楊 媛，張 劍

(山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西太原，030006)

微生物脂肪酶的性質(zhì)及應(yīng)用研究

楊 媛，張 劍

(山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西太原，030006)

脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑之一，微生物是其主要來(lái)源。脂肪酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域、食品工業(yè)、洗滌劑工業(yè)以及相關(guān)的領(lǐng)域。對(duì)脂肪酶的種類以及發(fā)酵過(guò)程中所涉及的基因工程菌的構(gòu)建、優(yōu)化發(fā)酵工藝、分離提純等進(jìn)行了綜述，并結(jié)合脂肪酶的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)脂肪酶的性質(zhì)和應(yīng)用方面進(jìn)行了總結(jié)，為今后關(guān)于脂肪酶的進(jìn)一步研究提供了便利。

脂肪酶；微生物；洗滌劑；發(fā)酵工藝

脂肪酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。其最早是從動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的，1834年發(fā)現(xiàn)了兔胰脂肪酶，1864年發(fā)現(xiàn)了豬胰脂肪酶，1871年在植物種子中發(fā)現(xiàn)了脂肪酶。直到1901年才發(fā)現(xiàn)微生物脂肪酶［1-3］。微生物中細(xì)菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量較為豐富。微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動(dòng)植物更廣的作用pH、作用溫度范圍以及底物專一性，其可以在不需要輔酶的條件下，催化酯類化合物的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)等，催化條件溫和、能耗低、副產(chǎn)物少，具有高效、高選擇性、環(huán)境友好等特點(diǎn)［4］，改變了傳統(tǒng)的酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)所需要的高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等相對(duì)苛刻的條件。因此，微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來(lái)源。

1 微生物脂肪酶的種類

產(chǎn)生脂肪酶的微生物種類很多，迄今己報(bào)道的有65個(gè)屬［5］，其中細(xì)菌28個(gè)屬，酵母菌10個(gè)屬，放線菌4個(gè)屬，其他真菌23個(gè)屬。目前，脂肪酶產(chǎn)生菌中得到深入研究的主要集中在根霉［6］、曲霉［7-9］、青霉［10-11］、毛霉［12］、假單胞菌［13］等具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的菌種以及與醫(yī)學(xué)相關(guān)的金黃色葡萄球菌、鉤端螺旋體、粉刺狀桿菌等。

2 微生物脂肪酶的發(fā)酵

近20年來(lái)，微生物脂肪酶發(fā)酵研究［14-15］主要集中在高產(chǎn)菌株的篩選、常規(guī)誘變育種、基因工程菌的構(gòu)建、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化、發(fā)酵工藝放大和酶的分離純化等方面。

2.1 高產(chǎn)菌株的篩選

篩選脂肪酶高產(chǎn)菌［16-18］的方法常見的是采用含甘油三酯瓊脂平板。吳慧浩、陳強(qiáng)等人［17］在油脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)初篩，在經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后若培養(yǎng)基呈紅色（如圖1）,表明該菌株能產(chǎn)生脂肪酶。之后用聚乙烯醇選擇性培養(yǎng)基挑選菌株中產(chǎn)酶能力較高的菌株，利用透明光圈和菌落直徑比的大小能很清晰地了解菌株的產(chǎn)酶能力，直徑比越大表示其產(chǎn)酶能力越高（如圖2）。HaiKuan WANG等［19］研究4種產(chǎn)脂肪酶的不同菌株在維多利亞藍(lán)瓊脂平板上進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖3所示，圖3中，2是從洋蔥伯克霍爾德菌分離的lp08脂肪酶，1、3和4是其他菌株脂肪酶，A是在25℃，pH=8的條件下各菌株的反應(yīng)，B是在25℃，pH=9條件下各菌株的反應(yīng)，C是在35℃，pH=9條件下各菌株的反應(yīng)。從圖3中得出菌株lp08在25℃，pH=9條件下有最大的酶活性。

圖1 產(chǎn)脂肪酶菌株初篩結(jié)果［17］

圖2 產(chǎn)脂肪酶菌株復(fù)篩結(jié)果［17］

圖3 4種不同菌株產(chǎn)的脂肪酶在維多利亞藍(lán)瓊脂平板上形成的環(huán)的大?。?9］

2.2 常規(guī)誘變育種

目前，脂肪酶菌株誘變育種中，物理誘變劑是以紫外線為主，紫外光譜的作用光譜正好與細(xì)胞內(nèi)核酸的吸收光譜相一致，因此，在紫外光作用下能使DNA鏈斷裂、DNA分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)形成嘧啶二聚體，從而，導(dǎo)致菌體的遺傳性狀發(fā)生改變。譚珍連、梁靜娟等人［20］以白地霉GXU08為出發(fā)菌，對(duì)其進(jìn)行原生質(zhì)體紫外誘變選育，其結(jié)果：篩選得到6株脂肪酶活力比出發(fā)菌株GXU08高的突變菌株，其中，菌株4-39的酶活比GXU08提高了63.2%。突變株經(jīng)9次傳代，3次搖瓶復(fù)篩，其脂肪酶的酶活性保持穩(wěn)定，為今后進(jìn)一步研究不同的育種方法進(jìn)一步提高脂肪酶的產(chǎn)量打下了基礎(chǔ)。化學(xué)誘變劑常用的有亞硝酸、亞硝酸胍、硫酸二乙酯等，例如亞硝酸主要作用于DNA分子的嘌呤堿基。呂熹、王剛等人［21］以蠟狀芽孢桿菌SW06為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變篩選得到突變株BZ-3，其產(chǎn)脂肪酶的活力較SW06高2.49倍。再對(duì)BZ-3進(jìn)行亞硝酸鈉誘變，得到突變株BF-3，產(chǎn)脂肪酶活力較SW06提高4.11倍。將BF-3傳到第5代，其產(chǎn)酶較穩(wěn)定。一般可以通過(guò)誘變育種將脂肪酶的產(chǎn)量提高1～10倍。

2.3 脂肪酶基因工程菌的構(gòu)建

通常情況下，常規(guī)育種方法很難滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，通過(guò)基因工程［22-23］手段克隆相應(yīng)的脂肪酶基因，然后在異源宿主菌中實(shí)現(xiàn)大量表達(dá)，從而大幅提高脂肪酶的產(chǎn)量。1988年丹麥Novo公司成功將柔毛腐質(zhì)霉的堿性脂肪酶基因克隆導(dǎo)入適合發(fā)酵生產(chǎn)的米曲霉工程菌株中，脂肪酶產(chǎn)量提高了近1000倍，實(shí)現(xiàn)了年產(chǎn)幾百噸的工業(yè)化生產(chǎn)［24］。這是第一個(gè)運(yùn)用基因工程技術(shù)生產(chǎn)脂肪酶從實(shí)驗(yàn)室走向市場(chǎng)的成功范例。Ma等采用強(qiáng)啟動(dòng)子大量表達(dá)枯草芽孢桿菌（B.subtilis）脂肪酶，酶產(chǎn)量較原始菌株提高了100倍［25］。

2.4 脂肪酶培養(yǎng)基

工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中，設(shè)計(jì)一個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)基是至關(guān)重要的。培養(yǎng)基一般由碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽等組成。速效碳源有利于細(xì)菌脂肪酶的形成，黃家?guī)X［26］研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的最佳碳源和最佳氮源分別是蔗糖和酵母粉。有報(bào)道指出：當(dāng)培養(yǎng)基中含有單糖、雙糖和甘油會(huì)抑制脂肪酶產(chǎn)生［27］。一般認(rèn)為，復(fù)合氮源對(duì)微生物生長(zhǎng)及產(chǎn)酶效果較好［28］。Rashid的研究表明：添加EDTA于反應(yīng)體系中能完全抑制嗜冷假單胞菌KB700A所產(chǎn)的低溫脂肪酶的活力，而添加Ca2+能顯著提高酶活［29］。培養(yǎng)基的組成影響產(chǎn)品濃度、產(chǎn)量和效率；在商業(yè)化生產(chǎn)中，培養(yǎng)基的成本明顯影響總生產(chǎn)成本。優(yōu)化培養(yǎng)基涉及大量的實(shí)驗(yàn)研究，是一個(gè)耗費(fèi)時(shí)間精力的過(guò)程。

2.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化

影響發(fā)酵過(guò)程的因素有很多，主要包括培養(yǎng)基組成、接種量、種齡、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量、發(fā)酵周期、溶氧、pH值和通氣條件等，這些因素往往又不是獨(dú)立影響發(fā)酵過(guò)程的，常常是交互作用。除傳統(tǒng)的單因子法、正交設(shè)計(jì)法［30］在生物過(guò)程優(yōu)化中得到廣泛應(yīng)用外，響應(yīng)面法［31］在發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及過(guò)程控制中逐步得到推廣應(yīng)用，并日益顯示出優(yōu)越性。張蕾等人［32］通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burrman設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法對(duì)芽孢桿菌T3-4的產(chǎn)脂肪酶條件進(jìn)行優(yōu)化。確定最適C 、N 源分別為麥芽糖、蛋白胨+硫酸銨，碳氮比為1:3。其最適產(chǎn)酶條件為：七水硫酸鎂0.05%，蓖麻油1.5%，蛋白胨0.75%，磷酸氫二鉀0.1%，麥芽糖0.5%，硫酸銨0.3%，pH6.5 ，接種量10%。在此條件下，發(fā)酵脂肪酶活力可達(dá) 805.836 U／mL 。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成搖瓶發(fā)酵酶活力與初始相比，約提高24.79倍 。

2.6 高密度發(fā)酵［33］

高效的表達(dá)手段是獲得足夠量目的產(chǎn)物的關(guān)鍵。畢赤酵母［35-36］(Pichia pastoris)能在廉價(jià)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)至較高的細(xì)胞密度而被廣泛用于高密度發(fā)酵。由于甲醇能夠誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)載體中醇氧化酶啟動(dòng)子高效表達(dá)，柯鋒［34］對(duì)含有GCL B基因的重組畢赤酵母(Pichia pastoris)甲醇利用正型（Mut+）和甲醇利用慢型（Muts）工程菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：通過(guò)Mut+菌株的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化得出其最佳產(chǎn)酶條件的甲醇添加量為1%，而后進(jìn)行10L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化，酶活生產(chǎn)率為30.69U/(mL·h)；通過(guò)Muts菌株的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化得出其最佳產(chǎn)酶條件的甲醇添加量為0.6%，10L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵后，酶活生產(chǎn)率為27.69U/(mL·h)。

2.6 酶的分離提純［37］

酶的分離純化一般包括3個(gè)基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。首先，將所需的酶從原料中引入溶液，此時(shí)不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)。然后，再將此酶從溶液中選擇性地分離出來(lái)，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)。再其后，制成純化的酶制劑。

3 脂肪酶的分子結(jié)構(gòu)

研究表明，多數(shù)脂肪酶是一種糖蛋白，其糖基部分占分子量的2%～15%，以甘露糖為主，整個(gè)分子由親水部分和疏水部分組成，活性中心靠近分子的疏水端；來(lái)源不同的脂肪酶，其氨基酸組成數(shù)目從270～641不等，從已報(bào)道的文獻(xiàn)來(lái)看，相對(duì)分子質(zhì)量為16～200kD［38-39］。目前，脂肪酶蛋白分子的3D結(jié)構(gòu)（見圖4）已經(jīng)得到初步的闡明，大多脂肪酶都具有水解酶折疊的結(jié)構(gòu)特征，即α螺旋和β折疊（見圖5）［40］。典型的α/β水解酶折疊為一個(gè)八鏈的平行α/β結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)包含一條反平行于其他鏈的β2。第一個(gè)和最后一個(gè)螺旋αA和αF位于折疊片的一面,其他的螺旋位于另一面。α/β折疊結(jié)構(gòu)能夠?yàn)槊傅幕钚晕稽c(diǎn)提供一個(gè)穩(wěn)定的支撐結(jié)構(gòu)。

雖然來(lái)源于不同微生物的脂肪酶在分子量、氨基酸序列、底物特異性及其他理化性質(zhì)上存在較大的差異，但是它們都具有相似的α/β水解酶折疊。人們已經(jīng)利用X-衍射等手段和定向修飾等技術(shù)確定了組成脂肪酶活性中心的三元組(triad)結(jié)構(gòu)。脂肪酶的催化活性中心是由絲氨酸（Ser）、 組氨酸（His）、 天冬氨酸（Asp）組成的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)［41］。

圖4 脂肪酶的3D結(jié)構(gòu)［40］

圖5 α/β水解酶折疊圖解［40］

［40］

4 脂肪酶的特性［42-43］

4.1 催化特性

脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換（圖6）。脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反應(yīng)是在兩個(gè)彼此分離的完全不同的相界面上進(jìn)行［44］。這是脂肪酶區(qū)別于酯酶的一個(gè)特征。酯酶（EC3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最適底物是由短鏈脂肪酸（≤C8）形成的酯［45］。

圖6 油脂酯交換反應(yīng)過(guò)程中脂肪酶在油水界面被活化的示意圖［45］

4.2 底物特異性

不同來(lái)源的脂肪酶對(duì)底物油脂中脂肪酸的鏈長(zhǎng)、不飽和度及不飽和脂肪酸的雙鍵位置表現(xiàn)出不同的脂肪酸特異性［46］。例如圓弧青霉脂肪酶對(duì)短鏈(C8以下)脂肪酸形成的甘油三油酸酯有特異性，黑曲霉脂肪酶對(duì)C2-C18范圍的脂肪酸均可水解，根霉和白地霉脂肪酶對(duì)中等鏈長(zhǎng)(C8-C12)脂肪酸有強(qiáng)烈特異性。玉米、蓖麻子、油菜籽等植物種子的脂肪酶分別對(duì)三癸酸和三亞麻酸甘油酯、三蓖麻醇酸甘油酯、廿二碳酸甘油酯有很高的水解活力.豬胰脂肪酶對(duì)短鏈酸(特別是三丁酸甘油酯)水解特異性高。

4.3 位置特異性［46］

大部分脂肪酶作用于三脂酰甘油的初級(jí)位（1 位或3 位）酯鍵。研究發(fā)現(xiàn):豬胰脂肪酶僅水解1位和3位酯鍵；Noma用放射性標(biāo)記法研究蓖麻子脂肪酶特異性發(fā)現(xiàn)：其對(duì)1或3和2位酯鍵水解速度相同；Okumura研究了4種微生物脂肪酶水解甘油三油酸酯的位置特異性，結(jié)果如圖7所示：黑曲霉和根霉脂肪酶僅催化1或3位酯鍵水解，對(duì)2位酯鍵無(wú)作用；白地霉和圓弧青酶脂肪酶無(wú)位置特異性，能水解甘油三酯的所有酯鍵。

圖7 四種微生物脂肪酶水解甘油三酯機(jī)制［46］

來(lái)源于卡門柏青霉 U-150 和米曲霉的脂肪酶存在一類較特殊的脂肪酶，它僅作用于單脂?；蚨８视停鴮?duì)三脂酰甘油完全不起催化作用，與三脂酰甘油脂肪酶一起使用時(shí)，能協(xié)助或加速三脂酰甘油的徹底水解，所以被稱為單-雙脂酰甘油脂肪酶［47］。

4.4 立體特異性

酶作用的底物應(yīng)具有特定的立體結(jié)構(gòu)才能被催化。脂肪酶對(duì)三脂酰甘油立體對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)1 位和3位具有選擇性水解能力，并且能夠以不同的反應(yīng)速率選擇性催化兩種對(duì)映體。Akesson 等發(fā)現(xiàn)：來(lái)源于熒光假單胞菌脂肪酶水解2 位和3 位酯鍵的二?；视捅人馑膶?duì)應(yīng)體速度快得多。因此，可利用脂肪酶這種立體選擇性進(jìn)行動(dòng)力學(xué)拆分得到高產(chǎn)率的光學(xué)活性產(chǎn)物［48］。

5 脂肪酶的應(yīng)用

5.1 在醫(yī)藥中的應(yīng)用

脂肪酶是脂肪代謝最基本的酶，它的缺乏必將引發(fā)嚴(yán)重的健康問(wèn)題。脂肪酶的外部調(diào)節(jié)可以幫助消化，此外，脂肪酶還是一種重要的中間體標(biāo)記物或藥物靶［49］。作為診斷工具，脂肪酶的活性水平和血液中脂肪酶的水平可分別用于心臟疾病和胰臟疾病的診斷和預(yù)測(cè)，脂肪酶還用于消化不良、腸胃功能紊亂和惡性腫瘤等的治療。

5.2 在食品中的應(yīng)用

國(guó)內(nèi)外大量的研究表明:sn-1，3位專一性脂肪酶適用于生產(chǎn)結(jié)構(gòu)脂質(zhì)、母乳脂肪替代品、類可可脂和甘油二酯等［50-51］。利用脂肪酶作用反應(yīng)后,釋放出鏈較短的脂肪酸能增加和改進(jìn)食品的風(fēng)味和香味，特別是奶油和奶酪的風(fēng)味在人造黃油、點(diǎn)心和冷糕點(diǎn)等的制作中是不可缺少的；利用脂肪酶催化的醇解和醋(酯)化反應(yīng)生產(chǎn)各種香精醋(酯)作調(diào)料劑；用有專一性的微生物脂肪酶，如使用青霉屬的絲狀菌產(chǎn)生的脂肪酶將二酰甘油選擇性水解成甘油和脂肪酸，從而，增加油脂中三酰甘油的含量，提高棕櫚油等食用油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，制備精制油脂，改善面包質(zhì)量，添加脂肪酶防止來(lái)自蛋黃的污染脂肪混入產(chǎn)品中引起發(fā)泡能力的下降，改善蛋白的發(fā)泡等。

5.3 在造紙工業(yè)與皮革加工中的應(yīng)用

脂肪酶在造紙工業(yè)上的應(yīng)用主要集中在廢紙脫墨和樹脂控制這兩方面。研究表明:脂肪酶能直接分解廢紙上的油墨、涂料及色料，達(dá)成脫墨效果；去除紙漿中的樹脂，去除造紙用白水及冷卻水的黏泥。使用脂肪酶對(duì)廢紙進(jìn)行脫墨，不但脫墨效果較好，而且可以顯著減少化學(xué)制劑如燒堿、硅酸鈉、雙氧水的使用，對(duì)紙漿纖維無(wú)損傷，大大減輕污水處理的壓力，綜合成本顯著降低［52-53］。

作為一種高效無(wú)污染的脫脂劑，脂肪酶在皮革脫脂工藝上尤其具有重要的用途，在堿性條件下使得脂肪更易從皮中除去［54］。黃建忠等人［55］的研究表明:堿性脂肪酶不僅可以脫盡皮板深層油脂，而且可以軟化皮板。酶法脫脂的皮革其抗張強(qiáng)度、伸長(zhǎng)率、撕裂強(qiáng)度以及崩裂高度均優(yōu)于堿法和表面活性劑法，提高了皮革的等級(jí)率。酶法脫脂皮板柔軟、富有彈性、粒面毛孔清晰,且毛光亮柔軟，對(duì)皮革質(zhì)量有明顯的提高。

5.4 在洗滌工業(yè)中的應(yīng)用［56-57］

對(duì)人們衣服所附污垢進(jìn)行詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)：脂肪污垢約占總污垢的3/4。以前的洗滌劑主要靠表面活性劑和助劑的作用去除，效果不是很理想，尤其是甘油三脂［58］。由于脂肪酶能高效地將甘油三酯分解為容易去除的脂肪酸和甘油，因此，在洗滌劑中添加脂肪酶可以大大提高對(duì)脂肪污垢的去除效果。此外，由于添加酶制劑，可以減少洗滌劑中的表面活性劑及無(wú)機(jī)助劑(尤其是三聚磷酸鈉)的用量，可以大大減少環(huán)境污染。

5.5 催化合成生物柴油

如今，人類對(duì)不可再生能源的依賴不斷增強(qiáng)，以生物手段研發(fā)新的可再生能源成為人們關(guān)注的課題，生物柴油就是其中一種。它是指以可產(chǎn)生油料的動(dòng)物、植物、微生物及各種油脂（如動(dòng)物油脂、油料作物、垃圾油等）為原料，以合適的生物手段將其轉(zhuǎn)化成為可再生性柴油燃料，而最典型的生物柴油是脂肪酸甲酯［59］。姚志龍、 閔恩澤［60］在研究中指出，生物柴油是以動(dòng)植物油脂、餐飲業(yè)廢油或工程微藻等為原料制成的高級(jí)脂肪酸甲酯。由于脂肪酶較多適用于長(zhǎng)鏈脂肪醇的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，對(duì)短鏈脂肪醇的效果不甚明顯，所需酶類的成本較高，重復(fù)利用率又不高等缺點(diǎn)，目前,國(guó)內(nèi)外都尚未將脂肪酶催化合成生物柴油進(jìn)行較大規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)。

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Study on Properties and Application of Microbial Lipase

Yang Yuan, Zhang Jian
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Shanxi University, Taiyuan030006, Shanxi, China)

Lipase is one of the important industrial enzymes. Microorganism is the main source of the lipase. Lipase is widely used in the field of medicine, food industry, washing industry and related areas. Types of lipase and the construction of genetic engineered bacteria, optimization of fermentation, separation and purification involved in fermentation process were reviewed, and properties and application of lipase were summarized based on the molecular structure of lipase, which provides convenience for further study of lipase in the future.

microorganism; lipase; detergent; fermentation

TQ925；TQ649

A

1672-2701（2017）04-47-08

2016年度山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃國(guó)際合作資助項(xiàng)目(201603D421029)。

楊 媛女士，研究生； E-mail：1162403532@qq.com。

張 劍女士，教授，博士； E-mail：zhangjian0923@vip.sina.com。