高繼勇， 馮占超， 徐京風(fēng)， 李福海

(1濟(jì)南市婦幼保健院兒科， 山東 濟(jì)南 250001； 2山東省單縣婦幼保健院保健科， 山東 單縣 274300； 3山東省地礦職工醫(yī)院兒科， 山東 濟(jì)南 250013； 4山東大學(xué)齊魯醫(yī)院兒科， 山東 濟(jì)南250002)

過表達(dá)miRNA-29a對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓的作用*

高繼勇1， 馮占超2， 徐京風(fēng)3， 李福海4△

(1濟(jì)南市婦幼保健院兒科， 山東 濟(jì)南 250001；2山東省單縣婦幼保健院保健科， 山東 單縣 274300；3山東省地礦職工醫(yī)院兒科， 山東 濟(jì)南 250013；4山東大學(xué)齊魯醫(yī)院兒科， 山東 濟(jì)南250002)

目的： 檢測(cè)微小RNA(miRNA)-29a在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈血管壁組織中的表達(dá)，研究過表達(dá)miRNA-29a對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠的影響，并探討其初步機(jī)制。方法: 在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型上，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定肺組織miRNA-29a的表達(dá)水平；尾靜脈注射miRNA-29a-mimic后，記錄大鼠肺動(dòng)脈壓和體循環(huán)動(dòng)脈壓，蘇木素-伊紅染色觀察肺動(dòng)脈組織的形態(tài)，Western blot檢測(cè)肺動(dòng)脈組織中p-Akt與p-eNOS的蛋白水平。結(jié)果: 野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈血管壁組織中miRNA-29a呈低表達(dá)；過表達(dá)miRNA-29a后，大鼠肺動(dòng)脈壓明顯下降，體循環(huán)血壓無顯著變化，肺動(dòng)脈中膜增厚程度顯著減弱，肺血管重構(gòu)現(xiàn)象不明顯，p-Akt與p-eNOS的蛋白水平上調(diào)。結(jié)論: 過表達(dá)miRNA-29a對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓具有改善作用，可能與激活PI3k/Akt-eNOS信號(hào)通路有關(guān)。

肺動(dòng)脈高壓； 微小RNA-29a； PI3k/Akt-eNOS信號(hào)通路

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺動(dòng)脈壓力升高和肺血管阻力增加為特征的、由不同病因?qū)е碌木C合征。由于肺動(dòng)脈壓力病理升高，引起右心衰竭，被稱為“心血管系統(tǒng)的惡性腫瘤”[1]。目前臨床上進(jìn)行手術(shù)治療的風(fēng)險(xiǎn)極高，預(yù)后很差；藥物治療僅限于應(yīng)用內(nèi)皮細(xì)胞舒縮調(diào)節(jié)因子，如前列腺素類似物等，可以改善肺動(dòng)脈高壓患者的癥狀，但患者的5年存活率依舊不高[2-3]。

微小RNA(mircoRNA, miRNA)-29家族主要有miRNA-29a、miRNA-29b與miRNA-29c，其中miRNA-29a的編碼基因位于7號(hào)染色體[4]。研究顯示在胚胎期的組織中，miRNA-29不表達(dá)或呈低表達(dá)，但在成熟后，于肺、腎與心臟等組織細(xì)胞中呈高表達(dá)，是參與調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化形成、發(fā)生和發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素[5]。國(guó)外有學(xué)者在研究小鼠心肌梗死模型與人心肌梗死病例時(shí)發(fā)現(xiàn)，在心臟梗死區(qū)域miRNA-29的表達(dá)顯著下調(diào)，提示miRNA-29可能與心肌細(xì)胞的纖維化有關(guān)[6]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miRNA-29a對(duì)腹主動(dòng)脈瘤的平滑肌細(xì)胞增殖凋亡有影響，過表達(dá)miRNA-29a可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡[7]。本文觀察肺動(dòng)脈高壓大鼠模型肺動(dòng)脈血管壁miRNA-29a的表達(dá)，并通過過表達(dá)miRNA-29a，觀察野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓的變化。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

健康Wistar大鼠40只，雄性，清潔級(jí)，8～12周齡，體重200～250 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于溫度恒定(22±2) ℃、濕度恒定(55±5)%的環(huán)境中，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)食，自由飲水。

MCT購(gòu)自Sigma。將MCT溶于1 mol/L稀鹽酸，配置成1%濃度的溶液，用1 mol/L氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至7.2，用生理鹽水配置為10 g/L的溶液備用。miRNA-29a negative control (miRNA-29a-NC)與miRNA-29a-mimic由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；抗Akt和p-Akt抗體購(gòu)自CST；抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)和p-eNOS抗體購(gòu)自BD。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的建立 大鼠進(jìn)行皮下注射野百合堿溶液60 mg/kg，自由進(jìn)食、飲水，4周后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，肺動(dòng)脈高壓組大鼠注射相同劑量的生理鹽水，行經(jīng)胸體表彩超鑒定，對(duì)比肺動(dòng)脈主干內(nèi)徑數(shù)據(jù)與主動(dòng)脈寬度數(shù)據(jù)。

2.2 qPCR測(cè)定miRNA-29a的表達(dá) 取適量正常大鼠與肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺組織，剪碎，按照TRIzol說明書裂解細(xì)胞，使用氯仿提取總RNA，用紫外分光光度法測(cè)定RNA樣品的A260值，并進(jìn)行定量。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，miRNA-29a的上游引物為5’-CATCTGACTAGCACCATCTGAAAT-3’，下游引物為5’-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3’；內(nèi)參照U6的上游引物為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物為5’ -GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s,62 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增完成后，標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增曲線由PCR儀器自動(dòng)生成，所得結(jié)果直接在熒光定量操作系統(tǒng)中進(jìn)行比較分析，目標(biāo)基因的相對(duì)定量按2-ΔΔCt計(jì)算。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分為正常對(duì)照組(control組)、肺動(dòng)脈高壓組(PAH組)、空白載體組(miR-29a-NC組)與miRNA-29a-mimic組，每組各10只大鼠。正常對(duì)照組不進(jìn)行造模；造模成功的大鼠隨機(jī)分為肺動(dòng)脈高壓組、空白載體組與miR-29a-mimic組，miR-29a-mimic組大鼠給予尾靜脈注射miRNA-29-mimic，空白載體組給予等量miRNA-29a-NC。

2.4 尾靜脈注射miR-29a-mimic 將1 μL(1 nmol)的miRNA-29a-NC或者miR-29a-mimic溶于100 μL PBS中，隨后將30 μL Lipofectamine 2000與70 μL PBS相互混合，最后將以上2種混合物混合均勻，并室溫放置30 min，使用胰島素注射器通過尾靜脈注射方式注入小鼠體內(nèi)。

2.5 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 給藥完成后，各組大鼠每100 g體重腹腔注射肝素 50 U，5 min后采用10%氨基甲酸乙酯(1 g/kg)腹腔麻醉，經(jīng)右頸外靜脈進(jìn)行右心室插管術(shù)，用20號(hào)套管針經(jīng)右心室穿刺至肺動(dòng)脈主干，記錄大鼠肺動(dòng)脈壓(pulmonary artery pressure，PAP)，退出導(dǎo)管，在近心端結(jié)扎右頸外靜脈，從右頸總動(dòng)脈插入導(dǎo)管，記錄體循環(huán)動(dòng)脈壓(systemic arterial pressure，SAP)。

2.6 肺動(dòng)脈組織形態(tài) 處死大鼠，分離左肺，用15 cmH2O壓力沿氣管注射4%多聚甲醛，石蠟包埋、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺血管形態(tài)，計(jì)算機(jī)圖像分析計(jì)算中膜厚度占血管直徑的百分比(WT%)和中膜面積占血管壁總面積百分比(WA%)。

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 給藥完成后，取各組大鼠的肺動(dòng)脈組織，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解，提取總蛋白后采用BCA法定量，調(diào)整蛋白濃度。取適量裂解產(chǎn)物，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，加入5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，孵育相應(yīng) I 抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后，室溫孵育相應(yīng) II 抗1 h，洗膜，使用化學(xué)發(fā)光法試劑盒對(duì)PVDF膜進(jìn)行曝光顯影，成像掃描分析系統(tǒng)測(cè)定目的和內(nèi)參照條帶的吸光度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織miRNA-29a的表達(dá)

結(jié)果顯示，肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織中miRNA-29a的表達(dá)顯著低于正常大鼠，見圖1。給予尾靜脈注射miR-29a-mimic 4周后，檢測(cè)大鼠肺組織中miRNA-29a的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射miR-29a-mimic后大鼠肺組織中miRNA-29a的表達(dá)顯著升高，見圖2。

Figure 1.The expression of miRNA-29a in the lung tissue of pulmonary hypertension rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1 miRNA-29a在肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織的表達(dá)

2 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)

與正常對(duì)照組組相比，肺動(dòng)脈高壓組大鼠的肺動(dòng)脈壓顯著升高，右心壁明顯增厚；與空白載體組相比，miR-29a-mimic組大鼠的肺動(dòng)脈壓明顯下降，右心壁增厚程度減弱；3組大鼠的體循環(huán)血壓無顯著變化，見表1。

Figure 2.The expression of miRNA-29a in the lung tissue of pulmonary hypertension rats after transfection with miR-29a-mimic. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPAH group.

圖2 轉(zhuǎn)染miR-29a-mimic后，miRNA-29a在肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織的mRNA表達(dá)

3 各組大鼠肺動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)觀察

與正常對(duì)照組相比，肺動(dòng)脈高壓組大鼠的肺動(dòng)脈中膜明顯增厚，有顯著的肺血管重構(gòu)現(xiàn)象，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脫落，WT%和WA%顯著升高；與肺動(dòng)脈高壓組相比，miR-29a-mimic組大鼠的肺動(dòng)脈中膜增厚程度顯著減弱，肺血管重構(gòu)現(xiàn)象不明顯，WT%和WA%明顯降低，見圖3、表1。

Figure 3.The morphological observation of pulmonary arteries of rats in each group (×200).

圖3 各組大鼠肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)變化的比較

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPAH group.

4 p-Akt與p-eNOS蛋白水平的變化

檢測(cè)各組大鼠肺動(dòng)脈組織p-Akt與p-eNOS蛋白水平的變化，結(jié)果顯示肺動(dòng)脈高壓組大鼠p-Akt與p-eNOS的蛋白水平顯著下調(diào)； miR-29a-mimic組大鼠p-Akt與p-eNOS的蛋白水平明顯高于肺動(dòng)脈高壓組，見圖4。

討 論

我們研究發(fā)現(xiàn)在野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中，肺動(dòng)脈血管壁組織中miRNA-29a的表達(dá)水平比正常大鼠低，提示miRNA-29a在大鼠肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制中具有特異性，推測(cè)miRNA-29a在肺動(dòng)脈高壓中可能具有調(diào)控的作用。我們給肺動(dòng)脈高壓大鼠尾靜脈注射miRNA-29a-mimic，結(jié)果顯示miRNA-29a-mimic轉(zhuǎn)染后，肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺動(dòng)脈壓明顯下降，肺動(dòng)脈中膜增厚程度顯著減弱，肺血管重構(gòu)現(xiàn)象不明顯，提示過表達(dá)miRNA-29a能夠改善肺動(dòng)脈高壓的肺血管重構(gòu)現(xiàn)象，推測(cè)可能是由于過表達(dá)miRNA-29a減少了肺組織細(xì)胞的凋亡。

Figure 4.The protein levels of p-Akt and p-eNOS. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPAH group.

圖4 p-Akt與p-eNOS蛋白水平的變化

PI3K/Akt信號(hào)通路是體內(nèi)非常重要的分子信號(hào)通路，而NOS主要存在3種異構(gòu)體，eNOS是血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮的主要途徑。PI3K通過激活A(yù)kt，使Akt發(fā)生磷酸化與eNOS磷酸化，從而促進(jìn)一氧化氮的生成與釋放，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，降低血管的張力[8-9]。eNOS第1 179位絲氨酸(Ser1179)的磷酸化是調(diào)控eNOS活性的關(guān)鍵位點(diǎn)[10]。研究發(fā)現(xiàn)Akt激活后，能夠增強(qiáng)eNOS Ser1179位點(diǎn)的磷酸化水平從而激活eNOS，生成一氧化氮[11]。我們采用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miRNA-29a對(duì)肺動(dòng)脈組織中p-Akt與p-eNOS的蛋白水平具有上調(diào)作用，推測(cè)過表達(dá)miRNA-29a后，激活PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路，使得Akt與eNOS磷酸化，進(jìn)一步增加一氧化氮的生成與釋放，降低肺動(dòng)脈血管張力，降低肺動(dòng)脈的壓力，改善右心功能，提高肺動(dòng)脈高壓大鼠的生存時(shí)間。同時(shí)我們通過對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的檢測(cè)，的確發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miRNA-29a后大鼠的肺動(dòng)脈壓明顯下降和右心壁增厚程度減弱。

綜上所述，miRNA-29a主要是通過激活PI3K/Akt-eNOS信號(hào)通路對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓發(fā)揮調(diào)控作用，因此本實(shí)驗(yàn)為尋找慢性炎癥型肺動(dòng)脈高壓的新治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of miRNA-29a on monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats

GAO Ji-yong1, FENG Zhan-chao2, XU Jing-feng3, LI Fu-hai4

(1DepartmentofPediatrics,JinanMaternalandChildHealthHospital,Jinan250001,China;2DepartmentofHealth,ShanxianMaternalandChildHealthHospital,Shanxian274300,China;3DepartmentofPediatrics,Worker’sHospitalofShandongProvincialBureauofGeology&MineralResources,Jinan250013,China;4DepartmentofPediatrics,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250002,China.E-mail:drlifuhai@126.com)

AIM: To detect the expression of microRNA (miRNA)-29a in pulmonary arteries of monocrotaline (MCT)-induced pulmonary hypertensive rats, and to investigate the effects of miRNA-29a on pulmonary hypertension. METHODS: MCT-induced pulmonary hypertensive model was established in Wistar rats. The expression of miRNA-29a in the lung tissue was determined by qPCR. miRNA-29a was overexpressed in the pulmonary hypertension rats by tail vein injection of miRNA-29a-mimic. Pulmonary artery pressure (PAP) and systemic arterial pressure (SAP) were measured. The morphological changes of the pulmonary arteries were observed by HE staining. The protein levels of p-Akt and p-eNOS were detected by Western blot.RESULTS: The mRNA expression of miRNA-29a was significantly decreased in the pulmonary arteries of MCT-induced pulmonary hypertensive rats. Furthermore, after overexpression of miRNA-29a, PAP was remarkably reduced, while SAP remained unchanged. In addition, the increased thickness of tunica media, the remodeling of pulmonary arteries and the decreased protein levels of p-Akt and p-eNOS in the pulmonary hypertensive rats were dramati-cally changed after miRNA-29a overexpression.CONCLUSION: Overexpression of miRNA-29a ameliorates pulmonary hypertension in rats. These effects may be associated with the activation of PI3K/Akt-eNOS signaling pathway.

Pulmonary hypertension; MicroRNA-29a; PI3K/Akt-eNOS signaling pathway

1000- 4718(2017)04- 0608- 04

2017- 01- 03

2017- 02- 27

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2013WSB20008)

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.006

△通訊作者 Tel: 0531-82169216； E-mail: drlifuhai@126.com