梁振昌

(廣東省中山市石岐蘇華贊醫(yī)院 檢驗科, 廣東 中山, 528400)

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乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)與血清免疫逃逸變異HBsAg的關系

梁振昌

(廣東省中山市石岐蘇華贊醫(yī)院 檢驗科, 廣東 中山, 528400)

乙型肝炎病毒; 酶聯(lián)免疫吸附試驗; 乙肝表面抗原

乙型肝炎病毒(HBV)屬于一種脫氧核糖核酸(DNA)病毒，隸屬于嗜肝DNA病毒科，是當前醫(yī)學界已知的、具有廣泛傳播性的病毒類型，不僅對患者正常工作生活帶來嚴重影響，同時也在一定程度上加劇了疾控工作壓力與難度，產(chǎn)生的社會影響較為深遠[1]。雖然乙型肝炎病毒DNA、抗原、特異性抗體三種標志物均可以在乙肝病毒患者外周靜脈血之中被檢測出來，但是部分患者在進行酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測時，其HBsAg檢測信號常常處于灰區(qū)范圍，使得臨床診斷存在較大爭議[2]。本文針對乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)與乙肝病毒免疫逃逸變異(HBV IEM)的關系展開深入研究，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2014年1月—2016年2月篩選出來的100例乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)的乙型肝炎病毒患者為研究對象，其中男65例，女35例; 年齡38～65歲，平均年齡(45.5±1.5)歲; 臨床表現(xiàn)：面色晦暗、食欲不振、消瘦、營養(yǎng)不良、腹脹、上腹部不適。納入標準: ① 經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測確定其乙肝HBsAg檢測信號處于灰區(qū)者; ② 無免疫系統(tǒng)缺陷或疾病者; ③ 已經(jīng)簽署知情同意書者。排除標準: ① 既往具有肝炎史者; ② 生化指標數(shù)值劇烈波動者; ③ 不同意本次研究方案者。

1.2 方法

在征得所有患者知情同意下采用G6-ELISA以及市面上銷售的ELISA檢測試劑對乙肝患者血清免疫逃逸變異HBsAg進行檢測。首先，采用中山生物工程科技有限公司生產(chǎn)的乙型肝炎病毒HBsAg檢測試劑盒對本次研究入組的100例乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)的乙型肝炎病毒患者血清HBsAg進行檢測，檢測步驟嚴格按照檢測試劑盒說明書要求執(zhí)行。在市售ELISA檢測工作完畢后實施G6-ELISA檢測，具體檢測流程如下: ① 將單克隆抗體(mAb)采用pH 9.6的碳酸緩沖液進行稀釋，隨后將稀釋后的G6-mAb緩沖液逐一添加到酶標反應板的各個孔中，劑量以85 μL為宜，于4 ℃環(huán)境下靜置12 h[3]。② 將過夜的G6-mAb樣本采用加入非離子表面活性劑(Tween-20)的磷酸緩沖液(PBS)反復予以洗滌，每次洗滌持續(xù)時間為60 s, 隨后向其加入2%的牛血清白蛋白(BSA)每孔85 μL, 放置在37 ℃環(huán)境下封閉2 h[4]。③ 將稀釋液樣本中封閉液去除并向其中添加不同稀釋濃度的待檢測血清樣本，每個酶標反應孔50 μL, 同樣置于37 ℃環(huán)境下孵育30 min。④ 洗板步驟同上，再次向其添加50 μL的羊抗HBS-HRP后同樣條件、同樣孵育時間操作。⑤ 洗板、孵育環(huán)境和時間同上，再次添加TMB-H2O2溶液進行顯色，顯色時間為10 min, 之后以2 mol/L硫酸溶液終止反應后將其置于酶標儀上，對450 nm波長處吸光度進行測定, P/C數(shù)值≥2.1為此次研究陽性判定標準[5-6]。

1.3 觀察指標

本次研究中所選取的觀察指標為不同檢測方法下血清免疫逃逸變異HBsAg陽性率及P/C數(shù)值，將P/C數(shù)值在1.20～1.80定義為亞臨界、1.90～2.50定義為臨界、2.60～5.00定義為超臨界，陽性率=(亞臨界+臨界+超臨界)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

本次研究當中的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，以t檢驗，計數(shù)資料采用率(%)表示，以卡方檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩種檢測方法血清免疫逃逸變異HBsAg

陽性率比較

G6-ELISA檢測血清免疫逃逸變異HBsAg陽性率為92%, 而市售ELISA檢測陽性率為80%, 二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表1。

表1 兩種檢測方法血清免疫逃逸變異HBsAg陽性率比較[n(%)]

與G6-ELISA比較, *P<0.05。

2.2 兩種檢測方法P/C數(shù)值比較

兩種檢測方法所得P/C數(shù)值相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 兩種檢測方法P/C數(shù)值比較

與G6-ELISA比較, *P<0.05。

3 討 論

乙型肝炎病毒是當前世界范圍內的一個重大的公共衛(wèi)生問題，盡管乙肝疫苗得到了普遍推廣使用，乙肝患者發(fā)病數(shù)量及概率被有效控制，但是由于近些年來誘發(fā)乙型肝炎病毒的因素日益增多，使得乙肝病毒重新引起了社會各界的廣泛關注。特別是因不良生活習慣、飲食結構所致的腎臟疾病患者數(shù)量顯著上升，此類患者往往免疫能力較為低下，感染乙型肝炎病毒的概率大幅提升[7]。該病癥如果沒有得到及時處置，將會誘發(fā)肝細胞癌、失代償性肝硬化等一系列并發(fā)癥，危及患者生命安全[8]。此外，臨床檢驗工作中乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測異質化(灰區(qū))的報道逐漸增多，使得臨床診療工作開展受到不同程度影響，引起了醫(yī)學界的高度關注。

既往研究[9-12]證實，乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)的形成因素主要與標本或者是檢測試劑污染、自身免疫物質缺乏、食物抗體、血清中某些因子過量存在具有直接關聯(lián)性，隨后的研究中臨床檢驗規(guī)范化程度也被列入其中。但是，關于血清免疫逃逸變異HBsAg與乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)之間影響關系的研究卻尚未系統(tǒng)開展，理論研究方面仍然存在著較大不足之處。因而，本次研究圍繞該課題所展開的深入分析和研究，能夠填補或豐富該領域存在的空白，使得人們對于二者關系能夠具有一個更加清晰的認知。同時則能夠為乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)檢驗工作提供幫助，無論是從理論研究還是實踐應用均具有重要研究價值與現(xiàn)實意義。

本次研究通過采取G6-ELISA法對乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)患者血清免疫逃逸變異HBsAg進行檢測，亞臨界檢出18例、臨界35例、超臨界39例，陽性檢測率92%, 而市售ELISA亞臨界15例、臨界32例、超臨界33例，陽性檢測率80%, 二者陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。P/C數(shù)值方面, G6-ELISA法所得結果更加符合實際，與市售ELISA檢測結果比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此可知，乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)的患者在排除檢測試劑影響因素或自身影響因素外，可以被確定為乙型肝炎病毒感染者，而G6-ELISA法對血清免疫逃逸變異HBsAg具有較高的敏感性。導致此種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因在于目前市面上所銷售的酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑采取的單克隆抗體絕大多數(shù)是針對HBsAg“a”決定簇，或者是與其空間結果具有關聯(lián)性的抗原定位點，但是如果乙型肝炎病毒基因發(fā)生了變異，使得抗原性漂移在一定程度上影響了表達抗原與檢測試劑中抗體的結合能力，繼而影響最終檢測結果[13-15]。此外，同一抗體對于血清免疫逃逸變異HBsAg雖然能夠發(fā)生免疫反應，但是此種免疫反應的親和力相對較低，同樣是導致乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)出現(xiàn)。

綜上所述，血清免疫逃逸變異HBsAg是導致乙肝HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測信號灰區(qū)的重要原因，提高血清免疫逃逸變異HBsAg檢測能力有助于臨床診斷乙型肝炎病毒工作開展。

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2017-01-05

廣東省衛(wèi)生廳資助項目(20150134)

R 512.6

A

1672-2353(2017)07-179-02

10.7619/jcmp.201707061