謝東芳，呂常江，方卉，楊衛(wèi)康，胡升，趙偉睿，黃俊，梅樂和

1 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023

2 浙江大學(xué) 寧波理工學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315100

手性胺是一類具有重要價(jià)值的醫(yī)藥及精細(xì)化工中間體[1]。目前，超過70%的藥物，如神經(jīng)類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感染藥物及疫苗等都是以手性胺作為中間體來合成的。例如，抗糖尿病新藥Januvia的主要成分西他列汀是R-型胺[2]。化學(xué)方法合成手性胺通常成本高、污染大、光學(xué)純度低，而生物合成法具有產(chǎn)物光學(xué)純度高、立體選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。目前可以用于手性胺合成的生物催化劑主要有胺脫氫酶[3-5]、人工金屬酶[6]、單胺氧化酶[7-8]、亞胺還原酶[9-10]和ω-轉(zhuǎn)氨酶等[2,11]。其中，ω-轉(zhuǎn)氨酶以前手性酮類化合物作為底物，通過立體選擇性的轉(zhuǎn)氨基作用實(shí)現(xiàn)手性胺的生物合成，且產(chǎn)物純度高，具有相對更好的工業(yè)應(yīng)用前景[11-12]。

根據(jù) ω-轉(zhuǎn)氨酶作用底物的立體構(gòu)型，可將ω-轉(zhuǎn)氨酶分為 (S)-ω-TA和 (R)-ω-TA，兩者分別作用于 (S)-型底物與 (R)-型底物。相對于 (S)-ω-TA，(R)-ω-TA的研究較少，但其需求量隨著手性胺類藥物的發(fā)展日趨增大[13-14]。顯然，挖掘具有潛在應(yīng)用價(jià)值的 (R)-ω-TA對于實(shí)現(xiàn)手性胺生物合成和工業(yè)生產(chǎn)具有重要價(jià)值[2,15-19]。到目前為止，人們已從節(jié)桿菌Arthrobacter和河流弧菌Vibrio fluvialis等種屬中克隆了多種 (R)-ω-TA基因，通過異源表達(dá)和純化獲取了重組 (R)-ω-TA，并研究了相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)[20-23]。值得關(guān)注的是，以來源于土曲霉Aspergilus terreus的 (R)-ω-TA作為生物催化劑用于生產(chǎn)對映體手性胺具有較高的對映體選擇性和產(chǎn)率[24]。但該酶熱穩(wěn)定性較差，在實(shí)際應(yīng)用中受到了較大的限制[25]。因此，進(jìn)一步提高 (R)-ω-TA的熱穩(wěn)定性是拓展該酶應(yīng)用的有效途徑。

近年來，基于溫度因子 (B-factor) 策略篩選潛在氨基酸殘基的突變位點(diǎn)，并結(jié)合蛋白質(zhì)工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)酶分子的理性改造被認(rèn)為是提升酶熱穩(wěn)定性的最為有效的手段之一[26-29]。B-factor能反映某個(gè)氨基酸殘基在整個(gè)蛋白質(zhì)分子的柔性，B-factor值越大，相應(yīng)部位的構(gòu)象就越不穩(wěn)定或柔性越大，不利于酶的穩(wěn)定性。Reetz等[27]發(fā)現(xiàn)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中 B-factor較高的氨基酸進(jìn)行飽和突變，部分突變體的熱穩(wěn)定性可以得到明顯提高。Cesarini等[30]使用B-factor預(yù)測來源于綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa的脂肪酶不穩(wěn)定的殘基位點(diǎn)，并進(jìn)行飽和突變，與野生酶相比，獲得的突變酶在加熱孵育后的相對殘余活力提高了 7倍。Huang等[25]利用 B-factor并結(jié)合能量優(yōu)化策略對來源于A. terreus的(R)-ω-轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行改造，在40 ℃條件下，突變酶的半衰期時(shí)間比野生酶延長了15.8 min，半失活溫度 (T5010) 比野生酶提高了5 ℃。

Loop區(qū)域是指暴露在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面并且具有較高的B-factor的環(huán)，理論上這部分區(qū)域遠(yuǎn)離活性中心，對酶的功能沒有影響；該區(qū)域具有較高的 B-factor，在熱運(yùn)動(dòng)作用下的形變較大，能顯著影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[31]。Thompson和Eisenberg首先提出通過刪除Loop區(qū)域表面的氨基酸提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的設(shè)想[32]。Damnjanovi?等[31]通過刪除來源于鏈霉菌Streptomyces磷脂酶的D40 Loop區(qū)域表面不穩(wěn)定的氨基酸，成功獲得了在70 ℃加熱24 h后半衰期比野生酶延長11.7 min的突變酶。

基于以上理論，本文通過 PyMol軟件和YASARA軟件預(yù)測來源于A. terreus的 (R)-ω-TA Loop區(qū)域，并分析 Loop區(qū)域中各個(gè)氨基酸殘基的B-factor值，從而確定了該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不穩(wěn)定的氨基酸殘基位點(diǎn)，再結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)對它們進(jìn)行逐步刪除，以期獲得熱穩(wěn)定性明顯高于野生型的突變體。此外，進(jìn)一步通過分子動(dòng)力學(xué)及Loop區(qū)域分子間相互作用的模擬探討了熱穩(wěn)定性提高的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　酶與試劑

DpnⅠ酶購于 Thermo Scientific公司，PrimeStar Max DNA聚合酶購于 TaKaRa公司(寶生物工程大連有限公司，中國)。引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成 (中國)。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒以及SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于康為世紀(jì)生物科技有限公司 (中國)?？捡R斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、Ni-NTA 層析介質(zhì)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素、DNA和蛋白質(zhì)Marker購于生工生物工程 (上海) 股份有限公司。

1.1.2　菌株與質(zhì)粒

(R)-ω-TA表達(dá)宿主菌E. coliBL21(DE3) 及重組質(zhì)粒 pET-28a-ω-opt-TA為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.1.3　培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10 g/L氯化鈉，pH 7.0。

1.2　突變文庫的構(gòu)建

根據(jù) (R)-ω-TA 的基因序列 (GenBank Accesion No. XM_001209325) 設(shè)計(jì)6對定點(diǎn)突變引物，如表 1所示。以 pET-28a-ω-opt-TA質(zhì)粒為模板，分別采用表 1中的引物，克隆獲取目標(biāo)突變體質(zhì)?；?；使用DpnⅠ對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行消化處理 (37 ℃，2 h)，以消除父本模板；采用熱擊轉(zhuǎn)化法將克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coliDH 5α感受態(tài)細(xì)胞中。突變體基因經(jīng)通用生物系統(tǒng) (安徽) 有限公司測序驗(yàn)證后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化至E. coliBL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，獲取目標(biāo)重組菌株。

表1　定點(diǎn)突變引物及其序列Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis

1.3　野生酶和突變酶的表達(dá)和純化

挑取野生型及突變體單菌落接種至 5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過夜。隨后，將菌液以1%的接種量 (V/V) 轉(zhuǎn)接至200 mL含50 μg/mL卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.4?0.6時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，并于25 ℃、150 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h后收集菌體細(xì)胞。

將收獲的菌體細(xì)胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0) 離心洗滌 2次后重懸于20 mL破胞緩沖液中 (50 mmol/L磷酸二氫鈉，300 mmol/L氯化鈉，20 mmol/L咪唑，pH 8.0)，超聲處理破碎細(xì)胞 (超聲條件：功率 300 W，工作3 s，間歇6 s，超聲15 min)，離心30 min(12000 r/min，4 ℃)，收集上清液，即得到含有(R)-ω-TA的粗酶液。粗酶液經(jīng) 0.45 μm濾膜過濾后采用Ni-NTA親和層析獲取目標(biāo)重組蛋白，并分別采用 SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)法測定純化后的蛋白純度及濃度。

1.4　野生酶和突變酶的熱穩(wěn)定性測定

分別將純化后的野生酶和突變酶在25?55 ℃水浴中孵育10 min，孵育結(jié)束后迅速放置在冰上冷卻 10 min。底物溶液用磷酸鹽緩沖液 (50 mmol/L，pH 8.0) 配制，200 μL 的反應(yīng)體系中包括180 μL的底物溶液 (0.25% DMSO、2.5 mmol/L (R)-(+)-α-甲基芐胺 ((R)-α-MBA)、2.5 mmol/L 丙酮酸以及 0.1 mmol/L PLP)，20 μL純酶液 (約0.3 mg/mL)，采用MD190酶標(biāo)儀檢測波長在245 nm處相應(yīng)的酶活力，測定方法具體參照文獻(xiàn)[33]。以溫度為橫坐標(biāo)，以熱處理后與處理前酶活力的比值為縱坐標(biāo)作圖，采用 Origin 8.0軟件進(jìn)行Boltzmann S型函數(shù)擬合，計(jì)算半失活溫度(T5010)。

將野生酶和突變酶在 40 ℃下分別孵育2?50 min，孵育結(jié)束后迅速放置在冰上冷卻10 min，采用上述方法測定酶活力。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以熱處理后與處理前比活力的比值為縱坐標(biāo)作圖，通過Origin 8.0軟件擬合非線性方程y=exp (–kd·t)，一階速率常數(shù) (kd) 經(jīng)非線性回歸確定，并計(jì)算酶活力降低為 50%時(shí)所對應(yīng)的半衰期(t1/2)。

1.5　野生酶和突變酶的最適反應(yīng)溫度測定

在180 μL預(yù)熱的底物溶液中加入20 μL純酶液(約 0.3 mg/mL)，并迅速置于不同溫度 (25?60 ℃)的恒溫混勻儀中，400 r/min條件下反應(yīng)3 min。隨后，將含有上述混合物的離心管迅速放入100 ℃的水浴鍋中煮沸10 min；冰上放置10 min后利用酶標(biāo)儀檢測波長245 nm處的OD值。

1.6　野生酶和突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定

采用50 mmol/L的磷酸緩沖液 (pH 8.0) 配制不同濃度 (0?3 mmol/L) 的底物 (R)-α-MBA 和丙酮酸溶液。使用MD190酶標(biāo)儀測定在不同底物濃度條件下的酶活力，以底物濃度[S]對反應(yīng)速率[V]作圖，通過非線性擬合計(jì)算相應(yīng)的Km和Vmax值，然后根據(jù)kcat=Vmax/[E0] ([E0]為酶初始濃度，單位mmol/L) 計(jì)算求得kcat和催化效率kcat/Km。

1.7　野生酶和突變酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬

在Protein Data Bank (PDB數(shù)據(jù)庫) 中搜索來源于A. terreus的 (R)-ω-轉(zhuǎn)氨酶晶體結(jié)構(gòu)，選擇分辨率為1.6 ?的結(jié)構(gòu) (PDB ID: 4CE5)[24]作為模板，采用 Swiss Model建模方法 (http://swissmodel.expasy.org) 構(gòu)建突變體的三維結(jié)構(gòu)，并采用YASARA軟件中的Amber14力場，對野生酶和突變酶在313 K和400 K溫度下進(jìn)行了時(shí)長為10 ns的動(dòng)力學(xué)模擬。模擬過程為：以PDB格式的野生型和突變體 (R)-ω-TA的三維結(jié)構(gòu)作為分子動(dòng)力學(xué)模擬的初始結(jié)構(gòu)，經(jīng)加氫處理后將晶體結(jié)構(gòu)放置于 10 ?×10 ?×10 ? 的立方體盒子中，并以 0.98 g/L的密度填充水分子，并向體系中添加合適的抗衡離子 (Na+/Cl–)，使模擬系統(tǒng)呈電中性。范德華力相互作用的短程截?cái)嗑嚯x為7.86 ?，采用 Particle Mesh Ewald方法計(jì)算長程靜電相互作用。

2　結(jié)果與分析

2.1　(R)-ω-轉(zhuǎn)氨酶的Loop區(qū)域預(yù)測及分析

B-factor反映了氨基酸殘基在整個(gè)蛋白質(zhì)分子中的柔性，B-factor值越大，相應(yīng)部位的構(gòu)象柔性就越大。本研究利用 PyMOL軟件和YASARA軟件預(yù)測了Loop區(qū)域的B-factor，結(jié)果如圖 1所示。除了N-端和C-端以外，Loop區(qū)域表面的氨基酸殘基具有較高的B-factor，其中Arg131、Pro132和Glu133處于Loop區(qū)域的黃色顏色部分，是B-factor最大的位點(diǎn)。與(R)-ω-TA中所有原子的平均B-factor (21) 相比，131位點(diǎn)的精氨酸 (Arg131)、132位點(diǎn)的脯氨酸 (Pro132)及133位點(diǎn)的谷氨酸 (Glu133) 的B-factor分別高出41、23與31。因此，選取這3個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基用于考察其缺失對于 (R)-ω-TA熱穩(wěn)定性的影響。

2.2　野生酶和突變酶的表達(dá)和純化

對 (R)-ω-TA的Loop區(qū)域 (圖1) 中上述3個(gè)不穩(wěn)定的氨基酸殘基進(jìn)行了逐一刪除，獲取了相應(yīng)的重組突變體酶，并分別命名為R131del、P132del和E133del。此外，同時(shí)刪除相鄰的2個(gè)氨基酸殘基及同時(shí)刪除這3個(gè)氨基酸殘基的重組突變體也被進(jìn)一步構(gòu)建并提取純酶，分別命名為R131-P132del、P132-E133del和R131-P132-E133del。經(jīng) Ni-NTA親和層析純化后的野生酶及突變酶的SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖2所示，純化后的野生酶和突變酶的電泳條帶清晰且單一，其分子量約為36 kDa，與理論分子量相一致，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。

圖1　(R)-ω-轉(zhuǎn)氨酶的三維結(jié)構(gòu)Fig. 1 Simulated three-dimensional structure of(R)-ω-TA. The most flexible region according to B-factors from x-ray crystal structure is used as the target for of residue deletion. The active center (Lys 180)is shown as green spheres.

圖2　野生酶和突變酶的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of wide type enzyme and mutant enzymes. M: protein marker; lane 1: wide type enzyme; lane 2: mutant enzyme R131del; lane 3: mutant enzyme P132del; lane 4: mutant enzyme E133del; lane 5:mutant enzyme R131-P132 del; lane 6: mutant enzyme P132-E133del; lane7: mutant enzyme R131-P132-E133del.

2.3　野生酶和突變酶的熱穩(wěn)定性

圖3　野生酶和突變酶的熱穩(wěn)定性Fig. 3 Thermostability analysis of wide type enzyme and mutant enzymes. (A) Thermal inactivation of wild type enzyme and mutant enzymes at different temperatures over 10 min (T5010); (B) Thermal inactivation half-life (t1/2) of wild type enzyme and mutant enzymes at 40 ℃. The error bars show standard deviation calculated for three replicate experiments.

按照 1.4所述的方法測定了野生酶與突變酶的半失活溫度 (T5010) 和半衰期 (t1/2)，結(jié)果如圖 3所示。由圖 3可知，突變酶 R131del(41.1 ℃) 和突變酶P132-E133del (39.4 ℃) 的T5010比野生酶 (38.5 ℃) 提高了 2.6 ℃和0.9 ℃，在 40 ℃下的t1/2分別為 15.0 min和10.0 min，為野生酶 (6.9 min) 的2.2倍和1.5倍；而突變酶 P132del (31.1 ℃)、突變酶 E133del(32.1 ℃)、突變酶 R131-P132del (34.9 ℃) 和突變酶 R131-P132del-E133del (36.6 ℃) 的T5010卻比野生酶降低了 7.4 ℃、6.4 ℃、3.6 ℃和1.9 ℃，在 40 ℃下的t1/2也比野生型減少了5.7、4.8、1.7和 0.8 min。由此表明，突變酶R131del較野生酶的熱穩(wěn)定性有了較大的提高；突變酶P132-E133del較野生酶的熱穩(wěn)定性稍有提升；然而突變酶P132del、E133del、R131-P132del和 R131-P132-E133del的熱穩(wěn)定性比野生酶有所降低。它們的熱穩(wěn)定性順序分別為：突變酶R131del>突變酶 P132-E133del>野生酶>突變酶R131-P132del-E133del>突變酶 R131-P132del>突變酶 E133del>突變酶 P132del。基于以上結(jié)果，選取突變酶R131del與突變酶P132-E133del進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.4　野生酶和突變酶最適溫度測定

按照1.5所述的方法測定了野生酶與突變酶的最適反應(yīng)溫度，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，野生酶、突變酶R131del和突變酶P132-E133del的最適反應(yīng)溫度均為 45 ℃。但是當(dāng)溫度超過45 ℃時(shí)，突變酶R131del和突變酶P132-E133del的相對活力顯著高于野生酶并且在 60 ℃時(shí)的相對活力仍保持在 50%以上，而野生型酶在60 ℃的相對活力僅有30%。

圖4　野生酶和突變酶的最適溫度Fig. 4 The optimum catalytic temperature analysis of wide type enzyme and mutant enzymes. The error bars show standard deviation calculated for three replicate experiments.

2.5　野生酶和突變酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

分別以 (R)-α-MBA和丙酮酸為底物，按照1.6所述的方法測定野生酶、突變酶R131del和突變酶 P132-E133del的米氏動(dòng)力學(xué)常數(shù)，采用Hyperbola函數(shù)進(jìn)行非線性擬合得到動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表 2。由表 2可知，野生酶對丙酮酸的催化效率 (kcat/Kmpyruvate) 為 2.22 L/(mmol·s)，突變酶R131del和P132-E133del的kcat/Kmpyruvate分別為野生酶的 1.05倍和 0.91倍；野生酶對 (R)-α-MBA的催化效率 (kcat/Kmα-MBA) 為 2.82 L/(mmol·s)，突變酶 R131del和 P132-E133del的kcat/Kmα-MBA分別為野生酶的0.97和1.39 倍。由此表明，突變酶 R131del和 P132-E133del熱穩(wěn)定性得到提高的同時(shí)，并未顯著降低酶的催化效率。

表2　野生酶和突變酶酶學(xué)參數(shù)比較Table 2 Kinetic analysis of wide type and mutant enzyme

2.6　野生酶和突變酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)模擬是一種利用計(jì)算機(jī)模擬蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中原子的物理運(yùn)動(dòng)的方法，通過模擬的計(jì)算機(jī)結(jié)果可以計(jì)算骨架原子的root mean square fluctuation (RMSF) 值，從而確定蛋白質(zhì)的熱敏感或構(gòu)象柔性區(qū)域[33]。RMSF值反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中單個(gè)氨基酸殘基的穩(wěn)定性，并且它與蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)[26]。將野生酶和突變酶在313 K和400 K溫度下分別進(jìn)行了時(shí)長為10 ns的動(dòng)力學(xué)模擬，獲得的RMSF 值如圖5所示。由圖5A和 5C可知，在 313K溫度下，野生酶、突變酶R131del和突變酶P132-E133del之間沒有明顯差異。

由圖 5B可知，在 400 K溫度下突變酶R131del所有氨基酸殘基的RMSF值均低于野生酶，這表明突變酶R131del在高溫下具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致它的熱穩(wěn)定性高于野生酶。由圖5D可知，在400 K溫度下突變酶P132-E133del在Loop區(qū)域的RMSF值與野生酶差異不顯著。

圖5　野生型酶和突變體酶的MD模擬Fig. 5 Molecular dynamics (MD) simulation analysis of wild-type and mutant enzymes for 10 ns at 313 K and 400 K using YASARA. (A) RMSF values for mutant enzyme R131del at 313 K during a 10 ns simulation. (B) RMSF values for mutant enzyme R131del at 400 K during a 10 ns simulation. (C) RMSF values for mutant enzyme P132-E133del at 313 K during a 10 ns simulation. (D) RMSF values for mutant enzyme P132-E133del at 400 K during a 10 ns simulation.

3　討論

目前，研究者已經(jīng)通過化學(xué)修飾、易錯(cuò)PCR、定點(diǎn)突變、蛋白質(zhì)融合、DNA改組等手段有效地提高了多種酶的熱穩(wěn)定性[34]。基于B-factor值確定影響酶熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸殘基，進(jìn)而利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對酶分子進(jìn)行理性改造可以有效地提高其熱穩(wěn)定性[26-29]。本文利用此方法成功篩選到了正突變酶 R131del和 P132-E133del。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變酶 (R131del) 和突變酶 (P132-E133del) 半失活溫度分別為 41.1 ℃和39.4 ℃，比野生酶提高了2.6 ℃和0.9 ℃，在40 ℃下的半衰期分別為15.0 min和10.0 min，分別是野生酶的2.2倍和1.5倍。采用YASARA軟件對野生酶和突變酶 (R131del、P132-E133del)進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。研究顯示，在400 K和10 ns的模擬條件下，突變酶 R131del的 RMSF值比野生型低，這表明突變酶 R131del不穩(wěn)定的Loop區(qū)域柔性降低，致使突變酶具有更高的熱穩(wěn)定性。通過在線服務(wù)器 (http://pic.mbu.iisc.ernet.in/)進(jìn)一步對野生酶和突變酶 (R 131 d e l、P132-E133del) 的 Loop區(qū)域進(jìn)行了分子間相互作用的模擬分析，探討突變酶穩(wěn)定性提高的機(jī)制，選取疏水相互 (距離設(shè)為5 ?) 和氫鍵選項(xiàng)，具體分析方法參照參考文獻(xiàn)[35]，模擬結(jié)果如圖6所示。由圖6A可知，野生酶的131位點(diǎn)是精氨酸，并不能與其他相鄰的殘基形成疏水相互作用，但當(dāng) 131位點(diǎn)精氨酸被刪除后，突變酶R131del的 131位點(diǎn)的脯氨酸 (Pro131) 與 134位點(diǎn)的異亮氨酸 (Ile134) 之間增加了疏水相互作用，且兩者的空間距離為 4.4 ?。Pace等[36]研究了疏水相互作用和氫鍵對22個(gè)分子量大小不同的蛋白質(zhì) (氨基酸殘基數(shù)量在36–534之間)穩(wěn)定性的影響，研究表明疏水相互作用對這 22個(gè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性平均貢獻(xiàn)為60%±4%；氫鍵對這 22個(gè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性平均貢獻(xiàn)為 40%±4%。因此，當(dāng) 131位點(diǎn)精氨酸被刪除后，突變酶R131del在Loop區(qū)域增加了相互疏水作用，從而使其穩(wěn)定性得到了提高。由圖6B可知，與野生型酶相比，突變酶P131-E133del (氨基酸數(shù)量為323個(gè)) 的Loop區(qū)域內(nèi)主要增加了4個(gè)的氫鍵。它們分別是天冬酰胺 (Asn135) 上的 OD1原子與側(cè)鏈的精氨酸 (Arg90) 上的N原子 (空間距離為1.9 ?) 和CB原子 (空間距離為3.6 ?)形成了 2個(gè)氫鍵；天冬酰胺 (Asn135) 的 ND2原子與精氨酸 (Arg122) 上的 N 原子 (空間距離分別為2.0 ?和3.6 ?) 形成了2個(gè)氫鍵。因此，Loop區(qū)域增加的分子間氫鍵使得突變酶P131-E133del的熱穩(wěn)定性得到了提高。

圖 6 突變酶 R131del (A) 和突變酶 P132-E133del(B) Loop區(qū)域的分子間相互作用模擬Fig. 6 Modeling analysis of intermolecular interactions in loop region of mutant enzymes R13del and P132-E133del. (A) In the mutant enzyme R131del, Ile 134 was involved in hydrophobic interaction with the neighbouring hydrophobic amino acid Pro131. (B) In the mutant enzyme P132-E133del, Asn135 was involved in four hydrogen bonds interaction with the neighbouring amino acids Arg90 and Arg122.

本文針對來源于A. terreus的 (R)-ω-TA熱穩(wěn)定性差的缺陷，基于“木桶理論”，對蛋白質(zhì)柔性區(qū)域的“短板”進(jìn)行剛性改造。通過刪除 Loop區(qū)域表面不穩(wěn)定氨基酸的方法，從構(gòu)建的 6個(gè)突變體中成功篩選到熱穩(wěn)定性提高的突變酶R131del和P132-E133del，并利用分子動(dòng)力學(xué)模擬和分子間相互作用的模擬，初步揭示了(R)-ω-TA熱穩(wěn)定性提高的機(jī)制，這為其他酶的熱穩(wěn)定性改造提供了方法學(xué)指導(dǎo)。

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