張紅玉，王成章，2，原姣姣，張昌偉，王志宏

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室，南京210042；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京100091)

綜合利用

牡丹籽殼中白藜蘆醇的分離及結(jié)構(gòu)表征

張紅玉1，王成章1，2，原姣姣1，張昌偉1，王志宏1

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室，南京210042；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京100091)

采用乙酸乙酯萃取牡丹籽殼70%乙醇提取物，獲得牡丹籽殼乙酸乙酯部位提取物。采用硅膠色譜柱將其分離，然后采用高效液相色譜(HPLC)、紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)和核磁共振譜(NMR)等波譜技術(shù)對(duì)分離獲得的白藜蘆醇進(jìn)行鑒定和結(jié)構(gòu)表征。結(jié)果表明：分離所得為較高純度的白藜蘆醇單體，純度為96.25%。

牡丹籽殼；白藜蘆醇；分離；結(jié)構(gòu)表征

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)又稱為芪三酚，非黃酮類多酚化合物。白藜蘆醇(C14H12O3)結(jié)構(gòu)為3′，4，5′-三羥基-1，2-二苯乙烯(3′，4，5′-tri-hydroxylstillbene)，無(wú)色針狀晶體。白藜蘆醇有順式和反式兩種結(jié)構(gòu)，植物中主要以反式結(jié)構(gòu)存在。白藜蘆醇是一種天然的植物抗毒素，廣泛存在于紅葡萄皮、花生、桑葚以及其他一些藥用植物中，其中在種皮中含量極高。王崑侖等[1]研究發(fā)現(xiàn)紫斑牡丹的葉、側(cè)枝、莖以及根中均不含白藜蘆醇，但是紫斑牡丹籽和果莢中卻含有白藜蘆醇，其含量分別為0.87%和0.26%。研究還發(fā)現(xiàn)紫斑牡丹籽中白藜蘆醇的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于花生以及巨峰葡萄的各個(gè)部位中的含量。有研究人員從牡丹籽中分離和鑒定出了反式白藜蘆醇[2-5]。近年來(lái)，隨著牡丹籽油產(chǎn)業(yè)的興起，產(chǎn)生了大量的牡丹籽殼副產(chǎn)物。牡丹籽殼部分被用作肥料，但是更多的是被丟棄，利用率極低。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于從牡丹籽殼中提取高附加值白藜蘆醇的研究報(bào)道極少，僅僅研究了其中芍藥苷和丹皮酚的檢測(cè)方法。深度開發(fā)豐富且廉價(jià)的牡丹籽殼資源，獲得較高純度且具有生物活性的物質(zhì)——白藜蘆醇，不僅能夠變廢為寶，更具有一定的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。更多的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇還具有抗癌、抗腫瘤[6]、抗氧化[7]和保護(hù)心血管[8]等多種生理和藥理活性。

常見(jiàn)的白藜蘆醇提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶法提取法和超臨界流體萃取法[9]。在傳統(tǒng)的溶劑提取法中，采用乙酸乙酯獲得白藜蘆醇的提取率相對(duì)較高[10]。白藜蘆醇的純化主要采用薄層層析[11-12]、柱層析[13-16]以及高速逆流色譜分離[17]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有利用柱色譜法分離獲得多酚單體化合物的研究報(bào)道。白藜蘆醇的分析檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[18-20]、化學(xué)發(fā)光法[21-22]、色譜-質(zhì)譜法[23-24]、熒光法[25-26]以及毛細(xì)管電泳法[27-28]?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)鑒定主要采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)和核磁共振譜(NMR)等波譜技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

牡丹籽殼，2014年來(lái)源于安徽亳州的丹鳳牡丹籽，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)0.250 mm篩。柱層析用硅膠(精細(xì)型100～200目)，來(lái)自青島海洋化工分廠；甲醇為色譜純；三氯化鐵、鐵氰化鉀、乙醇、石油醚和正丁醇等為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Bruker 500 Mz核磁共振儀，Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀，LC-20AT型高效液相色譜儀，EL 204電子天平，RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHB-3A循環(huán)水多用真空泵，Hypersil GOLD aQ色譜柱(Thermo)，冷凍干燥機(jī)，ZF-8型四用紫外分析儀，UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備

稱取一定量粉碎好的牡丹籽殼，按25∶1液料比加入70%乙醇溶液，于60℃水浴超聲提取80 min。將提取液過(guò)濾，然后將過(guò)濾液離心(1 000 r/min)，取上清液，于45℃減壓濃縮，獲得濃縮浸膏。將濃縮浸膏于-40℃真空冷凍干燥，獲得牡丹籽殼70%乙醇提取物。稱取一定量牡丹籽殼70%乙醇提取物，加入適量60℃的超純水，超聲充分溶解，得到水懸浮液，然后將水懸浮液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。分液漏斗中再加入一定量的石油醚，振蕩搖勻，然后靜置，上層為石油醚層，下層為水層，再多次用石油醚萃取下層水層，直至石油醚層無(wú)色。最終下層水層中加入一定量乙酸乙酯，按同樣方法萃取多次，將上層乙酸乙酯層溶液減壓濃縮、冷凍干燥后，獲得乙酸乙酯部位提取物，即為待分離樣品。

1.2.2 硅膠裝柱與上樣

硅膠層析柱采用濕法裝柱。將硅膠加入燒杯中，加入硅膠1倍體積的石油醚，并用玻璃棒充分?jǐn)嚢璩蓾{，然后靜置6 h。將層析柱底部用棉花塞緊，倒入1/3柱體積的石油醚，打開活塞，并將浸泡好的硅膠攪拌成勻漿，然后加入層析柱中。當(dāng)柱內(nèi)溶液接近硅膠面時(shí)，關(guān)閉活塞，待用。準(zhǔn)確稱取20.0 g待分離樣品溶于少量的乙酸乙酯中，然后加入適量的干硅膠。將拌有樣品的硅膠減壓濃縮成為干粉，并用研缽研細(xì)為粉末，然后均勻加入硅膠層析柱中，使拌有樣品的硅膠均勻平鋪于層析柱硅膠的表面。

1.2.3 柱層析分離樣品

樣品采用拌樣法上樣后，以石油醚和乙酸乙酯溶劑體系進(jìn)行梯度洗脫(石油醚與乙酸乙酯體積比從9.5∶0.5依次增大)。每500 mL洗脫液收集，經(jīng)薄層硅膠(TLC)檢測(cè)，合并相同組分洗脫液。將不同組分洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥后，采用高效液相色譜定性檢測(cè)。將石油醚-乙酸乙酯為7∶3的洗脫液經(jīng)減壓濃縮后獲得白色粉末樣品。

1.2.4 白藜蘆醇的定性檢測(cè)

白藜蘆醇具有一些特征的顏色反應(yīng)，可以用來(lái)作為白藜蘆醇的初步定性檢測(cè)依據(jù)。將層析柱后獲得的樣品溶于適量的甲醇中，分別觀察在可見(jiàn)光和紫外光照射時(shí)的溶液顏色。向柱層析后樣品的甲醇溶液中加入三氯化鐵，然后在可見(jiàn)光下觀察顏色反應(yīng)。柱層析后樣品的甲醇溶液中加入鐵氰化鉀并于紫外光下觀察顏色變化。利用BUCHI B-540熔點(diǎn)測(cè)定儀，測(cè)定樣品的熔點(diǎn)。

1.2.5 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜分析

稱取適量白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，溶于甲醇中，采用高效液相色譜分析。將柱層析后樣品溶于甲醇中，經(jīng)過(guò)0.45 μm微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾，進(jìn)行高效液相色譜分析，與標(biāo)準(zhǔn)品白藜蘆醇高效液相色譜圖進(jìn)行比較。

高效液相色譜條件：Hypersil GOLD aQ色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇與0.5%冰醋酸水溶液(體積比4∶6)；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為306 nm；柱溫為30℃；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為15 μL。

1.2.6 牡丹籽殼白藜蘆醇全波長(zhǎng)掃描

將柱層析后樣品溶于甲醇，經(jīng)過(guò)0.45 μm微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾。在波長(zhǎng)為200～776 nm范圍內(nèi)，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.2.7 白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)表征

核磁共振：利用Bruker 500 Mz核磁共振儀，采用氘代甲醇作為溶劑，測(cè)定核磁共振氫譜(1H NMR)和核磁共振碳譜(13C NMR)。紅外光譜：利用Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀，樣品在4 000～500 cm-1的波長(zhǎng)下掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹籽殼白藜蘆醇的定性分析

結(jié)合白藜蘆醇的一些特征顏色反應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行初步的定性檢測(cè)。其中，柱層析后樣品的甲醇溶液，在可見(jiàn)光照射時(shí)溶液為淡黃色，在紫外光照射時(shí)溶液呈紫色熒光。分別加入三氯化鐵和鐵氰化鉀于柱層析后樣品的甲醇溶液，呈現(xiàn)暗綠色和血紅色的特征顏色。這些顏色反應(yīng)與白藜蘆醇的特征顏色反應(yīng)一致，并且測(cè)定柱層析后樣品熔點(diǎn)約為254℃，可以初步推測(cè)待測(cè)物可能為白藜蘆醇。

2.2 牡丹籽殼白藜蘆醇高效液相色譜分析

2.2.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜保留時(shí)間為19.375 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm。其液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

2.2.2 牡丹籽殼白藜蘆醇高效液相色譜圖

牡丹籽殼白藜蘆醇柱層析后樣品的高效液相色譜圖中只有1個(gè)能識(shí)別的色譜峰，其保留時(shí)間為19.388 min。其液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 牡丹籽殼白藜蘆醇樣品液相色譜圖

牡丹籽殼白藜蘆醇樣品在306 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，保留時(shí)間為19.388 min的色譜峰，其峰純度為1.0。保留時(shí)間與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間基本相同。并且通過(guò)高效液相色譜的面積歸一化法，測(cè)定純度為96.25%。

2.3 牡丹籽殼白藜蘆醇全波長(zhǎng)掃描

牡丹籽殼白藜蘆醇柱層析后樣品在波長(zhǎng)范圍200～776 nm內(nèi)掃描，其中最大吸收波長(zhǎng)為218 nm和306 nm，其紫外可見(jiàn)光譜全波長(zhǎng)掃描圖見(jiàn)圖3。

圖3 牡丹籽殼白藜蘆醇全波長(zhǎng)掃描圖

2.4 牡丹籽殼白藜蘆醇結(jié)構(gòu)鑒定

2.4.1 薄層層析

柱層析后樣品與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的薄層層析色譜圖對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Rf基本一致。

2.4.2 紅外光譜

3 300.00、1 609.91 cm-1和964.55 cm-1均為白藜蘆醇化學(xué)結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，并且具有1 441.84、1 462.83、1 511.84、1 580 cm-1等苯環(huán)的特征吸收峰。并與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)照，符合白藜蘆醇的紅外光譜圖。

2.4.3 核磁共振

1H NMR(δ)：9.38(1H，s，OH-4′)，9.18(2H，s，OH-3，5)，7.35(2H，d，H-2′，6′)，6.84(1H，d，J=16.3 Hz，α-H)，6.78(1H，d，J=16.3 Hz，β-H)，6.73(2H，d，H-3′，5′)，6.34(2H，d，H-3′，5′)，6.07(1H，t，H-4)。以及在化學(xué)位移為6.84和6.78處的雙鍵偶合常數(shù)與報(bào)道文獻(xiàn)中白藜蘆醇相關(guān)數(shù)據(jù)一致。

13C NMR(δ)：159.05(C-3，5)，157.78(C-4′)，139.81(C-1′)，128.58(C-1)，128.46(C-α)，128.40(C-2′，6′)，126.18(C-β)，116.05(C-10，14)，104.82(C-2，6)，102.28(C-4)。

綜合1H NMR和13C NMR與已報(bào)道文獻(xiàn)中白藜蘆醇相關(guān)參數(shù)比較，鑒定為白藜蘆醇。

3 結(jié) 論

牡丹籽殼乙酸乙酯極性部位提取物，經(jīng)柱色譜梯度洗脫后獲得單體化合物。經(jīng)過(guò)特征顏色反應(yīng)以及高效液相色譜(與白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品比照)分析，初步判斷為白藜蘆醇。進(jìn)一步利用紅外光與核磁共振波譜分析方法，鑒定柱層析后化合物為白藜蘆醇。分離獲得的牡丹殼白藜蘆醇，經(jīng)高效液相色譜測(cè)定純度為96.25%，且得率為2.85%(相對(duì)乙酸乙酯極性部位提取物)。對(duì)榨取牡丹籽油后的副產(chǎn)物——牡丹籽殼，加以有效利用，分離得到了白藜蘆醇純品。進(jìn)而獲得了從牡丹籽殼中制備白藜蘆醇的方法。

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Isolation and structure characterization of resveratrol from peony seed shell

ZHANG Hongyu1， WANG Chengzhang1，2， YUAN Jiaojiao1，ZHANG Changwei1， WANG Zhihong1

(1.Key and Open Lab of Forest Chemical Engineering， State Forestry Administration，Institute of Chemical Industry of Forest Products， Chinese Academy of Forestry， Nanjing 210042， China；2. Institute of Forestry New Technology， Chinese Academy of Forestry， Beijing 100091， China)

The 70% ethanol solution extract of peony seed shell was extracted by ethyl acetate to obtain peony seed shell ethyl acetate extract. The ethyl acetate extract was separated by silica gel column chromatography. The resveratrol isolated was identified and characterized by high performance liquid chromatography (HPLC)， ultraviolet spectroscopy (UV)， infrared spectroscopy (IR) and nuclear magnetic resonance spectrum (NMR). The results showed that the resveratrol monomer was obtained with higher purity of 96.25%.

peony seed shell； resveratrol； isolation； structure characterization

2016-05-18；

2016-11-14

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2014DFR31300)

張紅玉(1989)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊毁Y源化學(xué)與利用(E-mail)chemicalzhy@163.com。

王成章，研究員，博士生導(dǎo)師(E-mail)wangczlhs@sina.com。

TS229;TS218

A

1003-7969(2017)02-0116-04