揭紅東 韓奇鵬 譚支良 周傳社* 孔志偉 陳 亮 任 傲(.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，長沙408；.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，長沙405；3.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙408)

L-茶氨酸對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡的影響

揭紅東1,2韓奇鵬1譚支良2,3周傳社2,3*孔志偉2陳 亮2任 傲1
(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，長沙410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，長沙410125；3.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128)

本試驗(yàn)通過建立過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡模型，研究L-茶氨酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率及其凋亡通路關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響。選取42日齡湘東黑山羊的瘤胃上皮傳代細(xì)胞，培養(yǎng)于含5%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基中，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，隨機(jī)分為5組，分別為培養(yǎng)基中無額外添加物的對(duì)照組、添加800 μmol/L H2O2的Ⅰ組、添加800 μmol/L H2O2+4 mmol/LL-茶氨酸的Ⅱ組、添加800 μmol/L H2O2+8 mmol/LL-茶氨酸的Ⅲ組和添加800 μmol/L H2O2+16 mmol/LL-茶氨酸的Ⅳ組，每組3個(gè)重復(fù)。作用12 h后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)對(duì)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡通路關(guān)鍵基因半胱氨酸天冬氨酸-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸-8(Caspase-8)、半胱氨酸天冬氨酸-9(Caspase-9)、Fas相關(guān)死亡域蛋白(FADD)和凋亡酶激活因子(Apaf-1)的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：1)通過膜聯(lián)蛋白-V(annexin V)/碘化丙啶(PI)聯(lián)合染色結(jié)果可知，與Ⅰ組相比，各L-茶氨酸添加組(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組)細(xì)胞晚期凋亡比率顯著降低(P<0.05)，且細(xì)胞晚期凋亡比率隨L-茶氨酸添加濃度的增加逐漸降低。2)通過RT-qPCR檢測結(jié)果可知，與Ⅰ組相比，各L-茶氨酸添加組Caspase-3、Caspase-9、Apaf-1基因的表達(dá)量皆顯著降低(P<0.05)。由此得出，L-茶氨酸對(duì)H2O2引起的山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用，該結(jié)果可為今后研究反芻家畜瘤胃氧化應(yīng)激損傷機(jī)制提供技術(shù)支持和理論參考。

L-茶氨酸；H2O2；山羊；瘤胃上皮傳代細(xì)胞；凋亡

茶氨酸系統(tǒng)命名為5-N-乙基-γ-谷氨酰胺(5-N-ethyl-γ-glutamine)或γ-谷氨酰-L-乙胺(γ-glutamyl-L-ethylamide)。茶氨酸不參與蛋白質(zhì)的合成，以游離形式存在，占茶葉中游離氨基酸總量的40%～70%[1]。自然界存在的茶氨酸一般為L型，L-茶氨酸對(duì)腦組織損傷[2]、肝組織損傷[3-6]等起到保護(hù)作用。此外，茶氨酸具有多種生物活性功能和藥理學(xué)效應(yīng)[7]。研究表明，茶氨酸(400 μg/mL)可致肝癌細(xì)胞HepG、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、結(jié)腸癌細(xì)胞HT29、前列腺癌細(xì)胞PC-3等癌細(xì)胞死亡50%[8-9]。茶氨酸還能有效抑制Hela細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，且增殖抑制作用具有一定的濃度及時(shí)間依賴性，推測茶氨酸可能通過抑制Hela細(xì)胞谷氨酸的代謝以發(fā)揮其抗腫瘤活性[10]。針對(duì)茶氨酸在體內(nèi)外對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2增殖、凋亡、抗血管生成作用的研究結(jié)果表明，茶氨酸可以通過抑制腫瘤血管生成、抑制腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且具有時(shí)間劑量效應(yīng)[11]。此外，雷明盛[12]研究發(fā)現(xiàn)茶氨酸拮抗蛙皮素抑制樹突狀細(xì)胞(DC)表面分子的表達(dá)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)的分泌；結(jié)合對(duì)凋亡率及形態(tài)學(xué)的研究表明，茶氨酸能夠促進(jìn)受抑DC的成熟和功能，從而推測茶氨酸能夠拮抗腫瘤環(huán)境對(duì)DC的抑制。

氧化應(yīng)激是斷奶幼畜危害問題之一，斷奶家畜的精神萎靡、腹瀉、采食量下降等均是與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)的疾病，而通過維持或提高機(jī)體正常生理功能來解決氧化應(yīng)激對(duì)斷奶家畜機(jī)體的損傷，是為斷奶家畜健康成長提供保障的主要途徑之一。因此，本試驗(yàn)以過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)為氧化應(yīng)激因子，建立山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡模型，并研究L-茶氨酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡及其凋亡通路關(guān)鍵基因[半胱氨酸天冬氨酸-3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3，Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸-8(cysteinyl aspartate-specific proteinase-8，Caspase-8)、半胱氨酸天冬氨酸-9(cysteinyl aspartate-specific proteinase-9，Caspase-9)、凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating facter-1，Apaf-1)、Fas相關(guān)死亡域蛋白(Fas-associate with death domain protein，F(xiàn)ADD)]表達(dá)量的影響，以期為山羊瘤胃上皮細(xì)胞營養(yǎng)代謝和氧化應(yīng)激機(jī)制之間相互關(guān)系的研究提供一定的參考，進(jìn)而為促進(jìn)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)、DMEM/F12(dulbecco’s modified eagle medium: nutrient mixture F-12)培養(yǎng)基、胰蛋白酶(trypsin)-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)溶液(0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA)、青鏈霉素、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、胰島素均購自美國Gibco公司；兩性霉素B和慶大霉素溶液(gentamicin/amphotericin solution)(R-015-10，10×1 mL)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；L-茶氨酸購自德國Orgentec公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的分組及處理

試驗(yàn)動(dòng)物為3只42日齡健康的湘東黑山羊，體重為(6.4±0.8) kg。將試驗(yàn)羊麻醉后，頸靜脈放血致死，取出瘤胃組織，去掉內(nèi)容物后用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，待用于樣品采集[13]。以DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)山羊瘤胃上皮細(xì)胞，當(dāng)山羊瘤胃上皮原代細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿的80%～90%時(shí)，棄去上清液，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌細(xì)胞1～2次后，加入1 mL的含0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液，放入含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中消化2～3 min，放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，開始變亮、變圓時(shí)迅速用含5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。將貼壁的細(xì)胞吹打?yàn)閼乙?，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，在4 ℃離心機(jī)中94×g離心5 min，棄去上清液，加入1 mL的完全DMEMF/12培養(yǎng)基(含5% FBS、10 μg/mL胰島素、10 ng/mL EGF、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素、2.5 μg/mL慶大霉素、2.5 μg/mL兩性霉素B)重懸細(xì)胞，以1∶2的比例進(jìn)行傳代。在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，轉(zhuǎn)移含細(xì)胞的完全DMEMF/12培養(yǎng)基至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)1次，進(jìn)一步純化[14]。純化后的山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于含5% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，隨機(jī)分為5組，分別為培養(yǎng)基中無額外添加物的對(duì)照組、添加800 μmol/L H2O2的Ⅰ組、添加800 μmol/L H2O2+4 mmol/LL-茶氨酸的Ⅱ組、添加800 μmol/L H2O2+8 mmol/LL-茶氨酸的Ⅲ組和添加800 μmol/L H2O2+16 mmol/LL-茶氨酸的Ⅳ組[4-5]，每組3個(gè)重復(fù)，作用12 h后進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率

應(yīng)用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀，采用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)中膜聯(lián)蛋白-V(annexin V)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)聯(lián)合染色法檢測細(xì)胞凋亡比率[15]。

1.2.3 PCR檢測山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)量

樣品總RNA的抽提：采用TRIzol一步法抽提組織樣品中總RNA[16-17]；總RNA樣品的DNase Ⅰ處理參考文獻(xiàn)[18-19]；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參考文獻(xiàn)[20-22]，按M-MLV試劑說明書進(jìn)行。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成

1.2.4.1 引物合成

根據(jù)新基因的測序結(jié)果，利用分子生物學(xué)軟件Primer premier 5、Primer 3.0、Oligo 6.71軟件設(shè)計(jì)引物，并用Blast工具進(jìn)行引物特異性分析。運(yùn)用PCR檢測其組織特異性，所用引物如表1所示，引物由上海生工基因技術(shù)有限公司合成。

表1 引物設(shè)計(jì)

F和R分別代表上游引物和下游引物。

F and R indicate forward and reverse primers, respectively.

1.2.4.2 RT-qPCR反應(yīng)條件與產(chǎn)物檢測

RT-PCR反應(yīng)體系：在一滅菌的0.2 mL RT-qPCR管中建立如表2所示的RT-qPCR反應(yīng)體系。

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系

RT-qPCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55℃退火45 s、72 ℃延伸2 min，循環(huán)35圈；72 ℃再延伸10 min。

RT-qPCR結(jié)束后，取18 μL PCR產(chǎn)物與2 μL溴酚蘭混合點(diǎn)樣，并以DL2000 DNA Marker作為參照，在1×TAE電泳緩沖液中進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳(5 V/cm)，電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

細(xì)胞凋亡應(yīng)用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，并用專業(yè)軟件Flowjo進(jìn)行圖像分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.2的一般線性模型(GLM)對(duì)細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[23-24]，應(yīng)用contrast語句分別進(jìn)行造模組(Ⅰ組)與對(duì)照組、各H2O2添加組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)之間的顯著性比較。通過運(yùn)用LSMEANS方法來計(jì)算平均值。運(yùn)用正交多項(xiàng)式對(duì)比來檢查其P值的相關(guān)效應(yīng)(線性或者二次)。在正交多項(xiàng)式分析之前，使用SAS 8.2的IML程序來校正系數(shù)[25]。P<0.05定義為差異顯著，0.05≤P<0.10為具有差異顯著趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1L-茶氨酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率的影響

由圖1和表3可以看出，與Ⅰ組相比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組細(xì)胞晚期凋亡比率顯著降低(P<0.05)，且隨著L-茶氨酸添加濃度的升高，細(xì)胞晚期凋亡比率逐漸減小，且各組間差異顯著(P<0.05)。上述結(jié)果說明，L-茶氨酸可緩解H2O2對(duì)山羊瘤胃上皮細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激損傷。

圖1 L-茶氨酸影響H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

2.2 RT-qPCR檢測結(jié)果

2.2.1 總RNA提取結(jié)果

部分總RNA電泳圖如圖2所示，提取的總RNA的28S和18S條帶清晰，可用于后續(xù)PCR操作。

2.2.2L-茶氨酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡通路關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響

由表4可以看出，與Ⅰ組相比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的Caspase-3、Caspase-9、Apaf-1基因表達(dá)量皆顯著降低(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ組的Caspase-8基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

表3 L-茶氨酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率的影響

Ⅰ組數(shù)據(jù)肩標(biāo)*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。各H2O2添加組間，同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in group Ⅰ with * superscripts mean significant difference compared with control group (P<0.05), and with ** mean extremely significant difference compared with control group (P<0.01). Values in the same row with different letter superscripts mean significant difference among groups adding H2O2(P<0.05). The same as below.

M：DL2000 DNA Marker；1～5：總RNA樣品。

M: DL2000 DNA Marker; 1 to 5: samples of total RNA.

圖2 部分總RNA電泳圖

Fig.2 The electrophoretogram of partial total RNA

3 討 論

3.1L-茶氨酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡比率的影響

高濃度氧直接損傷瘤胃上皮細(xì)胞，促使細(xì)胞凋亡或使胃部疾病惡化。大量氧化自由基是引起細(xì)胞損傷的重要原因之一，缺血再灌注、藥物代謝、金屬中毒等會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基[26]，而H2O2作為氧化自由基的主要成分，得到廣泛的應(yīng)用[27-29]。

減少H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡比率，對(duì)減輕過氧化應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷，改善機(jī)體功能與狀態(tài)具有非常重要的意義。本試驗(yàn)對(duì)于山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的凋亡檢測結(jié)果表明，L-茶氨酸可緩解H2O2引起的山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。其機(jī)制可能是：L-茶氨酸作為谷氨酰胺的衍生物，在細(xì)胞內(nèi)可代謝為谷氨酸，參與到谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成過程。此外，L-茶氨酸可以通過維持細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，一方面減少GSH的損耗，另一方面增加GSH的生成，達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)GSH含量的效果，維持了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡狀態(tài)，從而保護(hù)機(jī)體避免氧化應(yīng)激反應(yīng)的損傷[30]。

3.2L-茶氨酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡通路關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響

本試驗(yàn)主要從細(xì)胞凋亡角度出發(fā)，在細(xì)胞傳代培養(yǎng)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用PCR針對(duì)L-茶氨酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮細(xì)胞凋亡基因FADD、Caspase-8、Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：與Ⅰ組相比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組Caspase-3、Caspase-9、Apaf-1基因的表達(dá)量皆顯著降低；Ⅱ、Ⅲ組Caspase-8基因的表達(dá)量顯著降低。上述結(jié)果說明：1)L-茶氨酸對(duì)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的凋亡起到一定的抑制作用；2)L-茶氨酸可以通過降低線粒體通路相關(guān)的基因表達(dá)量，促使山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的凋亡比率降低，且呈劑量依賴性；3)L-茶氨酸在一定濃度范圍內(nèi)通過外源性通路，降低山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的凋亡比率，但不是通過直接刺激外源性基因(FADD)實(shí)現(xiàn)的。這是由于L-茶氨酸可通過線粒體途徑和外源性途徑緩解H2O2誘導(dǎo)的山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的凋亡。a)線粒體途徑：細(xì)胞色素C(CytC)與Apaf-1結(jié)合形成單體減少，單體(7個(gè))聚合形成凋亡體的數(shù)量減少，凋亡體通過酶募集區(qū)(CARD)募集Caspase-9前體(pro-Caspase-9)數(shù)量減少，促使pro-Caspase-9活化能力減弱，成熟為有活性的Caspase-9的數(shù)量降低，進(jìn)一步激活具有代表性效應(yīng)的Caspase-3的能力降低，Caspase-3再裂解多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly (ADP-ri-bose) polymerase，PARP]的能力減弱，DNA繼續(xù)修復(fù)能力恢復(fù)；活化的核酸內(nèi)切酶可特異性切割核小體間的連接序列的能力減弱，DNA斷裂成n×(180～200) bp的片段數(shù)量減少，細(xì)胞骨架蛋白、核蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等完整性增強(qiáng)，促使細(xì)胞形態(tài)正常，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率降低[31]。b)外源性凋亡途徑[由細(xì)胞膜上的死亡受體介導(dǎo)，當(dāng)其與死亡配體結(jié)合后，受體通過胞漿區(qū)的DD(DD是一段高度保守的氨基酸序列，若一個(gè)重要?dú)埢蛔?，相?yīng)受體便失去活性功能)募集相應(yīng)的銜接蛋白(adaptor protein)形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)]：Fas與腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)直接募集Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域[該結(jié)構(gòu)域由1個(gè)N端的死亡效應(yīng)域(DED)和C端的死亡域(DD)構(gòu)成[32])]和pro-Caspase-8結(jié)合形成DISC的能力降低，之后pro-Caspase-8被同源活化成Caspase-8的數(shù)量減少；Ⅰ型細(xì)胞的活化的Caspase-8通過異源活化激活Caspase-3的能力降低，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率降低；Ⅱ型細(xì)胞中，原來活化的Caspase-8較少，不能激活足夠的Caspase-8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，Caspase-8通過裂解促凋亡基因BID形成截短的BID[truncated BID，tBID(tBID被認(rèn)為是內(nèi)外凋亡途徑的結(jié)合點(diǎn))]的數(shù)量也減少，激活線粒體細(xì)胞凋亡途徑的能力降低，不能將死亡信號(hào)放大。少量的tBID移位到線粒體外膜，通過構(gòu)象改變誘導(dǎo)促凋亡基因Bak形成寡聚體的數(shù)量隨之降低[33]，激活線粒體細(xì)胞凋亡途徑的能力減弱[34]。

表4 L-茶氨酸對(duì)H2O2誘導(dǎo)山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞凋亡通路關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響

4 結(jié) 論

不同濃度的L-茶氨酸均可使細(xì)胞晚期凋亡比率顯著降低，且隨著L-茶氨酸添加濃度的增加，晚期細(xì)胞凋亡比率隨之降低，表明L-茶氨酸可有效緩解H2O2引起的山羊瘤胃上皮傳代細(xì)胞的氧化損傷。

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*Corresponding author, professor, E-mail: zcs@isa.ac.cn

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Effects ofL-Theanine on Apoptosis of Subculture Ruminal Epithelial Cells Induced by Hydrogen Peroxide of Goats

JIE Hongdong1,2HAN Qipeng1TAN Zhiliang2,3ZHOU Chuanshe2,3*KONG Zhiwei2CHEN Liang2REN Ao1
(1.CollegeofHorticulture&Landscape,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.KeyLaboratoryforAgro-EcologicalProcessesinSubtropicalRegion,NationalEngineeringLaboratoryforPollutionControlandWasteUtilizationinLivestockandPoultryProduction,HunanResearchCenterofLivestock&PoultrySciences,South-CentralExperimentalStationofAnimalNutritionandFeedScienceofMinistryofAgriculture,InstituteofSubtropicalAgriculture,TheChineseAcademyofScience,Changsha410125,China; 3.HunanCo-InnovationCenterofAnimalProductionSafety,Changsha410128,China)

The aim of this study was to explore the effects ofL-theanine on the apoptosis ratio and expression quantities of key genes in apoptosis pathway of subculture ruminal epithelial cells induced by hydrogen peroxide (H2O2) of goats according to establish the apoptosis model for subculture ruminal epithelium cells induced by H2O2. Subculture ruminal epithelium cells of 42-day-oldXiangdongblack goats were selected, and were cultured in DMEM/F12 medium with 5% FBS, when the intensity reached 60% to 70%, the cells were randomly divided into 5 groups: control group, with no supplementation in medium; group Ⅰ, supplemented with 800 μmol/L H2O2in medium; group Ⅱ, supplemented with 800 μmol/L+4 mmol/LL-theanine in medium, group Ⅲ, supplemented with 800 μmol/L+8 mmol/LL-theanine in medium, group Ⅳ, supplemented with 800 μmol/L+16 mmol/LL-theanine in medium. There were three repeats in each group. After 12 h treatment, flow cytometry (FCM) was used to detect the apoptosis ratio of the subculture ruminal epithelium cells, and real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR) was selected to detect the expression quantities of apoptosis pathway key genes of subculture ruminal epithelial cells, such as cysteinyl aspartate-specific proteinase-3 (Caspase-3), cysteinyl aspartate-specific proteinase-8 (Caspase-8), cysteinyl aspartate-specific proteinase-9 (Caspase-9), apoptotic protease activating facter-1 (Apaf-1) and Fas-associate with death domain protein (FADD). The results showed as follows: 1) compared with the group Ⅰ, the late apoptosis ratio of cells forL-theanine supplementation groups (groups Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ) decreased significantly (P<0.05), and the late apoptosis ratio decreased with the increase ofL-theanine supplemental concentration by using annexin V/propidium iodide (PI) unite staining. 2) The expression quantities ofCaspase-3,Caspase-9 andApaf-1 forL-theanine supplementation groups decreased significantly compared with the group Ⅰ using RT-qPCR test (P<0.05). It is concluded thatL-theanine plays a protection role in apoptosis subculture ruminal epithelium cells induced by H2O2of goats, which may provide technical support and theoretical reference for the future research on oxidative stress damage mechanism of the rumen in ruminants.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(5)：1582-1589]

L-theanine; H2O2; goats; subculture ruminal epithelium cell; apoptosis

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.05.017

2017-01-27

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31372342)

揭紅東(1991—)，男，湖南長沙人，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镏参镔Y源工程。E-mail： 593432635@qq.com

*通信作者:周傳社，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail： zcs@isa.ac.cn

S813.7

A

1006-267X(2017)05-1582-08