池”產(chǎn)生了競爭機制，降低了萃取率。因此，選擇料液比為0.015∶1。

2.2.3 SDS質(zhì)量濃度對米糠蛋白前萃率的影響(見圖3)

從圖3可以看出，米糠蛋白前萃率隨著SDS質(zhì)量濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，這主要是因為表面活性劑在有機溶劑中形成反膠束溶液時，存在表面活性劑的質(zhì)量濃度臨界值，低于該臨界值時增大表面活性劑的質(zhì)量濃度可以提高反膠束內(nèi)核的“水池”數(shù)量，溶解更多蛋白質(zhì)從而提高前萃率，當(dāng)表面活性劑質(zhì)量濃度高于該臨界值時反膠束內(nèi)核的“水池”數(shù)量已經(jīng)達(dá)到最大值，過高的表面活性劑質(zhì)量濃度會使溶液黏度增大，反膠束基團與蛋白質(zhì)分子間的碰撞機會減少，甚至?xí)?dǎo)致反膠束體系被破壞，不利于蛋白質(zhì)的提取。因此，選擇SDS質(zhì)量濃度為0.08 g/mL。

圖3 SDS質(zhì)量濃度對米糠蛋白前萃率的影響

2.2.4WO值對米糠蛋白前萃率的影響(見圖4)

圖4 WO值對米糠蛋白前萃率的影響

從圖4可以看出，米糠蛋白前萃率隨著WO值的增大呈先升高后降低的趨勢。WO值反映了反膠束體系水池中的含水量與水池半徑，隨著WO值的增大，反膠束體系“水池”也在增大，米糠蛋白更容易萃取進(jìn)入“水池”中，因此前萃率也增大，但當(dāng)WO值過大時，反膠束溶液會變得不穩(wěn)定，導(dǎo)致前萃率下降。因此，選擇WO值為25。2.2.5 增溶水pH對米糠蛋白前萃率的影響(見圖5)

圖5 增溶水pH對米糠蛋白前萃率的影響

從圖5可以看出，米糠蛋白前萃率隨著增溶水pH的增加呈先升高后降低的趨勢，增溶水的最適pH為7.5。一般而言pH通過影響蛋白質(zhì)表面的電荷狀態(tài)引起前萃的變化，SDS作為陰離子表面活性劑，形成的反膠束體系只有當(dāng)水相pH低于蛋白質(zhì)的等電點時，米糠蛋白才能進(jìn)入反膠束，而米糠蛋白的等電點為4.5左右，說明米糠蛋白與SDS之間的靜電吸引力并非反膠束萃取蛋白質(zhì)的主要推動力，其萃取動力學(xué)機理仍需進(jìn)一步研究。

2.2.6 前萃時間對米糠蛋白前萃率的影響(見圖6)

圖6 前萃時間對米糠蛋白前萃率的影響

從圖6可以看出，米糠蛋白前萃率隨著前萃時間的延長呈先升高后降低的趨勢，在前萃10 min時，米糠蛋白前萃率就超過了75%，說明超聲波的介入能在短時間內(nèi)得到較高的前萃率；當(dāng)前萃時間過長時，前萃率顯著下降，這可能是因為超聲作用下體系溫度會逐漸升高，短時間內(nèi)可促進(jìn)分子熱運動的增加提高前萃率，時間過長溫度過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，前萃率反而下降。因此，選擇前萃時間為40 min。

2.2.7 KCl濃度對米糠蛋白前萃率的影響(見圖7)

圖7 KCl濃度對米糠蛋白前萃率的影響

從圖7可以看出，米糠蛋白前萃率隨著KCl濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，且在KCl濃度為0.25 mol/L 時有最優(yōu)值，超過該濃度后萃取率迅速下降。KCl溶液作為鹽溶液在適當(dāng)濃度時可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解以提高前萃率，但是當(dāng)鹽濃度過高時則會造成蛋白質(zhì)的析出產(chǎn)生“鹽析”現(xiàn)象使前萃率下降。因此，選擇KCl濃度為0.25 mol/L。

2.3 正交實驗優(yōu)化

在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用正交實驗設(shè)計對超聲波輔助SDS反膠束體系前萃工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以米糠蛋白前萃率為考察指標(biāo)，以單因素實驗中的7個因素為考察因素，按L18(37)正交表進(jìn)行正交實驗設(shè)計，正交實驗因素水平見表2，正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表2 正交實驗因素水平

表3 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表3

實驗號ABCDEFG前萃率/%16313231285.6717321312378.1318332123181.56k176.1773.7274.8675.2177.5777.9073.49k280.0277.2281.3781.0077.8679.3282.92k376.5981.8576.5676.5977.3675.5776.38R 3.85 8.13 6.51 5.79 0.50 3.75 9.43

由表3可知，對超聲波輔助SDS/異辛烷-正辛醇反膠束體系萃取米糠蛋白前萃率影響順序依次為KCl濃度>WO值>料液比>超聲功率>SDS質(zhì)量濃度>增溶水pH>前萃時間，萃取米糠蛋白的最優(yōu)工藝條件為A2B3C2D2E2F2G2，利用對前萃率影響最小的前萃時間作為誤差項進(jìn)行方差分析，得到正交實驗方差分析結(jié)果見表4。

表4 正交實驗方差分析結(jié)果

由表4可知，除前萃時間外，KCl濃度、WO值、料液比、超聲功率、SDS質(zhì)量濃度和增溶水pH對米糠蛋白前萃率均影響顯著。對最佳工藝條件A2B3C2D2E2F2G2，即SDS質(zhì)量濃度0.08 g/mL、WO值30、料液比0.015∶1、超聲功率225 W、前萃時間40 min、增溶水pH 7.5和KCl濃度0.25 mol/L條件下進(jìn)行驗證實驗，米糠蛋白前萃率平均為86.96%。而相同工藝條件下采用常規(guī)振蕩法得到的米糠蛋白前萃率為69.82%，前萃效果有了明顯提高。

3 結(jié) 論

通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化得到超聲波輔助SDS/異辛烷-正辛醇反膠束體系前萃米糠蛋白的最佳工藝條件為SDS質(zhì)量濃度0.08 g/mL、WO值30、料液比0.015∶1、超聲功率225 W、前萃時間40 min、增溶水pH 7.5和KCl濃度0.25 mol/L，該工藝條件下米糠蛋白的前萃率為86.96%，比常規(guī)振蕩萃取前萃率高17.14個百分點。

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Forward extraction of rice bran protein by SDS reverse micelles assisted by ultrasound

XIAO Xinjin1, LI Yangyang2, ZHONG Shenghua1

(1.College of Science, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China；2. College of Land Resources and Environmental Science, Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045, China)

Rice bran protein was extracted using sodium dodecyl sulfonate(SDS)/isooctane-n-octanol assisted by ultrasound. The effects of ratio of material to liquid, mass concentration of SDS, water content(WO), ultrasonic power, forward extraction time, water pH and KCl concentration on the forward extraction rate of rice bran protein were investigated. The results showed that the optimal ultrasound-assisted extraction conditions were obtained by orthogonal experiment as follows: ratio of material to liquid 0.015∶1, mass concentration of SDS 0.08 g/mL, water content(WO) 30, ultrasonic power 225 W, forward extraction time 40 min, water pH 7.5, KCl concentration 0.25 mol/L. Under these conditions, the forward extraction rate of rice bran protein was 86.96%, increasing by 17.14 percentage points than forward extraction rate of common oscillation extraction.

rice bran protein；ultrasound-assist； reverse micelles extraction

2016-07-21；

2016-12-24

肖信錦(1990)，男，碩士研究生，研究方向為生物分離(E-mail)xiaoxinjin073@126.com。

鐘盛華，教授(E-mail)zhongsh0805@126.com。

TQ936.2；TS201.1

A

1003-7969(2017)03-0103-05