田紅，黃桂華，朱圣俊，竇明金

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250022；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院；3 山東大學(xué)藥學(xué)院)

·藥學(xué)研究·

載氯諾昔康殼聚糖關(guān)節(jié)腔注射用溫敏凝膠的制備及體外釋藥性觀察

田紅1，2，黃桂華3，朱圣俊1,2，竇明金2

(1濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250022；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院；3 山東大學(xué)藥學(xué)院)

目的 制備關(guān)節(jié)腔注射用載氯諾昔康(Lnxc)殼聚糖溫敏凝膠，觀察其理化性質(zhì)及體外釋藥性。方法 以殼聚糖、β-甘油磷酸鈉(β-GP)為材料制備載Lnxc溫敏凝膠，以膠凝溫度、時間、通針性為評價指標(biāo)，優(yōu)化處方工藝；采用椎板法觀察凝膠的流變學(xué)性質(zhì)，采用離心試驗、溫度試驗觀察凝膠的穩(wěn)定性，采用動態(tài)膜透析法觀察載Lnxc溫敏凝膠和Lnxc溶液的體外釋藥特性。結(jié)果 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的最佳處方為Lnxc 2 mg、3% 殼聚糖、60%β-GP、pH 7.2，所制備的溫敏凝膠屬于非牛頓流體，離心后無分層現(xiàn)象，4 ℃和25 ℃條件下呈流動狀，37 ℃發(fā)生相變形成凝膠。Lnxc溶液8 h藥物累積釋放率86.70%，載Lnxc溫敏凝膠72 h藥物累積釋放率86.41% ，釋藥規(guī)律符合Higuchi方程。結(jié)論 成功制備載Lnxc殼聚糖關(guān)節(jié)腔用溫敏凝膠，其具有理想的膠凝溫度和較好的緩釋效果。

骨關(guān)節(jié)炎；氯諾昔康；殼聚糖；β-甘油磷酸鈉；溫敏凝膠；理化性質(zhì)；釋藥特性

氯諾昔康(Lnxc)是治療骨關(guān)節(jié)炎的常用藥物，目前臨床上應(yīng)用的主要是片劑和注射劑，其半衰期為3～5 h，為達(dá)到有效血藥濃度需頻繁給藥，患者依從性較差。溫敏凝膠可作為藥物的儲庫，具有緩慢釋放藥物、提高藥物療效的作用。2015年3月～2016年5月，我們以殼聚糖、β-甘油磷酸鈉(β-GP)為材料制備載Lnxc關(guān)節(jié)腔注射用溫敏凝膠，經(jīng)優(yōu)化處方工藝后觀察其理化性質(zhì)及體外釋藥性。

1 儀器與試劑

ER-182A型電子天平(日本)，AL104-IC精密分析天平(瑞士梅特勒公司)；電磁攪拌儀，HZ-8812S恒溫振蕩器(華利達(dá)公司)，TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；移液器(德國Eppendorf公司) ，臺式 pH 計(梅特勒公司，瑞士)。殼聚糖(SIGMA-ALDRICH),β-甘油磷酸鈉(β-GP，上海恒斐生物科技有限公司)，Lnxc(湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司)，其他試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的預(yù)制備 稱取適量的殼聚糖溶解于0.1% mol/L的醋酸溶液1 mL中，在磁力攪拌作用下充分溶解；在冰浴條件下，將適量60%的β-GP溶液緩緩滴入殼聚糖醋酸溶液中，充分?jǐn)嚢?0 min后制備得空白溫敏凝膠。將Lnxc粉碎后過80目篩，稱取適量，將其混懸于空白溫敏凝膠中即得載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠。膠凝溫度(36.5±0.5)℃，膠凝時間(4±0.5)min，通針性良好。

2.2 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠制備工藝的優(yōu)化

2.2.1 殼聚糖濃度 配制1%、2%、3%、4%的殼聚糖醋酸溶液各1 mL，冰浴攪拌條件下緩慢滴入相同量60%的β-GP溶液，調(diào)節(jié)pH到7.0。以膠凝溫度、膠凝時間及通針性作為評價指標(biāo)，在水浴加熱條件下觀察不同濃度的殼聚糖對載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠形成的影響，采用倒置法觀察凝膠的形成。膠凝溫度隨著殼聚糖濃度的增大而降低，1%殼聚糖通針性較好，但直至50 ℃未形成凝膠；2%殼聚糖通針性良好，膠凝溫度46 ℃且膠凝時間較長(556 s)，不利于藥物在關(guān)節(jié)腔形成凝膠；3%殼聚糖通針性良好，膠凝溫度為37.8 ℃且膠凝時間為261 s；4%殼聚糖膠凝溫度31 ℃，膠凝時間268 s，但通針性較差，不宜注射。因此，以3%的殼聚糖為最佳。

2.2.2 β-GP濃度 配制3%殼聚糖醋酸溶液2份各1 mL，分別滴加30%和60%的β-GP，調(diào)節(jié)pH到7.0。以膠凝溫度、膠凝時間及通針性作為評價指標(biāo)，水浴加熱條件下觀察不同濃度的β-GP對載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的形成的影響。30%β-GP形成凝膠的膠凝溫度為37.5℃、膠凝時間為311 s，60%β-GP形成凝膠的膠凝溫度為37.3℃、膠凝時間為287 s。但是30%β-GP形成凝膠后體系外含有少量的流動狀液體，60%β-GP則形成了均一、穩(wěn)定的凝膠，故以60%β-GP為最佳。

2.2.3 pH值 配制3%殼聚糖溶液4份各1 mL，分別滴加60%的β-GP調(diào)節(jié)pH值到6.6、6.8、7.0、7.2。水浴加熱條件下，載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的膠凝溫度分別為38.7、38.2、37.7、36.9 ℃，膠凝時間分別為283、276、259、236 s，通針性均較好。因此，應(yīng)滴加60% β-GP調(diào)節(jié)pH值到7.2左右。

2.2.4 載藥量 配制3%殼聚糖溶液5份各1 mL，分別滴加60%的β-GP調(diào)節(jié)pH值到7.2，然后向其中分別加入1、1.5、2、2.5、3 mg的Lnxc。在水浴加熱條件下，載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的膠凝溫度分別為37.0、36.9、36.6、37.0、36.7 ℃，膠凝時間分別為241、239、223、267、228 s，通針性均較好。為后期釋放實驗中能達(dá)到紫外分光光度計的檢測限，故將載藥量定為2 mg。

2.3 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠流變學(xué)觀察 采用椎板法。取按最佳處方新鮮制備的載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠，將其置于平板和椎板之間的空隙中；然后，逐漸減小平板與椎體之間的距離使兩者閉合，設(shè)置穩(wěn)態(tài)剪切速率(γ)為0～1 000/s。在固定γ為10/s的條件下，記錄黏度(η，Pas)隨溫度升高的變化[7]；在37 ℃恒溫條件下，記錄剪切應(yīng)力(τ，Pa)和黏度(η，Pas)隨γ升高的變化。由圖1(a)可知，在γ不變的條件下，溫敏凝膠的η在10～27 ℃隨溫度升高而降低，27～40 ℃隨溫度升高而增大，溫度為32 ℃時的η大于10 ℃時的η。該現(xiàn)象與溫敏凝膠的物理狀態(tài)相符，即當(dāng)溫敏凝膠處于低溫條件下時為溶液狀態(tài)。27 ℃后隨溫度升高溶液η逐漸增大，32 ℃即可形成凝膠，但膠凝時間較長，36 ℃下膠凝時間較為適宜。由圖1(b)可知，當(dāng)溫敏凝膠處于37 ℃的環(huán)境下，τ隨γ增大而增大，η隨γ增大而減小，其流變學(xué)行為表現(xiàn)為假塑性流體的特征。依據(jù)Ostwald-Dewaele方程的對數(shù)形式[8]：ln η= ln k+ (n-1) ln γ。其中n值為非牛頓指數(shù)，n越小說明非牛頓流體的性質(zhì)越顯著；k為稠度系數(shù)，表示與牛頓流體偏離的程度。將γ對數(shù)值和η對數(shù)值進(jìn)行線性擬合，得方程ln η=6.0475-0.1872 ln γ 。其中n為0.81，n值小于1,說明載Lnxc溫敏凝膠屬于非牛頓流體，線性相關(guān)系數(shù)r為0.997(表明方程擬合度相對較好)。

注：a圖為溫敏凝膠的η隨溫度變化的趨勢；b圖為溫敏凝膠的τ、η隨γ變化的趨勢。

圖1 載Lnxc溫敏凝膠流變學(xué)性質(zhì)分析

2.4 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的穩(wěn)定性觀察

2.4.1 離心試驗 將新鮮制備的溫敏凝膠置于10 mL的離心管中，以3 000 r/min離心20 min，凝膠無分層現(xiàn)象。

2.4.2 溫度試驗 將新鮮制備的溫敏凝膠分裝于西林瓶中，密封后分別置于-20 ℃、4 ℃、25 ℃的條件下。第10天-20 ℃條件下的凝膠出現(xiàn)結(jié)冰現(xiàn)象，4 ℃和25 ℃條件下的凝膠無任何變化，因此該凝膠應(yīng)貯存于4～25 ℃的環(huán)境中。

2.5 載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的體外釋放試驗 采用動態(tài)膜透析法。制備載Lnxc溫敏凝膠和濃度為1 mg/mL Lnxc溶液，分別吸取1 mL和2 mL置于截留分子量為8 000～14 000 Da的透析袋中。將透析袋兩端用細(xì)繩扎緊，置于37 ℃恒溫水浴中平衡5 min，使載藥溫敏凝膠膠凝。將載藥凝膠和藥物溶液分別置于含28 mL PBS釋放介質(zhì)釋放介質(zhì)(含1%吐溫-80，pH 7.4)的離心管中，將離心管置于轉(zhuǎn)速為100 r/min、水浴溫度為37 ℃的搖床中震蕩，按以上操作平行3次試驗。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h取5 mL釋放介質(zhì)，同時補(bǔ)充5 mL 37 ℃的新鮮釋放介質(zhì)，采用紫外分光光度法測定Lnxc釋放量。

由圖2可知，Lnxc溶液在釋放介質(zhì)中釋放較為迅速，8 h的累積釋放率達(dá)到86.7%；而Lnxc凝膠釋放較為緩慢，8 h的累積釋放率為43.36%，72 h的累積釋放率達(dá)到86.41%，緩釋效果顯著。Lnxc溶液和載藥溫敏凝膠的體外釋藥均符合Higuchi方程，回歸系數(shù)r分別為0.992和0.990,說明藥物均勻的分布在載體中。采用Peppas方程[9]分析Lnxc溶液和載藥溫敏凝膠的釋藥機(jī)制,得方程Log Q=0.389 1 Log t+1.611和Log Q=0.324 2 Log t+1.342，釋藥系數(shù)n分別為0.381 9和0.324 2。對于圓柱形制劑，當(dāng)n≤0.45時藥物的釋放機(jī)制為Fickian擴(kuò)散，回歸系數(shù)r分別為0.997和0.993。

注：sol為Lnxc溶液；gel為載Lnxc溫敏凝膠

圖2 Lnxc溶液和載Lnxc溫敏凝膠的體外釋放曲線

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種最常見的關(guān)節(jié)疾病，主要是由關(guān)節(jié)軟骨變性，關(guān)節(jié)軟骨的蛋白多糖生物合成異常導(dǎo)致的退行性病變[1]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Lnxc是一種非甾體抗炎藥，通過抑制環(huán)氧合酶和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶，防止炎癥介質(zhì)的生成，廣泛應(yīng)用于術(shù)后疼痛和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[2]。溫敏凝膠是指以溶液狀態(tài)給藥后，通過高分子材料對外界溫度的響應(yīng)而發(fā)生相轉(zhuǎn)變，由液態(tài)轉(zhuǎn)化為非化學(xué)交聯(lián)的半固體凝膠制劑[3]，用于病變部位的局部給藥可延長釋藥周期、降低給藥劑量和藥物不良反應(yīng)，且工藝相對簡單[4]。殼聚糖是一種天然的陽離子生物多糖，其本身無溫敏性，但在其骨架上嫁接如異丙基丙烯酰胺、聚乙二醇、β-GP后即具有顯著溫敏特性[5]。殼聚糖/β-GP溫敏凝膠具有生理中性、37 ℃即可凝膠化、延緩藥物釋放等特點，可以作為藥物的載體材料[6]。

因殼聚糖難溶于大部分的有機(jī)溶劑、水和堿，因此本文將殼聚糖溶解于0.1%的醋酸溶液中。在稀酸條件下，殼聚糖上的氨基被質(zhì)子化，破壞了其分子內(nèi)部的氫鍵和立體規(guī)整性，羥基與水分子發(fā)生水合作用，導(dǎo)致殼聚糖分子溶脹而溶解[10]。β-GP是一種弱堿，加入到含有醋酸的殼聚糖溶液中，首先中和游離的氫離子，使溶液的pH升高(pH≥6.2)；殼聚糖鏈上的電荷密度減少,降低了殼聚糖鏈間的靜電排斥力,使疏水鍵和氫鍵引力相對提高，從而出現(xiàn)沉淀；繼續(xù)加入β-GP ,弱堿作用使β-GP上的磷酸鹽和殼聚糖上的胺基相互吸引而使甘油部分暴露 ,殼聚糖鏈分離，因此殼聚糖在較高的 pH 值下仍然可以保持液態(tài)[11]。溫度升高后,由于分子熱運(yùn)動加強(qiáng)，靜電斥力下降，殼聚糖與水之間的氫鍵作用降低，使得溫敏凝膠的η降低；當(dāng)疏水鍵和殼聚糖鏈間氫鍵的引力大于鏈間的靜電排斥力時,殼聚糖分子相互聚集，η增加，發(fā)生物理結(jié)合形成凝膠。本研究結(jié)果顯示，載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠的最佳處方為Lnxc 2 mg、3% 殼聚糖、60%β-GP、pH 7.2，所制備的溫敏凝膠屬于非牛頓流體，離心后無分層現(xiàn)象，4 ℃和25 ℃條件下呈流動狀，37 ℃發(fā)生相變形成凝膠。Lnxc溶液8 h藥物累積釋放率86.70%，載Lnxc溫敏凝膠72 h藥物累積釋放率86.41% ，釋藥規(guī)律符合Higuchi方程。

綜上所述，所制備的載Lnxc殼聚糖溫敏凝膠性質(zhì)穩(wěn)定，體外釋放結(jié)果顯示具有良好的緩釋作用。盡管體外釋放條件已模擬體內(nèi)條件，但是與體內(nèi)真實情況依然具有一定的差異性，因此還需體內(nèi)藥物動力學(xué)的評價進(jìn)一步研究其緩釋效果。

[1] Pearle AD, Warren RF, Rodeo SA. Basic Science of Articular Cartilage and Osteoarthritis [J]. Clin Sports Med, 2005,24(1): 12.

[2] Shah PA, Bashir S, Tariq I, et al. Fabrication of lornoxicam loaded eudragit L-100 microcapsules by spray drying[J]. Lat Am J Pharm, 2014,33(5):828-834.

[3] 趙宇,王曉波,張治然,等.溫敏凝膠的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].中國藥房,2015,26(1):132-135.

[4] 陳燕軍,劉華鳳,金日顯,等.可注射硫酸延胡索總堿溫度敏感型原位凝膠的制備及其體外釋藥評析[J]. 中國新藥雜志,2010,25(23):2132-2137.

[5] 沈晶晶,劉宏,熊康萍.溫度敏感型凝膠基質(zhì)的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志,2015,24(7):800-803.

[6] 郭亞可,李曉娟,熊慶,等.含氨基化碳納米管的殼聚糖/β-甘油磷酸鈉溫敏凝膠的制備及性能研究[J].中國藥學(xué)雜志,2014, 49(1):54-60.

[7] 李廷廷.納米金和鹽酸多柔比星雙載型溫敏凝膠用于腫瘤放化療的研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2016.

[8] Ghannam MT, Esmail MN. Rheological properties of carboxymethyl cellulose[J]. J Appl Polym Sci, 1997,64(2): 289-301.

[9] Costa P, Lobo JMS. Modeling and comparison of dissolution profiles[J]. Eur J Pharm Sci, 2001,13(2):123-133.

[10] 陳晨.殼聚糖基溫敏原位凝膠的制備及性能研究[D].天津:天津大學(xué),2012.

[11] 劉愛紅,孫康寧,李愛民.殼聚糖-甘油磷酸鈉溫敏凝膠的制備與表征[J].材料導(dǎo)報,2010,24(7B):116-119.

山東省科技發(fā)展計劃項目 (2014GSF121012)。

竇明金(E-mail: mingjindou1965@126.com)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.036

R944.9

A

1002-266X(2017)10-0100-03

2016-11-12)