薛 鴻， 王 虹， 許能鑾， 陳愉生， 蘇 建， 解衛(wèi)平

(1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院福建省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科,福建省呼吸四病研究室， 福建 福州 350001； 2南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 南京 210029； 3江蘇省疾病預(yù)防控制中心慢性非傳染病防制所，江蘇 南京 210009)

自噬參與香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡*

薛 鴻1△， 王 虹2， 許能鑾1， 陳愉生1， 蘇 建3， 解衛(wèi)平2

(1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院福建省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科,福建省呼吸四病研究室， 福建 福州 350001；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 南京 210029；3江蘇省疾病預(yù)防控制中心慢性非傳染病防制所，江蘇 南京 210009)

目的： 探討自噬在香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract, CSE)誘導(dǎo)人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)凋亡中的作用。方法: 常規(guī)培養(yǎng)HPAECs，分為對照組、CSE組、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)組和3-MA+CSE組，應(yīng)用Hoechst 33342 染色和 Annexin V/PI 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色觀察細(xì)胞自噬泡形成，Western bolt 測定自噬相關(guān)蛋白 beclin-1、LC3 與cleaved caspase-3的水平。結(jié)果: MDC染色示CSE處理可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬泡，Western blot結(jié)果示自噬相關(guān)蛋白LC3及beclin-1表達(dá)升高，3-MA 預(yù)處理后抑制上述蛋白的表達(dá)。Hoechst 33342 染色和 Annexin V/PI 流式結(jié)果顯示CSE組細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加，在3-MA+CSE組，細(xì)胞凋亡率較CSE組進(jìn)一步升高；同時(shí)，CSE組細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白水平較對照組明顯升高(P<0.05)，3-MA+CSE組的caspase-3表達(dá)較CSE組進(jìn)一步升高。結(jié)論: CSE能誘導(dǎo)HPAECs發(fā)生自噬和凋亡，抑制自噬能夠進(jìn)一步促進(jìn)CSE對HPAECs的凋亡作用，這種作用可通過激活caspase-3實(shí)現(xiàn)。

自噬； 人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞； 香煙煙霧提取物； 細(xì)胞凋亡

吸煙可導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，進(jìn)而誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓和肺源性心臟病[1-2]。肺血管重構(gòu)是導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓形成并誘發(fā)肺源性心臟病的病理基礎(chǔ)。近年來研究發(fā)現(xiàn)吸煙可導(dǎo)致肺血管重構(gòu)。目前認(rèn)為香煙煙霧誘發(fā)人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)的凋亡是肺動(dòng)脈高壓和肺源性心臟病的促發(fā)因素和起始環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡可誘發(fā)血管平滑肌細(xì)胞的異常增生和凋亡抵抗型內(nèi)皮細(xì)胞的出現(xiàn)及廣泛增殖，從而引起肺小血管的狹窄和叢狀樣變，導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的形成[2-3]。

自噬作為真核細(xì)胞的一種基本生物學(xué)過程，是一種溶酶體依賴的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)再利用的過程，近年來在生物學(xué)和臨床領(lǐng)域引起了廣泛重視。越來越多的研究表明，自噬與疾病密切相關(guān)。自噬在肺部疾病中具有雙重作用，既可做為一種保護(hù)作用，又可成為一種損傷機(jī)制[4-5]。目前的研究認(rèn)為細(xì)胞自噬和凋亡之間存在自噬協(xié)同凋亡促進(jìn)細(xì)胞死亡、自噬抑制凋亡保護(hù)細(xì)胞和自噬增強(qiáng)凋亡水平促進(jìn)細(xì)胞死亡3種關(guān)系，但自噬本身不能導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。自噬是否在香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract，CSE)促進(jìn)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，目前尚未見報(bào)道。本研究通過建立體外煙霧暴露環(huán)境模型刺激肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察HPAECs自噬及凋亡的發(fā)生，并應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)改變自噬活性觀察其對細(xì)胞凋亡的影響，探討香煙煙霧暴露對肺血管損傷的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑及藥物

3-MA、碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液和MTT均購自Sigma；抗beclin-1、cleaved caspase-3抗體購自 Cell Signaling Technology；抗LC-3抗體購自Novus Biologicals；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 II 抗 IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 原代人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞購自 ScienCell 研究實(shí)驗(yàn)室。HPAECs用含1%抗生素、1%內(nèi)皮生長因子和10%胎牛血清的ECM內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(HyClone)，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的第3～5代HPAECs進(jìn)行，以約1×108/L 的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞鋪板面積達(dá) 80%～90%后進(jìn)行處理。

2.2 CSE的制備，以及CSE時(shí)間和濃度梯度實(shí)驗(yàn) 按參考文獻(xiàn)[7]報(bào)道的方法并加以改良。1支香煙(Marlboro)燃燒5 min的煙霧在注射器驅(qū)動(dòng)吸引下溶于10 mL 37 ℃預(yù)熱的PBS 溶液中，調(diào)節(jié) pH至7.4 左右。經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾除菌后作為100% CSE 原液，配置好的原液于1 h內(nèi)用于實(shí)驗(yàn), 用無血清培養(yǎng)液稀釋成不同濃度，CSE濃度(%)= CSE原液體積/總體積×100%。分別配制成 1%、2.5%、5%、10%和20%的CSE用于實(shí)驗(yàn)。

HPAECs接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別給予無血清培養(yǎng)基和1%、2.5%、5%、10%、20%的 CSE 處理24 h，或 10% CSE 處理 0 h、1 h、2 h、6 h、12 h和24 h后，每孔加20 μL MTT(5 g/L)，置5% CO2、37 °C、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，室溫孵育10 min，用酶標(biāo)儀在 570 nm處測定吸光度。

2.3 藥物處理 將HPAECs分為4組：對照組(control組)：細(xì)胞在正常條件下培養(yǎng)12 h； CSE組：使用10% CSE處理細(xì)胞12 h； 3-MA組：細(xì)胞預(yù)先用3-MA(10 mmol/L)孵育0.5 h后在正常條件下培養(yǎng)； 3-MA+ CSE組：細(xì)胞預(yù)先0.5 h用3-MA(10 mmol/L)孵育后使用10% CSE處理細(xì)胞12 h。

2.4 Annexin V/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，用胰酶消化，1 000×g離心5 min (4 ℃)，棄上清，收集細(xì)胞，PBS重懸，細(xì)胞密度取 1×109/L，1 000×g離心5 min (4 ℃)，棄上清，加入 195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕微搖勻后，室溫避光孵育 15 min，然后再 1 000 r/min 離心 5 min (4 ℃)，棄上清，加入 190 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞及加入 10 μL PI，立即搖勻，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.5 活細(xì)胞單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色熒光顯微鏡定性觀察 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，用 PBS洗滌 2次后加入終濃度為 0.05 mol/L的MDC溶液。37 ℃避光作用 60 min后棄去染液，PBS洗 3次。于 倒置熒光顯微鏡(Olympus)350 nm發(fā)射濾片下觀察和攝片。

2.6 Western bolt檢測蛋白水平 細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，用PBS洗滌3次，用含97.9% RIPA、1% PMSF、1%磷酸酶抑制劑和0.1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，制備SDS-PAGE，進(jìn)行50/100 V 恒壓電泳，經(jīng) 300 mA 恒流轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，TBST 洗滌后加 5%脫脂牛奶-TBST 37 ℃封閉 1 h，然后加入 抗體 [beclin-1(1∶1 000)、LC3(1∶3 000)、caspase-3(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)]，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌后，加入兔 II抗(1∶8 000)37 ℃孵育 1 h，TBST洗滌后，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，Western bolt 的條帶用 Quality One 軟件分析，所有的結(jié)果重復(fù)至少3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)至少3次，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，依據(jù)方差齊性選用Tukey 或 Dunnett’s，見圖2A 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CSE誘導(dǎo)HPAECs的活力下降

用 MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)1%、2.5%和5%的 CSE 處理12 h后HPAECs的活力下降不明顯，10% CSE 處理12 h后與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖1。故此后實(shí)驗(yàn)選取10% CSE處理細(xì)胞12 h作為實(shí)驗(yàn)條件。

Figure 1.The influence of different concentrations of CSE on cell viability. Dose-dependent effects and time-dependent effects of CSE on growth inhibition of human pulmonary artery endothelial cells were showed. Mean±SD.n=6.

圖1 不同濃度CSE對細(xì)胞活力的影響

2 CSE可誘導(dǎo)HPAECs產(chǎn)生自噬

MDC可被細(xì)胞吸收并選擇性聚集于自噬泡中，用熒光顯微鏡觀察時(shí)可發(fā)現(xiàn)染上 MDC熒光的自噬泡呈綠色點(diǎn)狀。CSE處理后，細(xì)胞自噬泡較正常組明顯增多，見圖2A。10% CSE作用12 h后，CSE組的LC3和beclin-1蛋白表達(dá)明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2B。

Figure 2.Autophagy of HPAECs in CSE group and control group. A: the image of MDC staining showed the formation of autophagy bodies; B: the results of Western blot detection showed the protein expression of beclin-1 and LC3. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖2 CSE作用前后HPAECs自噬水平的比較

3 抑制自噬增加CSE誘導(dǎo)的 HPAECs 凋亡

本實(shí)驗(yàn)用Annexin V+/PI-及Annexin V+/PI+細(xì)胞數(shù)之和占細(xì)胞總數(shù)的百分比作為凋亡細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。CSE組的細(xì)胞凋亡率與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；3-MA預(yù)處理組細(xì)胞凋亡與對照組比較無明顯差異;3-MA+CSE 組的凋亡率進(jìn)一步增加，與 CSE組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3。

4 抑制自噬促進(jìn)CSE誘導(dǎo)的 HPAECs cleaved caspase-3蛋白水平增加

為進(jìn)一步探討自噬和凋亡之間的關(guān)系，應(yīng)用自噬抑制劑3-MA處理細(xì)胞后，能明顯抑制CSE引起的beclin-1表達(dá)上調(diào)和LC3-II/LC3-I比值上調(diào)，但caspase-3活化片段的蛋白量更高，見圖4。

Figure 3.Apoptotic rate in each group analyzed by flow cytometry with Annexin V/PI staining. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vscontrol group.

圖3 Annexin V/PI 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡結(jié)果

Figure 4.The results of Western blot showed the changes of beclin-1, LC3 and cleaved caspase-3. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

圖4 Western blot 檢測beclin-1、LC3和caspase-3活化片段的改變

討 論

肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞襯于肺血管內(nèi)腔表面，一方面維持血液的正常流動(dòng),起屏障作用，另一方面分泌血管活性物質(zhì)，維持血管正常的張力、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。肺動(dòng)脈內(nèi)皮凋亡可使上述穩(wěn)態(tài)破壞，并引起肺血管平滑肌細(xì)胞及凋亡抵抗型內(nèi)皮細(xì)胞的異常增生從而導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓[8-9]。既往研究認(rèn)為，缺氧是導(dǎo)致肺血管重構(gòu)的主要因素[10]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在無低氧血癥的輕度 COPD吸煙患者同樣發(fā)生了肺血管重構(gòu)，提示香煙煙霧可能影響早期肺血管結(jié)構(gòu)變化[8]。本研究將CSE直接作用于肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，模擬吸煙后煙霧化學(xué)成分吸收進(jìn)入血液循環(huán)的過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSE可以濃度和時(shí)間依賴性地引起肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，和正常對照組相比，10% CSE干預(yù)12 h可使HPAEC出現(xiàn)凋亡率明顯增加。分子層面上，通過檢測處于凋亡核心位置的死亡蛋白酶caspase-3發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧提取物刺激HPAECs后可導(dǎo)致的caspase-3活化，這表明香煙煙霧暴露能夠引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

自噬是機(jī)體一種重要的防御機(jī)制，細(xì)胞通過隔離膜包裹胞質(zhì)中的蛋白或細(xì)胞器，形成封閉、雙層的膜性結(jié)構(gòu)，即自噬體。自噬體經(jīng)過一系列步驟后成熟，通過與內(nèi)體小泡融合，遞送至溶酶體，最終，通過溶酶體蛋白酶降解其內(nèi)容物[11]。故從本義上講，自噬是機(jī)體保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)微環(huán)境重要的自我調(diào)節(jié)和保護(hù)機(jī)制。自噬與細(xì)胞死亡之間的關(guān)系十分復(fù)雜。在饑餓、缺氧等不利條件下,自噬對維持細(xì)胞存活具有積極作用，通過自噬，細(xì)胞能自我消化部分蛋白，幫助抵御一過性代謝壓力。另一方面，高強(qiáng)度的自噬必然瓦解細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致不可逆的功能喪失乃至死亡[4, 6]。

從自體吞噬角度研究肺血管損傷的病理過程目前積累的研究并不多。LC3是目前觀察自噬現(xiàn)象是否存在，研究自噬活性較為可靠的生物學(xué)標(biāo)志物。在細(xì)胞的自噬過程中，游離于胞質(zhì)中的LC3-I 逐漸以LC3-II的形式定位于自噬小囊泡膜表面。因此，LC3-II轉(zhuǎn)化水平可以反映細(xì)胞自噬發(fā)生的程度[12-13]。Beclin-1 蛋白是 JNK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分，通過其形成復(fù)合體，自噬相關(guān)蛋白被引導(dǎo)并定位于自噬體膜上，調(diào)控自噬前體的形成[14]。有研究顯示，煙霧暴露后，COPD患者肺組織中自噬的標(biāo)志蛋白LC3-II和beclin-1的表達(dá)升高。然而，Lee等[5]通過對慢性缺氧小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，它通過調(diào)節(jié)缺氧環(huán)境下肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡而在肺血管損傷中發(fā)揮保護(hù)性作用。本研究發(fā)現(xiàn) HPAECs 經(jīng)CSE處理后，本實(shí)驗(yàn) MDC 染色結(jié)果表明 , 人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在 CSE作用 24 h 后有大量自噬空泡積聚，同時(shí) LC3-II/LC3-I 的表達(dá)比例以及 beclin-1的表達(dá)明顯增加，與 MDC 染色結(jié)果一致，提示CSE暴露可引起HPAECs發(fā)生自噬。

細(xì)胞自噬作為保守型程序性死亡方式，與凋亡的關(guān)系得到了廣泛的研究，但暫無文獻(xiàn)報(bào)道自噬在香煙煙霧暴露引發(fā)的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。鑒于此，本研究用特異性自噬抑制劑3-MA 預(yù)處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)用 3-MA+CSE預(yù)處理后細(xì)胞的自噬泡明顯減少，LC3-II/LC3-I 的表達(dá)比例和 beclin-1的表達(dá)水平明顯下降，提示細(xì)胞自噬受到抑制。同時(shí)，伴隨細(xì)胞活性的進(jìn)一步下降，細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3水平增加，提示自噬在CSE引起的 HPAECs 凋亡過程中起保護(hù)細(xì)胞的作用，抑制自噬后引起caspase依賴的細(xì)胞凋亡。

自噬與凋亡之間依生物學(xué)背景而變化的復(fù)雜關(guān)系有待于進(jìn)一步研究闡明，本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSE導(dǎo)致 HPAECs 通過caspase依賴的凋亡途徑發(fā)生凋亡，且證實(shí)了細(xì)胞自噬在CSE引起的 HPAECs 凋亡起著保護(hù)性作用。本研究豐富了香煙煙霧暴露所致肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為篩選防治煙霧暴露損傷可能的新分子靶標(biāo)和臨床藥物開發(fā)提供新思路。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Autophagy is involved in pulmonary artery endothelial cell apoptosis induced by cigarette smoke extract

XUE Hong1, WANG Hong2, XU Neng-luan1, CHEN Yu-sheng1, SU Jian3, XIE Wei-ping2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,FujianProvincialHospital,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China;3DepartmentofChronicDiseases,JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China.E-mail:xuehong@fjsl.com.cn)

AIM: To investigate the role of autophagy in the apoptosis of human pulmonary artery endothelial cells (HPAECs) induced by cigarette smoke extract (CSE). METHODS: HPAECs were cultured routinely. HPAECs were treated with CSE at different concentrations, and the cell viability was detected by MTT assay. HPAECs were divided into control group, CSE group, 3-methyladenine (3-MA) group and 3-MA+CSE group. The autophagy was observed under fluorescence microscope with monodansylcadaverine (MDC) staining. Annexin V/propidium iodide staining and Hoechst 33342 staining were employed to detect apoptosis. In addition, the protein levels of LC3, beclin-1 and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. RESULTS: MDC staining showed the increased production of autophagic vacuoles was observed in CSE group. The results of Western blot showed that the expression levels of autophagy-related proteins LC3 and beclin-1 were increased, while 3-MA pretreatment inhibited the expression of these proteins and the production of autophagic vacuoles. Observation with Annexin V/propidium iodide staining and Hoechst 33342 staining showed that the apoptotic rate in CSE group was significantly higher than that in control group, and pretreatment with 3-MA induced further increase in the cell apoptosis. The protein level of cleaved caspase-3 in CSE group was significantly higher than that in control group (P<0.05), and 3-MA+CSE treatment induced the further increase in the protein level of cleaved caspase-3. CONCLUSION: CSE induces autophagy and apoptosis in the HPAECs. Inhibition of autophagy promotes the apoptosis induced by CSE in HPAECs, which can be achieved through activation of caspase-3.

Autophagy; Human pulmonary artery endothelial cells; Cigarette smoke extract; Apoptosis

1000- 4718(2017)04- 0603- 05

2016- 10- 24

2017- 01- 13

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2015J05143)； 福建省衛(wèi)生計(jì)生委青年科研課題(No.2015-2-4)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.005

△通訊作者 Tel: 0591-88217531； E-mail: xuehong@fjsl.com.cn