胡禮儀，侯永彬，余莉華，米永華，王科，劉北忠

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院，重慶402160)

·論著·

白芍總苷對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制探討

胡禮儀，侯永彬，余莉華，米永華，王科，劉北忠

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院，重慶402160)

目的 觀察白芍總苷(TPG)對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，并探討其作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人肝癌ADM敏感細(xì)胞BEL-7402(親本組)和ADM耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM(耐藥組)，將BEL-7402/ADM細(xì)胞轉(zhuǎn)染HDAC3基因siRNA干擾質(zhì)粒(干擾組)及空載質(zhì)粒(空載組)24 h，用白芍總苷孵育BEL-7402/ADM細(xì)胞48 h(用藥組)。取親本組、耐藥組、用藥組細(xì)胞，分別以不同濃度ADM作用48 h；MTT法測(cè)算增殖抑制率，計(jì)算各組ADM的半數(shù)抑制濃度(IC50)。取親本組、耐藥組、空載組、干擾組及用藥組細(xì)胞，分別采用RT-qPCR法和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞多藥耐藥基因MDR1和去乙?；?HDAC3)mRNA和蛋白。結(jié)果 親本組、耐藥組和用藥組細(xì)胞ADM的IC50分別為0.139、8.807、4.890 nmoL/L；用藥組細(xì)胞對(duì)ADM耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.80倍,逆轉(zhuǎn)率為45.23%。MDR1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量耐藥組、空載組>用藥組>干擾組>親本組(P均<0.05或0.01)，HDAC3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量耐藥組、空載組>干擾組>親本組、用藥組(P均<0.05或0.01)。結(jié)論 白芍總苷通過(guò)抑制HDAC3的表達(dá)，引起MDR1表達(dá)下調(diào)，從而逆轉(zhuǎn)BEL-7402/ADM細(xì)胞的耐藥性。

肝癌；白芍總苷；耐藥；siRNA干擾；半數(shù)抑制濃度；多藥耐藥基因；去乙酰化酶

肝癌的主要病因?yàn)楦窝缀透斡不痆1],較其他癌癥病死率高。目前，藥物化療如阿霉素(ADM)是其常規(guī)治療方法，但腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥(MDR)嚴(yán)重影響化療效果。組蛋白去乙?；?HDAC)通過(guò)表觀遺傳調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，增強(qiáng)癌細(xì)胞耐藥性，影響癌細(xì)胞的增殖和分化，是一類(lèi)新型癌癥藥物靶點(diǎn)；肝癌組織中HDAC3表達(dá)顯著增高，且與肝癌預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[2]。目前，臨床上主要應(yīng)用環(huán)孢素A和異博定等來(lái)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥作用，但不良反應(yīng)較大，患者耐受程度較低。中藥在抗癌方面具有有效性高和不良反應(yīng)低的特點(diǎn)，尋找能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性且患者耐受程度高的中藥在臨床應(yīng)用中具有重要價(jià)值[3，4]。有文獻(xiàn)[5]報(bào)道，白芍對(duì)肝炎和其他慢性肝病有治療作用，白芍總苷是其主要有效成分。2014年4月～2016年3月，我們探討白芍總苷對(duì)人肝癌耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM的逆轉(zhuǎn)作用，并以siRNA干擾HDAC3表達(dá)分析其作用機(jī)制，以期為臨床上逆轉(zhuǎn)耐藥提供更多的藥物選擇。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌ADM敏感細(xì)胞BEL-7402(親本組)和ADM耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM(耐藥組)均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所，將細(xì)胞置于含10% FBS、1%青鏈霉素和1%谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)液中，BEL-7402/ADM細(xì)胞培養(yǎng)液中含5 mg/L ADM(海正制藥)維持其耐藥性[6]，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)用0.25%胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代；實(shí)驗(yàn)前2周BEL-7402/ADM細(xì)胞換用無(wú)ADM的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HDAC3基因siRNA干擾質(zhì)粒及空載質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建，參考質(zhì)粒轉(zhuǎn)染手冊(cè)分別轉(zhuǎn)染BEL-7402/ADM細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后獲得干擾組和空載組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 白芍總苷用藥前后BEL-7402/ADM細(xì)胞對(duì)ADM耐藥逆轉(zhuǎn)情況觀察

1.2.1 白芍總苷用藥濃度篩選 白芍總苷片購(gòu)自三九集團(tuán)(批號(hào)20011201，每片0.3 g，含芍藥苷104 mg)，用PBS稀釋為40 mg/mL溶液分裝凍存?zhèn)溆谩２捎肕TT法觀察白芍總苷對(duì)BEL-7402/ADM細(xì)胞增殖的影響：用完全培養(yǎng)液稀釋BEL-7402/ADM細(xì)胞至2×104/mL，吹打混勻后，接種200 μL于96孔培養(yǎng)板；將細(xì)胞分為觀察組和對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔；在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，吸去上清液。觀察組依次加入含不同濃度(10、20、40、80、160 μg/mL)白芍總苷的培養(yǎng)液，對(duì)照組培養(yǎng)液不含白芍總苷，繼續(xù)孵育48 h后棄培養(yǎng)液；每孔加入無(wú)血清培養(yǎng)液及5 mg/mL的MTT各20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液；每孔加入二甲亞颯(DMSO)200 μL，震蕩10 min，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司，美國(guó))測(cè)定490 nm波長(zhǎng)時(shí)各孔吸光度值(A值)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取3次平均值。增殖抑制率=(觀察組A值-對(duì)照組A值)/對(duì)照組A值×100%。以增殖抑制率為y坐標(biāo)，白芍藥苷濃度為x坐標(biāo),進(jìn)行回歸分析，求得白芍藥苷對(duì)BEL-7402/ADM細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為71.58 μg/mL。

1.2.2 BEL-7402/ADM細(xì)胞對(duì)ADM敏感性檢測(cè) 取親本組、耐藥組細(xì)胞，用藥組將BEL-7402/ADM細(xì)胞用71.58 μg/mL白芍總苷孵育48 h；三組均加入0.90、1.80、3.60、7.20、14.4、28.8、57.6 μmol/L的ADM作用48 h。采用MTT法測(cè)算增殖抑制率，方法同1.2.1。使用改良寇氏法計(jì)算各組細(xì)胞ADM的IC50，并計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)及逆轉(zhuǎn)率。

1.3 白芍總苷用藥前后BEL-7402/ADM細(xì)胞MDR1和HDAC3檢測(cè)

1.3.1 MDR1和HDAC3 mRNA檢測(cè) 采用RT-qPCR法。取親本組、耐藥組、空載組、干擾組及用藥組細(xì)胞，按照TRIzol試劑盒(Life Technologies,美國(guó))說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，使用NanoDrop?ND-1000紫外吸收法測(cè)定RNA濃度與純度，A260/A280值1.8～2.1。按照Prime ScriptTMRT試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)說(shuō)明合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。MDR1上游引物5′-AAGCTTAGTACCAAAGAGGCTCTG-3′，下游引物5′-GGCTAGAAACAATAGYGAAAACAA-3′；HDAC3上游引物5′-TCTGGGCTGTGATCGATTG-3′，下游引物5′-CTTGACATATTCAACGCATTCC-3′；β-actin上游引物5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，下游引物5′-CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′；均由大連寶生生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：10 μL SYBR?Primer Ex TaqⅡ qPCR，0.4 μL 10 μmol/L PCR上下游引物，2 μL cDNA模板和7.2 μL高壓水。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線溫度55～99 ℃，每2秒下降5 ℃。逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR均在ABI Prism7900 System(Applied Biosystems,美國(guó))儀器中進(jìn)行。采用2-ΔΔCt法[7]計(jì)算基因表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參基因校正得出相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 MDR1和HDAC3蛋白檢測(cè) 采用Western blot法。取親本組、耐藥組、空載組、干擾組及用藥組細(xì)胞，用凱基全蛋白提取試劑盒(江蘇生物技術(shù)股份有限公司)提取細(xì)胞總蛋白；經(jīng)Bradford法定量后制樣，濃度為1 μg/μL。每孔加20 μL蛋白于8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠中90 V電泳2 h；采用半干轉(zhuǎn)，0.3 mA轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)50 min；在室溫下用5%(W/V)的脫脂牛奶封閉膜2 h；切膜后孵育一抗：MDR1(CST公司；180 kD,1∶1 000)、HDAC3(CST公司，49 kD,1∶1 000)和β-actin(CST公司，42 kD,1∶3 000)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；TBST漂洗3次，10 min/次。用山羊抗兔二體(CST公司，1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST漂洗3次，10 min/次；膜與Beyo ECL Plus(碧云天生物技術(shù)研究所)反應(yīng)1 min后，經(jīng)Chemidoc XRS(Bio-Rad公司，美國(guó))顯影，用Quantity One軟件分析處理。以β-actin蛋白的信號(hào)條帶為內(nèi)參，對(duì)目的條帶(MDR1、HDAC3)光密度值進(jìn)行半定量，得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 白芍總苷對(duì)BEL-7402/ADM細(xì)胞ADM耐藥性逆轉(zhuǎn)情況 親本組、耐藥組和用藥組細(xì)胞ADM的IC50分別為0.139、8.807、4.890 nmoL/L；用藥組細(xì)胞對(duì)ADM耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.80倍，逆轉(zhuǎn)率為45.23%。

2.2 白芍總苷對(duì)MDR1和HDAC3 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 MDR1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量耐藥組、空載組>用藥組>干擾組>親本組(P均<0.05或0.01)，HDAC3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量耐藥組、空載組>干擾組>親本組、用藥組(P均<0.05或0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞MDR1、HDAC3 mRNA及蛋白表達(dá)比較±s)

注：與親本組比較，aP<0.05,bP<0.01；與耐藥組、空載組比較,cP<0.05，dP<0.01；與干擾組比較，eP<0.05。

3 討論

白芍為毛莨科植物芍藥的干燥根，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其有補(bǔ)血、補(bǔ)氣、止痹、疏通經(jīng)絡(luò)的作用，可以治療自身免疫類(lèi)疾病、風(fēng)濕性疾病、肝炎及肝硬化等。白芍的主要藥效成分是一組糖苷類(lèi)物質(zhì)，其中芍藥苷占總苷量的90%以上[5]。通過(guò)對(duì)白芍總苷的藥理及臨床研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可以通過(guò)多種途徑抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎、止痛、保肝作用。晏雪生等[8]報(bào)道，芍藥苷可抑制BEL-7402細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，用藥組細(xì)胞對(duì)ADM耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.80倍,逆轉(zhuǎn)率為45.23%。說(shuō)明白芍總苷對(duì)BEL-7402/ADM細(xì)胞的耐藥性有逆轉(zhuǎn)作用。

MDR1基因可編碼P-糖蛋白(P-gp)[9]，P-gp是一種位于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可通過(guò)水解ATP供能，逆濃度梯度將抗腫瘤藥物泵出細(xì)胞外來(lái)實(shí)現(xiàn)耐藥[10,11]。本研究結(jié)果顯示，白芍總苷可使耐藥細(xì)胞MDR1 mRNA和蛋白表達(dá)降低，可能導(dǎo)致P-gp在細(xì)胞膜上分布減少，使細(xì)胞泵出ADM的作用明顯減弱，細(xì)胞內(nèi)ADM濃度升高，增強(qiáng)ADM對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，從而實(shí)現(xiàn)其逆轉(zhuǎn)耐藥作用。但是，白芍總苷是經(jīng)過(guò)何種途徑降低MDR1 mRNA和蛋白表達(dá)尚不明確。

HDAC是一類(lèi)基因表達(dá)調(diào)控重要的蛋白酶家族，在全身多處組織表達(dá)[12]。其中，HDAC3與多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)，是明確的致癌基因[2]。Liby等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HDAC3在高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)染色。有研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中HDAC3高表達(dá)，且是患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。HDAC3也在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，在結(jié)腸癌的侵襲以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用[14]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，腫瘤抗原MageA2通過(guò)招募HDAC3到p53的轉(zhuǎn)錄位置形成復(fù)合物，能同時(shí)損害p53的乙酰化和p53結(jié)合位點(diǎn)周?chē)慕M蛋白乙?；?，并顯著下調(diào)p53的轉(zhuǎn)錄水平，隨后使得黑色素瘤細(xì)胞對(duì)依托泊甙產(chǎn)生抗藥性。通常情況下，胞質(zhì)內(nèi)HDAC3與IκBα/NF-κB構(gòu)成靜默復(fù)合體，HDAC3抑制NF-κB的功能作用，當(dāng)靜默復(fù)合體解離時(shí)， HDAC3和NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在很多腫瘤中過(guò)度激活，對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)失控[12]。有研究[15]報(bào)道，木蝴蝶素通過(guò)p53/NF-κB 通路抑制乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM的增殖，從而減少M(fèi)DR1基因編碼P-gp的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)阿霉素的抵抗作用。本研究干擾組通過(guò)干擾BEL-7402/ADM細(xì)胞HDAC3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MDR1基因表達(dá)顯著下調(diào)，這與用藥組結(jié)果趨勢(shì)一致。從而證明，白芍總苷通過(guò)下調(diào)BEL-7402/ADM細(xì)胞中HDAC3基因表達(dá)，降低其耐藥性。因此推測(cè)，白芍總苷具有HDAC3抑制劑活性，通過(guò)抑制HDAC3的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)中核小體組蛋白的乙酰化水平，進(jìn)而下調(diào)MDR1基因的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥細(xì)胞的耐藥性。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于沒(méi)有進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)沒(méi)有進(jìn)一步探索HDAC3逆轉(zhuǎn)MDR1的分子機(jī)制，有待今后完善。

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Reversing effects of total glucosides of paeony on drug resistance of BEL-7402/ADM cells

HULiyi,HOUYongbin,YULihua,MIYonghua,WANGKe,LIUBeizhong

(YongchuanHospitalAffiliatedtoChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China)

Objective To observe the reversing effects of total glucosides of paeonia (TPG) on drug resistance of BEL-7402/ADM cells in hepatocellular carcinoma.Methods Human hepatocellular carcinoma ADM sensitive BEL-7402 cells (parent group) and ADM drug-resistant BEL-7402/ADM cells (drug resistance group) were cultured in vitro. BEL-7402/ADM cells were transfected with HDAC3 siRNA interference plasmid (interference group) and empty plasmid (empty plasmid group) for 24 h, respectively, and BEL-7402/ADM cells were incubated with TPG for 48 h (drug group). Different concentrations of ADM were administered to cells in the parent group, drug resistance group and drug group for 48 h respectively. Then MTT assay was used to detect the growth inhibition rates and IC50of ADM in each group. The mRNA and protein expression of MDR1 and histone deacetylase 3 (HDAC3) was detected by RT-qPCR and Western blotting in the above grovps. Results IC50of ADM was 0.139 nmoL/L in the parent group, 8.807 nmoL/L in the drug resistance group and 4.890 nmoL/L in the drug group. Drug reverse ratio was about 1.80 times higher and the reverse transcription ratio was 45.23% in the drug group. The relative expression of MDR1 mRNA and protein was: drug resistance group, empty plasmid group>drug group>interference group>parent group (allP<0.05, 0.01), the relative expression of HDAC3 and protein was: drug resistance group, empty plasmid group>interference group>parent group, drug group (allP<0.05, 0.01).Conclusion TPG induces the down-regulated expression of MDR1 by inhibiting the HDAC3 expression, thus reversing the drug resistance of BEL-7402/ADM cells.

hepatoma carcinoma; total glucosides of paeony; drug resistance; siRNA interference; 50% inhibition concentration; multidrug resistance gene; histone deacetylase

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院引進(jìn)人才資助項(xiàng)目(YJYJ201306)。

胡禮儀(1972-)，男，碩士研究生，副主任技師，主要研究方向?yàn)槟[瘤早期診斷的生物標(biāo)志物。E-mail： hlyhhy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.001

R735.7

A

1002-266X(2017)10-0001-04

2016-09-24)