劉 皓， 姜建萍， 張娟娟， 潘智芳， 李孟杰， 梁 錚 ， 趙翔宇， 孫 巖， 劉曉影△

(1濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 山東 濰坊 261053； 2濰坊市中醫(yī)院腦病康復(fù)科，山東 濰坊 261041； 3濰坊醫(yī)學(xué)院口腔教研室，山東 濰坊 261053)

·短篇論著·

FGF8輔助牙源性上皮誘導(dǎo)hDPSCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓細(xì)胞*

劉 皓1， 姜建萍2， 張娟娟3， 潘智芳1， 李孟杰1， 梁 錚1， 趙翔宇1， 孫 巖3， 劉曉影1△

(1濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 山東 濰坊 261053；2濰坊市中醫(yī)院腦病康復(fù)科，山東 濰坊 261041；3濰坊醫(yī)學(xué)院口腔教研室，山東 濰坊 261053)

目的： 研究成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF8)對(duì)成人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)定向分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓組織的影響。方法: 首先分離、克隆培養(yǎng)hDPSCs，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定hDPSCs；礦化液中添加50 μg/L的FGF8誘導(dǎo)hDPSCs分化，通過(guò)real-time PCR檢測(cè)分化后的細(xì)胞中牙本質(zhì)涎磷蛋白(DSPP)、堿性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)和核心結(jié)合因子α1(Cbfa-1)在mRNA水平的表達(dá)；E11.5小鼠牙源性上皮聯(lián)合FGF8與hDPSCs細(xì)胞團(tuán)重組，再將組織塊種植于裸鼠腎囊膜下培養(yǎng)，通過(guò)DNA原位雜交鑒定成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓細(xì)胞的來(lái)源。結(jié)果: 成功分離培養(yǎng)hDPSCs，其表面標(biāo)志物CD29和CD90呈陽(yáng)性表達(dá)；經(jīng)FGF8誘導(dǎo)的hDPSCs形成較明顯的礦化結(jié)節(jié)，并且牙本質(zhì)特異性蛋白DSPP、BSP及Cbfa-1表達(dá)量上調(diào)；E11.5小鼠牙源性上皮聯(lián)合FGF8可以誘導(dǎo)hDPSCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓細(xì)胞。結(jié)論: FGF8能夠輔助牙源性上皮定向誘導(dǎo)hDPSCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓細(xì)胞，并形成牙本質(zhì)及牙髓腔結(jié)構(gòu)。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8; 成人牙髓干細(xì)胞; 成牙本質(zhì)細(xì)胞

成人牙髓干細(xì)胞(human postnatal dental pulp stem cells，hDPSCs)是從人恒牙牙髓中分離出來(lái)的具有克隆形成能力及快速分裂特征的成纖維樣干細(xì)胞[1]。牙髓干細(xì)胞能夠定向分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞[2-3]， Tamaoki 等[4]把hDPSCs 成功地誘導(dǎo)為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)參與胚胎生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移、組織損傷修復(fù)等過(guò)程[5-6]，其家族成員FGF8在口腔上皮不表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致磨牙缺失。目前關(guān)于FGF8對(duì)hDPSCs分化的影響尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究在體外培養(yǎng)hDPSCs并進(jìn)行定向誘導(dǎo)，在體內(nèi)建立組織培養(yǎng)模型，初步研究FGF8對(duì)hDPSCs分化及形成牙齒結(jié)構(gòu)的影響。

材 料 和 方 法

1 主要材料

裸鼠購(gòu)自上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；成人第3磨牙由濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院提供；α-MEM、胎牛血清、FGF8、 I型膠原酶、中性蛋白酶和鼠尾膠原蛋白(Gibco)；維生素C、β-磷酸甘油鈉、地塞米松和茜素紅(Sigma)；Alu及Pf1探針由上海生物工程有限公司合成；瓊脂糖微球(Bio-Rad)；SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒(TaKaRa)；CD29-FITC、CD90-FITC、CD34-FITC和CD45-PE(BioLegend)。

2 主要方法

2.1 分離培養(yǎng)hDPSCs 從濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)院獲得成人(20～30歲)智齒(第3磨牙)，在無(wú)菌條件下，敲碎牙冠暴露牙髓，用手術(shù)刀將牙髓切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，用含有雙抗的PBS沖洗2～3遍；再用消化液(3 g/L I型膠原酶和4 g/L 中性蛋白酶)在37 ℃消化40 min；終止消化后吹打至單細(xì)胞懸液，接種于0.1 g/L鼠尾膠原蛋白預(yù)包被的培養(yǎng)皿中；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，呈現(xiàn)克隆狀，選取干細(xì)胞形態(tài)的克隆，利用套環(huán)法挑取單克隆，置于鼠尾膠原包被的48孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hDPSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物 0.25%胰蛋白酶消化第3代(P3) hDPSCs，1×PBS洗滌細(xì)胞3次，并吹打成細(xì)胞懸液?？笴D29、CD90和CD34的抗體為FITC標(biāo)記，抗CD45抗體使用PE標(biāo)記，將抗體分別加入細(xì)胞懸液，最終抗體被稀釋為1∶100，室溫避光孵育30 min后，再用PBS洗滌3遍。依照Beckman Coulter流式細(xì)胞儀的操作手冊(cè)，檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD34及CD45的表達(dá)。

2.3 礦化液誘導(dǎo)hDPSCs分化并檢測(cè)其礦化程度 將P3 的hDPSCs以1×107/L的密度接種于膠原蛋白預(yù)包被的3.5 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 d后將培養(yǎng)液更換為可以誘導(dǎo)分化的礦化液(α-MEM，10% 胎牛血清，50 mg/L維生素C，10 mmol/L β-磷酸甘油鈉，10 nmol/L地塞米松)，礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，終止培養(yǎng)，用冰冷的70%乙醇固定1 h，再用1 mL 40 mmol/L茜素紅(pH 4.1)染色10 min，進(jìn)行鏡檢礦化結(jié)節(jié)。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein， BSP)和核心結(jié)合因子α1(core-binding factor alpha 1,Cbfa-1)的mRNA表達(dá) 設(shè)計(jì)成牙本質(zhì)細(xì)胞中礦化相關(guān)標(biāo)志物 DSPP、ALP、BSP及Cbfa-1和內(nèi)參照GAPDH的引物，以未經(jīng)礦化液誘導(dǎo)分化、礦化液誘導(dǎo)分化14 d及含50 μg/L FGF8的礦化液誘導(dǎo)分化14 d的hDPSCs cDNA為模板，根據(jù)SYBR PrimeScript RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用real-time PCR來(lái)鑒定hDPSCs分化程度，引物序列見(jiàn)表1。用2-ΔΔCt方法分析各基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

2.5 FGF8誘導(dǎo)重組嵌合體的制備及其體內(nèi)種植培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，將瓊脂糖微球浸泡于100 μg/L的FGF8溶液中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，使其完全膨脹，以吸附牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的瓊脂糖微球?yàn)閷?duì)照。將浸泡過(guò)的瓊脂糖微球(4～6粒)均勻置于P4的hDPSCs細(xì)胞團(tuán)塊邊緣，將在體視顯微鏡下分離獲得昆明小鼠胚胎11.5 d(E11.5)的牙上皮覆蓋其上。將重組嵌合體在器官培養(yǎng)皿內(nèi)，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。再將重組嵌合體種植于裸鼠腎囊膜下進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)6周。

2.6 DNA原位雜交 Alu和Pf1分別是人及小鼠基因組中特有的高度重復(fù)序列，均具有種屬特異性，因此地高辛標(biāo)記的Alu和Pf1探針能夠特異性地分別檢測(cè)出人源及鼠源組織。Alu及Pf1探針由上海生物工程有限公司合成：用含有地高辛標(biāo)記的dUTP，以PCR方法擴(kuò)增特異性的Alu及Pf1探針(引物見(jiàn)表1)，石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，蛋白酶K(1 mg/L)37 ℃消化10 min，浸入0.2%甘氨酸5 min，4%多聚甲醛室溫下固定10 min，乙酸酐/三乙醇胺孵育10 min，每片加100 μL雜交液(含1 mg/L探針)，95 ℃水浴鍋中變性10 min，Alu探針在37 ℃，Pf1探針在30 ℃下分別雜交過(guò)夜(16 h)。滴加封閉液，室溫放置20～30 min。加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體稀釋液，室溫放置2 h。加NBT/BCIP顯色液，4 ℃避光顯色過(guò)夜。充分水洗，伊紅復(fù)染1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)形式表達(dá)，數(shù)據(jù)分析采用兩因素重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析方法。各實(shí)驗(yàn)組與其對(duì)應(yīng)的對(duì)照組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)方法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 hDPSCs的分離培養(yǎng)及初步鑒定

套環(huán)法挑取單克隆培養(yǎng)2 d后在顯微鏡下可以觀察到長(zhǎng)梭型的細(xì)胞分散生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)6 d后可見(jiàn)生長(zhǎng)為致密的長(zhǎng)纖維狀。取克隆培養(yǎng)后的P3細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示，作為骨髓及牙髓干細(xì)胞表面標(biāo)志物的CD29及CD90呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為96.3%和94.5%；而造血干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物CD34及粒系細(xì)胞的共同表面標(biāo)志物CD45陽(yáng)性率較低，見(jiàn)圖1。該檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明已經(jīng)成功分離培養(yǎng)hDPSCs。

2 FGF8促進(jìn)礦化液誘導(dǎo)hDPSCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞

Figure 1.Isolation, culture and identification of hDPSCs. A: clonal culture of hDPSCs for 2 d and 8 d; B: the surface markers of hDPSCs were detected.

圖1 hDPSCs的分離培養(yǎng)及初步鑒定

用礦化液及含50 μg/L FGF8的礦化液培養(yǎng)hDPSCs，誘導(dǎo)分化14 d后細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)均有礦化結(jié)節(jié)出現(xiàn)，用茜素紅染色均顯示為陽(yáng)性(圖2A中黑色箭頭所示)，而FGF8組單個(gè)礦化節(jié)結(jié)面積較大，在一定程度上也反映了細(xì)胞礦化能力的增強(qiáng)，說(shuō)明FGF8可增強(qiáng)hDPSCs的分化能力。

以未經(jīng)礦化液誘導(dǎo)分化、礦化液誘導(dǎo)分化14 d及含50 μg/L FGF8的礦化液誘導(dǎo)分化14 d的hDPSCs cDNA為模板，利用real-time PCR來(lái)鑒定hDPSCs分化程度。結(jié)果顯示未經(jīng)誘導(dǎo)的hDPSCs幾乎不表達(dá)牙本質(zhì)特異性蛋白DSPP及BSP，經(jīng)礦化液誘導(dǎo)以后DSPP、BSP、ALP及Cbfa-1的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，尤其是FGF8組中Cbfa-1的表達(dá)量明顯上調(diào)，見(jiàn)圖2B。該結(jié)果說(shuō)明FGF8能夠促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化。

3 FGF8輔助E11.5小鼠牙源性上皮定向誘導(dǎo)hDPSCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓結(jié)構(gòu)

FGF8聯(lián)合E11.5小鼠牙源性上皮與P4的hDPSCs進(jìn)行重組，種植于裸鼠腎囊膜下培養(yǎng)6周后，取出組織塊，切片后分別進(jìn)行Alu和Pf1的DNA原位雜交，對(duì)照組以BSA代替FGF8。結(jié)果FGF8組10例中有4例形成牙本質(zhì)及牙髓結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組10例中均未形成牙齒結(jié)構(gòu)。FGF8組具有牙齒結(jié)構(gòu)發(fā)育的組織塊大而圓潤(rùn)，而對(duì)照組未能形成牙齒結(jié)構(gòu)的組織塊呈扁平骨基質(zhì)狀。將組織塊切片后，經(jīng)Alu和Pf1的DNA原位雜交結(jié)果顯示，F(xiàn)GF8組能夠形成的牙齒結(jié)構(gòu)，成釉細(xì)胞核被Pf1探針識(shí)別染色為紫色，說(shuō)明成釉細(xì)胞來(lái)源于鼠組織；成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓細(xì)胞核被Alu探針識(shí)別，說(shuō)明這些細(xì)胞由人源組織(hDPSCs)發(fā)育而來(lái)。而對(duì)照組無(wú)牙齒結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，僅發(fā)現(xiàn)角化上皮及松骨質(zhì)，見(jiàn)圖3。此結(jié)果提示FGF8可以輔助E11.5小鼠牙源性上皮定向誘導(dǎo)hDPSCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓結(jié)構(gòu)。

Figure 2.The effect of FGF8 on the differentiation of hDPSCs. The hDPSCs were cultured with the mineralization fluid (MF) and the MF containing 50 μg/L FGF8 for 14 d. A: alizarin red staining (×200)； B: the mRNA expression levels of cell mineralization-related genes, DSPP, ALP, BSP and Cbfa-1, were detected by real-time PCR. Mean±SD.n=9.*P<0.05vshDPSCs+MF.

圖2 FGF8對(duì)hDPSCs分化能力的影響

討 論

hDPSCs是從人恒牙牙髓中分離出來(lái)的具有克隆形成能力及快速分裂特征的成纖維樣干細(xì)胞，此種細(xì)胞擁有比骨髓干細(xì)胞更強(qiáng)的克隆形成能力和分裂潛能，其在牙髓中的含量明顯高于骨髓中骨髓干細(xì)胞的含量[1]。大量研究已表明[2-3]，牙髓干細(xì)胞能夠定向分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，并且可以分泌DSPP、BSP等牙本質(zhì)形成相關(guān)蛋白，但牙髓干細(xì)胞是否能參與形成牙齒結(jié)構(gòu)目前尚無(wú)報(bào)道，所以這是一項(xiàng)值得研究的課題。

FGF8作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員，不僅參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)、器官形成以及損傷修復(fù)等一系列重要的過(guò)程，還是牙齒發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)重要因子[5-6]。在牙齒發(fā)生啟動(dòng)之前，未來(lái)牙上皮就已經(jīng)開(kāi)始有強(qiáng)烈的FGF8表達(dá)并持續(xù)到蕾狀早期，F(xiàn)GF8可以誘導(dǎo)未來(lái)磨牙間充質(zhì)中Barx1的表達(dá)[7-9]。然而，F(xiàn)GF8是否為指導(dǎo)性誘導(dǎo)成牙潛能的成份尚不明確，因?yàn)楫?dāng)口腔上皮不表達(dá)FGF8時(shí)，切牙可以形成，但會(huì)缺失包括磨牙在內(nèi)的其它第一腮弓衍生物[10]。

Figure 3.The effects of FGF8 on dental epithelium-induced directional differentiation of hDPSCs into odontoblasts and pulp tissue. A, D: the tissue of tooth structure in FGF8 group (D) and no teeth structure block in control group (A) under the renal capsule of nude mice were observed; B～C: DNAinsituhybridization in control group for Pf1 (B) and Alu (C); E～F: DNAinsituhybridization in FGF8 group for Pf1 (E) and Alu (F). ep: epithelial cells; b: loose bone; eb: the enamel cells; od: the dentin cells; d: dentin; dp: pulp tissue.

圖3 FGF8輔助小鼠牙源性上皮定向誘導(dǎo)hDPSCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓結(jié)構(gòu)

本研究主要觀察FGF8對(duì)hDPSCs分化的影響，是否有助于定向誘導(dǎo)hDPSCs分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓結(jié)構(gòu)。其研究結(jié)果對(duì)未來(lái)牙齒硬組織再生和牙齒損傷修復(fù)的研究都具有重要的意義。在本研究中，礦化液中添加50 μg/L的FGF8能夠促進(jìn)hDPSCs礦化結(jié)節(jié)的形成，并且經(jīng)定向誘導(dǎo)后細(xì)胞中DSPP、BSP及Cbfa-1表達(dá)量均明顯高于未添加FGF8組，DSPP作為牙本質(zhì)特異性蛋白，也是分化成熟的牙本質(zhì)細(xì)胞特異性的標(biāo)記物；BSP為礦化組織細(xì)胞基質(zhì)中的重要成分；Cbfa-1作為骨和牙齒發(fā)育過(guò)程中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在牙齒發(fā)育的早期階段高表達(dá)，參與牙冠的形成和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化。DSPP、BSP及Cbfa-1表達(dá)量的升高也反映了hDPSCs的分化程度，提示FGF8能夠促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化。

為了進(jìn)一步證實(shí)FGF8對(duì)hDPSCs分化的影響，本研究又實(shí)施了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，E11.5小鼠牙源性上皮聯(lián)合FGF8與hDPSCs細(xì)胞團(tuán)重組，再將組織塊種植于裸鼠腎囊膜下繼續(xù)發(fā)育，模擬體內(nèi)發(fā)育環(huán)境。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FGF8組10例中有4例形成牙本質(zhì)及牙髓結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組10例中均未形成牙齒結(jié)構(gòu)。并通過(guò)DNA原位雜交技術(shù)確定牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓細(xì)胞來(lái)源于hDPSCs。該結(jié)果說(shuō)明FGF8作為影響hDPSCs分化的因素之一，可以輔助E11.5小鼠牙源性上皮定向誘導(dǎo)hDPSCs分化成牙本質(zhì)細(xì)胞及牙髓結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果與已有的文獻(xiàn)報(bào)道相一致，堿性成纖維生長(zhǎng)因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)不僅僅誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化[11]，還可以誘導(dǎo)hDPSCs分化。Qian等[12]使用bFGF預(yù)處理hDPSCs 1周后再進(jìn)行定向分化誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化能力上調(diào)；而Kikuchi等[13]用含有bFGF 的明膠凝膠控釋系統(tǒng)，對(duì)有牙本質(zhì)缺損暴露的牙髓組織恒速釋放bFGF，發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)樣顆粒的形成；He等[14]也證實(shí)了bFGF可顯著增加牙髓干細(xì)胞向成骨/成牙本質(zhì)方向分化。本研究發(fā)現(xiàn)同樣作為成纖維生長(zhǎng)因子家族成員之一的FGF8，不但能夠誘導(dǎo)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，還可以分化為牙髓樣細(xì)胞，形成完整的牙齒結(jié)構(gòu)——牙本質(zhì)及牙髓。

[1] Gronthos S, Mankani M, Brahim J, et al. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs)invitroandinvivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(25):13625-13630.

[2] Gronthos S, Brahim J, Li W, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells[J]. J Dent Res, 2002, 81(8):531-535.

[3] Liu MY, Sun Y, Liu Y, et al. Modulation of the differentiation of dental pulp stem cells by different concentrations of β-glycerophosphate[J]. Molecules, 2012, 17(2): 1219-1232.

[4] Tamaoki N, Takahashi K, Tanaka T, et al. Dental pulp cells for induced pluripotent stem cell banking[J]. J Dent Res, 2010, 89(8):773-778.

[5] St Amand TR, Zhang Y, Semina EV, et al. Antagonistic signals between BMP4 and FGF8 define the expression of Pitx1 and Pitx2 in mouse tooth forming anlage[J]. Dev Biol, 2000, 217(2):323-332.

[6] Porntaveetus T, Otsuka-Tanaka Y, Basson MA, et al. Expression of fibroblast growth factors (Fgfs) in murine tooth development[J]. J Anat, 2011, 218(5):534-543.

[7] Li CY, Prochazka J, Goodwin AF, et al. Fibroblast growth factor signaling in mammalian tooth development[J]. Odontology, 2014, 102(1):1-13.

[8] Li L, Yuan G, Liu C, et al. Exogenous fibroblast growth factor 8 rescues development of mouse diastemal vestigial toothexvivo[J]. Dev Dyn, 2011, 240(6):1344-1353.

[9] Liu C, Gu S, Sun C, et al. FGF signaling sustains the odontogenic fate of dental mesenchyme by suppressing β-catenin signaling[J]. Development, 2013, 140(21):4375-4385.

[10]Trumpp A, Depew MJ, Rubenstein JL, et al. Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch [J]. Genes Dev, 1999, 13(23):3136-3148.

[11]周志剛, 李志忠, 林永新, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成類神經(jīng)元的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2015, 31(2) :229-233.

[12]Qian J, Jiayuan W, Wenkai J, et al. Basic fibroblastic growth factor affects the osteogenic differentiation of dental pulp stem cells in a treatment-dependent manner [J]. Int Endod J, 2015, 48(7):690-700.

[13]Kikuchi N, Kitamura C, Morotomi T, et al. Formation of dentin-like particles in dentin defects above exposed pulp by controlled release of fibroblast growth factor 2 from gelatin hydrogels [J]. J Endod, 2007, 33(10):1198-1202.

[14]He H, Yu J, Liu Y, et al. Effects of FGF2 and TGFβ1on the differentiation of human dental pulp stem cellsinvitro[J]. Cell Biol Int, 2008, 32(7):827-834.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Role of fibroblast growth factor 8 in process of dental epithelium-induced directional differentiation of human postnatal dental pulp stem cells into odontoblasts and pulp cells

LIU Hao1, JIANG Jian-ping2, ZHANG Juan-juan3, PAN Zhi-fang1, LI Meng-jie1, LIANG Zheng1, ZHAO Xiang-yu1, SUN Yan3, LIU Xiao-ying1

(1InstituteofBiologicalScienceandTechnology，WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China;2DepartmentofEncephalopathyRehabilitation,WeifangHospitalofTraditionalChineseMedicine,Weifang261041,China;3DepartmentofStomatology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China.E-mail:xiaoying6690@163.com)

AIM: To study the effects of fibroblast growth factor 8 (FGF8) on directional differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs) into odontoblasts and pulp tissue. METHODS: hDPSCs were isolated and cultured, and identified with flow cytometry by detecting cell surface markers of hDPSCs. FGF8 at concentration of 50 μg/L was added into the mineralization fluid to induce the differentiation of the hDPSCs. The mRNA expression of dentin sialophosphoprotein (DSPP), alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP) and core-binding factor alpha 1 (Cbfa-1) in differentiated cells was detected by real-time PCR. FGF8 and mouse E11.5 dental epithelium formed restructuring cell group with hDPSCs, and then the restructuring cell group was transplanted under renal capsule membrane in nude mice for tissue culture. DNAinsituhybridization was used to identify the sources of odontoblasts and pulp cells. RESULTS: The surface markers of CD29 and CD90 showed positive in isolated hDPSCs. FGF8 induced hDPSCs to form a distinct mineralization nodule, and the expression of dentin-specific proteins, DSPP, BSP and Cbfa-1, was increased. hDPSCs were induced to differentiate into odontoblasts and pulp cells by E11.5 dental epithelium and FGF8. CONCLUSION: FGF8 can assist dental epithelium to induce directional differetiation of hDPSCs into odontoblasts and pulp cells, and formation of dentin and dental pulp cavity structure.

Fibroblast growth factor 8; Human postnatal dental pulp stem cells; Odontoblasts

1000- 4718(2017)04- 0730- 05

2016- 11- 11

2016- 12- 22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81441107)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. ZR2013HQ019)；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(No. J15LK09)；濰坊醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(No. KX2016002)

R363； R781

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.025

△通訊作者 Tel: 0536-8462053; E-mail： xiaoying6690@163.com