汪元符，劉志斌，熊震球，駱瑜，袁愛(ài)華，劉玢

（南昌市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 南昌 330038）

QuEChERS-UPLC-MS/MS監(jiān)測(cè)護(hù)膚化妝品中13種性激素成分的非法添加

汪元符，劉志斌，熊震球，駱瑜，袁愛(ài)華，劉玢

（南昌市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 南昌 330038）

目的：針對(duì)護(hù)膚化妝品，建立13種性激素化學(xué)成分非法添加，采用QuEChERS前處理方式-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的監(jiān)測(cè)方法。方法：色譜柱為Phenomenex Luna Omega 1.6 μm C18100A，150 mm×2.1 mm，柱溫為40℃，流動(dòng)相為水及乙腈，梯度洗脫，流速為0.2 mL/min，以優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)采集信號(hào)。結(jié)果：各成分檢出限濃度為2～30 ng/mL，定量限濃度為5～50 ng/mL，線性范圍為各成分定量限～500 ng/mL，在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，平均加樣回收率在87.2%～99.8%。結(jié)論：本方法準(zhǔn)確，靈敏度高，專屬性好；可用于護(hù)膚化妝品中13種性激素化學(xué)成分非法添加的同時(shí)定性及定量監(jiān)測(cè)。

QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；護(hù)膚化妝品；性激素；非法添加

性激素包括雌性激素、孕激素、雄性激素三大類。性激素具有控制附性器官和第二性征的作用，同時(shí)參與人體內(nèi)糖份、脂肪、蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等生命基本物質(zhì)的代謝活動(dòng)。當(dāng)性激素直接作用于皮膚時(shí)，短期內(nèi)可見(jiàn)促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、防止皮膚老化、祛除皮膚皺紋、增加皮膚彈性等作用，長(zhǎng)期應(yīng)用則可能導(dǎo)致色素沉積、產(chǎn)生黑斑、皮膚萎縮變薄、甚至具有高度的致癌風(fēng)險(xiǎn)。因此，在護(hù)膚化妝品中非法添加性激素的行為具有高度風(fēng)險(xiǎn)。在最新頒布的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）中，列有雌三醇、雌酮、己烯雌酚、雌二醇、睪丸酮、甲基睪丸酮、黃體酮等7種性激素的檢測(cè)和鑒定方法，采用的是液相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。液相色譜法存在不能確證的問(wèn)題，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法存在衍生操作步驟繁瑣，難以掌握與運(yùn)用的問(wèn)題。另一方面，我國(guó)實(shí)際生產(chǎn)并使用的性激素可達(dá)幾十種之多，常見(jiàn)常用的也有十幾種，只測(cè)7種存在監(jiān)測(cè)方法嚴(yán)重缺失的問(wèn)題?；谏鲜隹紤]，在進(jìn)行護(hù)膚化妝品中性激素含量監(jiān)測(cè)的實(shí)踐中，本實(shí)驗(yàn)室引入快速、簡(jiǎn)單、價(jià)廉、高效、耐用、安全的QuEChERS前處理提取方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測(cè)平臺(tái)，采用電噴霧離子源負(fù)、正離子同時(shí)監(jiān)測(cè)，能實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)13種常用的性激素定性確證與定量測(cè)定，能夠更好地滿足化妝品衛(wèi)生安全監(jiān)管中性激素監(jiān)測(cè)的需要。

1 儀器、試劑與材料

AB Sciex 4000 Qtrap質(zhì)譜， Ekspert ultraLC100超高效液相色譜儀，METTLER TOLEDO ME204E電子分析天平，METTLER TOLEDO XS105電子分析天平，Hettich Rotina 380R 1706 型醫(yī)用低速離心機(jī)，昆山KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器，Millipore超純水系統(tǒng)。

試劑：乙腈（色譜純，Merck），無(wú)水硫酸鎂（優(yōu)級(jí)純），無(wú)水醋酸鈉（優(yōu)級(jí)純），C18（粒度100 μm，安譜），PSA（安譜），石墨化碳（安譜）。

對(duì)照品：雌三醇（CAS No. 50-27-1，C13213200）、雌二醇（CAS No. 50-28-2，C13213000）、己烯雌酚（CAS No. 56-53-1，C12607000）、群勃龍（CAS No. 10161-33-8，C17607700）、雌酚酮（CAS No. 53-16-7，C13213230）、勃地龍（寶丹酮）（CAS No. 846-48-0，C10662000）、諾龍（19-去甲睪酮）（CAS No. 434-22-0，C15652000）、睪酮（CAS No. 58-22-0，C17322500）、甲 睪 酮（CAS No. 58-18-4，C15144000）、 黃 體 酮（CAS No. 57-83-0，C16342000）、丙酸諾龍（CAS No. 7207-92-3，C15652010）、丙酸睪酮（CAS No. 57-85-2，C17322540）、苯丙酸諾龍（CAS No. 62-90-8，100004-200603），除苯丙酸諾龍來(lái)源為中國(guó)食品藥品檢定研究院外其他均為Dr. Ehrenstorfer GmbH。

樣品購(gòu)自流通。溶液類樣品共6批：護(hù)膚玫瑰精油（凈含量：138 mL，保質(zhì)期：20181101），雙飛人爽水（凈含量：50 mL，保質(zhì)期：20201220），眼部精華液（凈含量：20 mL，保質(zhì)期：20180528），秀域佳芬保濕柔膚水（凈含量：2 mL，保質(zhì)期：20180305），北海道馬油（凈含量：25 mL，保質(zhì)期：20181217），威治藥莊逗可迪新生淡印精華（凈含量：10 mL，保質(zhì)期：20180706）。霜膏類樣品共10批：冰王蘆薈膠（凈含量：30 g，保質(zhì)期：20190301），青瓜沁水保濕潔面乳（凈含量：100 g，保質(zhì)期：20181023），達(dá)抒靈尿素維E護(hù)膚膏（凈含量：50 g，保質(zhì)期：20181019），修生潤(rùn)膚膏（凈含量：10 g，保質(zhì)期：20180602），裂王抗裂修復(fù)霜（凈含量：80 g，保質(zhì)期：20180609），二天堂靈芝蘆薈祛痘膏（凈含量：20 g，保質(zhì)期：20190314），虎鏢痘可迪清痘消痕乳膏（凈含量：18 g，保質(zhì)期：20190102），奇力康軟質(zhì)霜（凈含量：10 g，保質(zhì)期：20190721），亮芙美麗無(wú)痕修復(fù)霜（凈含量：60 g，保質(zhì)期：20180416），痤美先潔面乳（凈含量：60 g，保質(zhì)期：20180312）。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜分析條件

分析柱：Phenomenex Luna Omega 1.6 μm C18100A，150 mm×2.1 mm。柱溫：40℃。流速：0.2 mL/min。進(jìn)樣量：5 μL。流動(dòng)相：A為水，B為乙腈。按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源（ESI）：負(fù)離子模式（ESI－）及正離子模式（ESI＋）。掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。掃描范圍：50～600 Da。氣簾氣壓力：25 Pa。碰撞氣密度：中。電離噴霧電壓：5500 V。離子源溫度：500℃。霧化氣壓力：55 Pa。輔助氣壓力：50 Pa。界面加熱狀態(tài)：開(kāi)啟。離子對(duì)選擇見(jiàn)表2。

表2 離子對(duì)質(zhì)譜分析

2.3 對(duì)照品溶液的配制

取雌三醇、雌二醇、己烯雌酚、群勃龍、雌酚酮、勃地龍、諾龍、睪酮、甲睪酮、黃體酮、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍對(duì)照品各10 mg，精密稱定，以乙腈制成每1 mL中各含10 μg的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL，以乙腈制成各含1000 ng/mL和100 ng/mL的溶液，作為對(duì)照品使用液。

標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制：以10 mL量瓶制備，分別精密量取濃度為100 ng/mL 和1000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品使用溶液適量，以50%乙腈水溶液定容至10 mL，制成各含雌三醇、雌二醇、己烯雌酚、群勃龍、雌酚酮、勃地龍、諾龍、睪酮、甲睪酮、黃體酮、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍濃度為1.0 ng/mL，2.0 ng/mL，3.0 ng/mL，4.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10.0 ng/mL，20.0 ng/mL，30.0 ng/mL，40.0ng/mL，50.0 ng/mL，100.0 ng/mL，200.0 ng/mL，300.0 ng/mL，400.0 ng/mL，500.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

2.4 供試品溶液的配制

取2 g試樣（精確至0.01 g）置50 mL聚四氟乙烯具蓋離心管中，加水至10 mL，振搖使分散均勻，再加入15 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，使充分分散均勻，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，放冷至室溫，加入3 g無(wú)水硫酸鎂和1.5 g無(wú)水醋酸鈉，迅速振搖，渦旋振蕩1 min，以5000 r/min離心5 min，取上清液作進(jìn)一步凈化。

凈化：稱取150 mg（±5 mg）PSA，300 mg（±5 mg）無(wú)水硫酸鎂，100 mg（±5 mg）C18，50 mg（±5 mg）石墨化碳，置于15 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取5 mL上清液至此離心管中，渦旋混合1 min，以10000 r/min，離心3 min，移取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，取濾液待測(cè)。

2.5 對(duì)照品濃度為100 ng/mL時(shí)各離子對(duì)提取質(zhì)譜圖，見(jiàn)圖1～26。

圖1 雌三醇定量離子對(duì)（287.1/171.0）提取質(zhì)譜圖

圖2 雌三醇定性離子對(duì)（287.1/145.0）提取質(zhì)譜圖

圖3 雌二醇定量離子對(duì)（271.0/145.0）提取質(zhì)譜圖

圖4 雌二醇定性離子對(duì)（271.0/182.9）提取質(zhì)譜圖

圖5 己烯雌酚定量離子對(duì)（267.1/251.1）提取質(zhì)譜圖

圖6 己烯雌酚定性離子對(duì)（267.1/237.1）提取質(zhì)譜圖

圖7 群勃龍定量離子對(duì)（271.1/253.1）提取質(zhì)譜圖

圖8 群勃龍定性離子對(duì)（271.1/199.0）提取質(zhì)譜圖

圖9 雌酚酮定量離子對(duì)（271.3/133.1）提取質(zhì)譜圖

圖10 雌酚酮定性離子對(duì)（271.3/159.1）提取質(zhì)譜圖

圖11 勃地龍定量離子對(duì)（287.3/121.3）提取質(zhì)譜圖

圖12 勃地龍定性離子對(duì)（287.3/135.4）提取質(zhì)譜圖

圖13 諾龍定量離子對(duì)（275.5/109.0）提取質(zhì)譜圖

圖14 諾龍定性離子對(duì)（275.5/257.1）提取質(zhì)譜圖

圖15 睪酮定量離子對(duì)（289.3/97.0）提取質(zhì)譜圖

圖16 睪酮定性離子對(duì)（289.3/109.0）提取質(zhì)譜圖

圖17 甲睪酮定量離子對(duì)（303.2/109.0）提取質(zhì)譜圖

圖18 甲睪酮定性離子對(duì)（303.2/97.0）提取質(zhì)譜圖

圖19 黃體酮定量離子對(duì)（315.2/109.0）提取質(zhì)譜圖

圖20 黃體酮定性離子對(duì)（315.2/97.0）提取質(zhì)譜圖

圖21 丙酸諾龍定量離子對(duì)（331.5/257.1）提取質(zhì)譜圖

圖22 丙酸諾龍定性離子對(duì)（331.5/109.0）提取質(zhì)譜圖

圖23 丙酸睪酮定量離子對(duì)（345.4/271.2）提取質(zhì)譜圖

圖24 丙酸睪酮定性離子對(duì)（345.4/97.0）提取質(zhì)譜圖

圖25 苯丙酸諾龍定量離子對(duì)（407.2/105.1）提取質(zhì)譜圖

圖26 苯丙酸諾龍定性離子對(duì)（407.2/257.1）提取質(zhì)譜圖

2.6 定性確認(rèn)

采用保留時(shí)間與對(duì)照品相一致，且定性與定量離子對(duì)相對(duì)離子豐度比應(yīng)滿足表3要求，判為檢出。

各對(duì)照品試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度比的最大允許偏差 （%）

2.7 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察

采用“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，“2.2”項(xiàng)下的質(zhì)譜條件，以“2.3”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣檢測(cè)。以檢測(cè)所得峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合。以定性離子對(duì)和定量離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比均＞3時(shí)的濃度（ng/mL）為檢出限。以定性離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比＞3，定量離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比＞10時(shí)的濃度（ng/mL）為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)＞0.99，為線性范圍。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.8 精密度試驗(yàn)

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各成分濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，以提取的定量離子對(duì)質(zhì)譜圖峰面積計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表6。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各成分濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在0，1，2，4，8，12，24 h分別進(jìn)樣，以提取的定量離子對(duì)質(zhì)譜圖峰面積計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表7。

表4 對(duì)照品試驗(yàn)結(jié)果

2.10 回收率試驗(yàn)

以基質(zhì)較為復(fù)雜的冰王蘆薈膠為空白樣品進(jìn)行加標(biāo)。加標(biāo)前以本法檢測(cè)證實(shí)為陰性樣品。平行取9份，分別為2 g，各精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液（10 μg/mL）0.150 mL，0.375 mL，0.600 mL，然后按“2.4”項(xiàng)下其余步驟制備樣液，以15 mL乙腈體積分?jǐn)?shù)計(jì)，則最終加標(biāo)樣液濃度理論值應(yīng)為100 ng/mL，250 ng/mL，400 ng/mL，以此計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表8。

表5 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察結(jié)果

表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表8 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

各組分高、中、低3個(gè)濃度的回收率均在87.2%～99.8%。

2.11 樣品測(cè)定結(jié)果

以本法檢測(cè)了16個(gè)批次樣品，結(jié)果僅一批眼部精華液檢出雌酚酮，含量為0.72 mg/kg。

3 討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

曾分別試用化學(xué)電離（APCI）離子源與ESI離子源，結(jié)果表明APCI離子源離子化效率低，信號(hào)較弱，應(yīng)采用ESI離子源。又經(jīng)試驗(yàn)表明，雌三醇、雌二醇、己烯雌酚在負(fù)離子模式下信號(hào)更強(qiáng)，群勃龍、雌酚酮、勃地龍、諾龍、睪酮、甲睪酮、黃體酮、丙酸諾龍、丙酸睪酮、苯丙酸諾龍?jiān)谡x子模式下信號(hào)更強(qiáng)。

3.2 液相色譜條件的選擇

在已確定色譜柱的情況下，流動(dòng)相及其洗脫方式的選擇猶為重要。曾試用“0.1%甲酸水-乙腈”“乙酸銨溶液-乙腈”等酸性流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在酸性環(huán)境中對(duì)性激素的離子化會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重抑制，因而應(yīng)使用中性的“水-乙腈”流動(dòng)相系統(tǒng)，效果滿意。流動(dòng)相起始比例及洗脫方式也會(huì)影響信號(hào)的響應(yīng)及不同組分能否分離。經(jīng)試驗(yàn)，采用本法的洗脫方式，各組分信號(hào)較強(qiáng)，分離效果也佳。

3.3 QuEChERS方法的優(yōu)化

本法采用了最基礎(chǔ)的QuEChERS方法，結(jié)果尚滿意。QuEChERS中所使用的吸附劑種類與配比還可進(jìn)一步優(yōu)化，能提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

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本文編輯：蘇日力嘎

Monitoring on Thirteen Kinds of Sexual Hormones Illegally Added in Skin Care Cosmetics by QuEChERS-UPLC-MS/MS

Wang Yuan-fu, Liu Zhi-bin, Xiong Zhen-qiu, Luo Yu, Yuan Ai-hua, Liu Bin

(Nanchang Institute for Food and Drug Control, Jiangxi Nanchang 330038, China)

Objective：To establish a QuEChERS-UPLC-MS/MS method for determination of thirteen kinds of sexual hormones illegally added in skin care cosmetics. Methods：Phenomenex Luna Omega 1.6μm C18100A (150 mm × 2.1 mm) column was used at a temperature of 40℃, serving water-acetonitrile as a mobile phase at a flow rate of 0. 2 mL/min. The signal was collected under optimized condition. Results：The detection limit of this method was 2～30 ng/mL, while the limit of quantitation was 5～50 ng/mL. The linear range was the limit of quantitation～500 ng/mL, with R2values of more than 0.99. The test results showed the related coefficient in the linear range was more than 0.99. The average recoveries of the method were 87.2%～99.8%. Conclusion：This method is accurate, sensitive and specific, which can be used for the qualitative and quantitative determinations of thirteen kinds of sexual hormones illegally added in skin care cosmetics.

QuEChERS-UPLC-MS/MS; Skin care Cosmetics; Sexual Hormones; Illegally Added

O657.7＋2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.03.010

2016 - 12 - 25

護(hù)膚化妝品中性激素含量的監(jiān)測(cè)，項(xiàng)目立項(xiàng)文號(hào)：洪科發(fā)計(jì)字【2016】96號(hào)，項(xiàng)目編號(hào)：第84項(xiàng)

汪元符，男，主管藥師。研究方向：醫(yī)藥衛(wèi)生。通訊作者E-mail：wanngel@126.com