高長玉,李冀,李博文,姜志梅

(1.黑龍江省小兒腦性癱瘓防治療育中心博士后科研工作站,黑龍江 佳木斯 154003;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

六味地黃丸改善腦癱模型大鼠運(yùn)動功能的實(shí)驗(yàn)研究

高長玉1,2,李冀2,李博文2,姜志梅1*

(1.黑龍江省小兒腦性癱瘓防治療育中心博士后科研工作站,黑龍江 佳木斯 154003;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究六味地黃丸對腦癱模型大鼠運(yùn)動功能的影響，探討其作用機(jī)理。方法：采用孕鼠腹腔注射脂多糖(LPS)合并缺氧方法制作腦癱動物模型，通過懸吊試驗(yàn)、斜坡試驗(yàn)與模型大鼠腦組織乙酰膽堿酯酶(ACHE)含量的檢測，觀察六味地黃丸對其的影響。結(jié)果：六味地黃丸能夠明顯延長模型大鼠懸吊時(shí)間，縮短斜坡試驗(yàn)耗時(shí)，提高模型大鼠腦組織AchE的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：六味地黃丸能夠增強(qiáng)腦癱模型大鼠運(yùn)動能力，其機(jī)理可能與改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能有關(guān)。

腦癱模型大鼠;六味地黃丸;運(yùn)動功能;乙酰膽堿酯酶

小兒腦癱(cerebral palsy,CP)是自受孕開始至嬰兒期非進(jìn)行性腦損傷和發(fā)育缺陷所導(dǎo)致的綜合征，主要表現(xiàn)為運(yùn)動障礙及姿勢異常。國內(nèi)外治療腦癱多以康復(fù)訓(xùn)練為主，配合中醫(yī)針灸、按摩、熏洗、高壓氧、藥物、手術(shù)治療等。本研究通過觀察六味地黃丸對腦癱模型幼鼠運(yùn)動能力及腦組織中乙酰膽堿酯酶含量的影響，為中藥治療小兒腦癱提供可參考的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級成熟Wistar雄性大鼠12只，雌性大鼠24只，體質(zhì)量200～220 g，均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號：SCXK(黑)2013-001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

六味地黃丸濃縮丸(北京同仁有限責(zé)任公司，批號：15012157)；脂多糖(LPS)(血清型055∶B5，美國SIGMA公司)，大鼠乙酰膽堿酯酶(AchE)酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所)，8%氧氣92%氮?dú)饣旌蠚怏w(哈爾濱盛大氣體公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SpectraMax M2核酸酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，BX51熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，MIKRO22臺式離心機(jī)(德國赫提馳公司)，自制缺氧箱。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

將大鼠按雌雄比例2∶1合籠，于次日早晨7時(shí)對雌鼠進(jìn)行陰栓檢查并做陰道涂片，發(fā)現(xiàn)陰栓或查得精子，則記為妊娠0 d，孕鼠單獨(dú)飼養(yǎng)。隨機(jī)選取孕鼠15只分為造模組10只和對照組5只。在妊娠第16 d給造模組孕鼠腹腔注射LPS(450 μg/kg)，12 h后將孕鼠置于缺氧環(huán)境(8%O2和92%N2混合氣體)2 h，6 h后再重復(fù)做1次。對照組孕鼠腹腔注射等劑量生理鹽水[1-2]。

1.2.2 動物模型的篩選

將9日齡幼鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測試，參照藍(lán)靖文[3]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到腦癱模型大鼠。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組

將所得模型大鼠隨機(jī)選取30只，分為三組：中藥治療組、康復(fù)訓(xùn)練組、模型對照組，每組10只。另取10只正常等齡大鼠做為空白對照組。

1.2.4 治療方法

給藥方法：中藥治療組模型幼鼠按體質(zhì)量灌服六味地黃丸混懸液，給藥劑量根據(jù)臨床用量，按照人與大鼠體表面積折算。模型對照組和空白對照組灌服等量生理鹽水。各組連續(xù)灌服20 d。

康復(fù)訓(xùn)練方法：通過籠內(nèi)釋放有刺激性氣味如白醋，風(fēng)油精；放置各種顏色形狀的物體，各種可以活動的“玩具”如跑輪、滑梯、管道、臺階、小球等進(jìn)行豐富環(huán)境刺激與運(yùn)動訓(xùn)練[4]。每日將幼鼠放入該籠中2次，每次30 min。同時(shí)多次抓取撫摸刺激幼鼠，連續(xù)刺激訓(xùn)練20 d。

1.3 觀測指標(biāo)

1.3.1 懸吊試驗(yàn)

距離桌面45 cm水平放置一根直徑為0.5 cm的玻璃棒，使30日齡大鼠前爪抓住金屬棒，后肢懸空，撤去助力時(shí)以秒為單位開始計(jì)大鼠懸吊在金屬棒上的時(shí)間并記錄。

1.3.2 斜坡試驗(yàn)

將大鼠頭向下倒置于45°斜面上，記錄大鼠扭轉(zhuǎn)身體使頭部向上，轉(zhuǎn)至與原始頭部方向夾角>135°的時(shí)間，以秒為單位。

1.3.3 AchE含量測定

按照AchE測定試劑盒說明書檢測AchE含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 懸吊試驗(yàn)

各組大鼠懸吊試驗(yàn)測試結(jié)果統(tǒng)計(jì)比較,見表1。

表1 懸吊試驗(yàn)測試結(jié)果±s)

注：與空白對照組比較,*P<0.01;與模型對照組比較,▲P<0.01;與康復(fù)訓(xùn)練組比較,●P<0.05

由表1可見，與空白對照組比較，模型對照組懸吊時(shí)間明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對照組比較，康復(fù)訓(xùn)練組與中藥治療組的懸吊時(shí)間明顯延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與康復(fù)訓(xùn)練組比較，中藥治療組的懸吊時(shí)間明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 斜坡試驗(yàn)

各組大鼠斜坡試驗(yàn)測試結(jié)果統(tǒng)計(jì)比較,見表2。

表2 斜坡試驗(yàn)測試結(jié)果±s)

注：與空白對照組比較,*P<0.01;與模型對照組比較,▲P<0.05;與康復(fù)訓(xùn)練組比較,●P<0.05

由表2可見，與空白對照組比較，模型對照組斜坡試驗(yàn)耗時(shí)顯著延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對照組比較，康復(fù)訓(xùn)練組與中藥治療組耗時(shí)明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與康復(fù)訓(xùn)練組比較，中藥治療組耗時(shí)明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 對AchE含量的影響

各組AchE的含量統(tǒng)計(jì)結(jié)果,見表3。

表3 大鼠腦組織AchE測試結(jié)果

注：與空白對照組比較,*P<0.05;與模型對照組比較,▲P<0.05;與康復(fù)訓(xùn)練組比較,●P<0.05

由表3可見，與空白對照組比較，模型對照組AchE的含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對照組比較，康復(fù)訓(xùn)練組與中藥治療組AchE的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與康復(fù)訓(xùn)練組比較，中藥治療組AchE的含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

中醫(yī)學(xué)雖無腦癱之病名，但古代醫(yī)家對此早有深刻認(rèn)識，將其歸為“五遲”“五軟”“五硬”等范疇，認(rèn)為本病多由于先天稟賦不足、精髓不允，腎氣虧虛所致，治療當(dāng)補(bǔ)腎填精益髓以強(qiáng)壯筋骨為核心法則[5-6]。本實(shí)驗(yàn)通過孕鼠腹腔注射LPS合并缺氧方法制作腦癱動物模型，模型組大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、自主活動減少、運(yùn)動速度緩慢、運(yùn)動穩(wěn)定性降低，懸吊試驗(yàn)、斜坡試驗(yàn)結(jié)果異常的現(xiàn)象，說明模型組大鼠肢體肌力與軀體平衡能力較差，存在隨意運(yùn)動障礙。灌服六味地黃丸后，大鼠懸吊時(shí)間明顯延長，斜坡試驗(yàn)耗時(shí)明顯縮短，表明六味地黃丸可明顯提高腦癱模型大鼠的肢體肌肉力量和調(diào)節(jié)機(jī)體平衡的能力，以改善其運(yùn)動功能。

AchE是一種在動物體內(nèi)廣泛存在的水解酶，能夠快速催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)，使神經(jīng)沖動傳遞停止，維持突觸后膜的去極性，從而使整個(gè)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能得到保證。AchE含量的降低短期內(nèi)會導(dǎo)致Ach在突觸中的積累，使神經(jīng)元異常興奮，機(jī)體可能表現(xiàn)出震顫，痙攣等癥狀。另有報(bào)道AchE還參與細(xì)胞的發(fā)育和成熟，促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育，修復(fù)受損的神經(jīng)細(xì)胞，具有一定的神經(jīng)營養(yǎng)因子樣作用[7-9]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，六味地黃丸能明顯提高模型大鼠腦組織AchE的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此推測，六味地黃丸增強(qiáng)腦癱模型大鼠運(yùn)動能力可能與改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能有關(guān)。

[1] 李曉捷，高晶，孫忠人．宮內(nèi)感染致早產(chǎn)鼠腦癱動物模型制備及其鑒定的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2004，19(12):885-889．

[2] 高峰，楊小鵬，陳剛，等.應(yīng)用孕鼠腹腔注射脂多糖合并缺氧方法制作腦癱動物模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011，10(7):489-491.

[3] 藍(lán)靖文.兒童腦性癱瘓臨床中醫(yī)證候?qū)W調(diào)查及相關(guān)中藥干預(yù)研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2009.

[4] 郭嵐敏，李曉捷，張士嶺，等.早期干預(yù)對宮內(nèi)感染致腦癱大鼠運(yùn)動功能影響的研究[J].中國傷殘醫(yī)學(xué),2013,21(3)：41-44.

[5] 李靜,樊祥偉,高晶,等.電針刺激頭部運(yùn)動區(qū)對腦癱鼠大腦磁共振彌散張量纖維束成像的影響[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(6):63-65.

[6] 胡紅梅,安愛景,杜洪榮.穴位注射甲鈷胺結(jié)合引導(dǎo)式教育降低痙攣型腦癱患兒肌張力的臨床研究[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(5):76-78.

[7] Padilla S, Lassiter T L, Hunter D. Biochemical Measurement of Cholinesterase Activity[J]. Methods in Molecular Medicine,1999,22(22):237-45.

[8] Rotiroti L, Stefano L D, Rendina I, et al. Optical microsensors for pesticides identification based on porous silicon technology[J].Biosensors & Bioelectronics,2005,20(10):2136-2139.

[9] 張皚峰,歐喜超,楊朝陽,等.大鼠脊髓損傷后運(yùn)動終板內(nèi)乙酰膽堿酯酶和降鈣素基因相關(guān)肽的變化[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2008,14(11):1030-1032.

2016-12-12

2017-03-30

黑龍江省博士后資助項(xiàng)目(LBH-Z13190);黑龍江省2015年研究生創(chuàng)新科研基金項(xiàng)目

高長玉(1971-)，男，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事方劑學(xué)的教學(xué)與研究工作?，F(xiàn)為黑龍江省小兒腦性癱瘓防治療育中心博士后科研工作站在站博士后。

*通訊作者：姜志梅(1966-),女，教授,主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師,主要從事兒童康復(fù)臨床、教學(xué)與研究。

R285.5;R289.54

A

1002-2392(2017)02-0080-02