李重陽，張奎，申利，趙羽卒，潘光照，徐曼，蘇晶晶，崔紅娟

西南大學(xué) 家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716

整合素蛋白作為一種跨膜受體，不僅是細(xì)胞與外界環(huán)境之間聯(lián)系的紐帶，還參與了很多生理與病理反應(yīng)，其廣泛存在于細(xì)胞表面，與細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞周期的改變等過程息息相關(guān)[1]。該蛋白作用于細(xì)胞骨架來調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、變形，并在細(xì)胞凋亡、存活等過程扮演著重要角色[2]。目前已經(jīng)在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)18個α亞基和8個β亞基，它們以不同形式組成了至少24種整合素蛋白分子[3]。整合素單獨(dú)的α亞基或單獨(dú)的 β亞基均不能定位到細(xì)胞膜上，只有通過α和β兩個亞基相結(jié)合為異源二聚體才能發(fā)揮其功能[4]。α亞基胞外域的β螺旋結(jié)構(gòu)和β亞基的Hybrid結(jié)構(gòu)對這一過程起到了至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[5]。整合素的兩個亞基之間具有一定的特異性，只有特殊表面分子結(jié)構(gòu)的α亞基和β亞基才能形成二聚體，一般細(xì)胞中 β亞基是過量存在的，所以定位到細(xì)胞膜上的配體數(shù)量是由α亞基的數(shù)量決定的[6]。在昆蟲中，整合素最早是在果蠅中被鑒定的，隨后在果蠅中相繼發(fā)現(xiàn)了5種α亞基、3種β亞基，并證明其在果蠅的生長、發(fā)育及免疫中發(fā)揮了重要作用[7]。之后在其他昆蟲如煙草天蛾、大豆夜蛾、亞洲玉米螟等相繼發(fā)現(xiàn)整合素基因，并進(jìn)行了鑒定、克隆與研究分析。根據(jù)研究報道昆蟲體內(nèi)的整合素在血細(xì)胞對外源物的包囊反應(yīng)等免疫過程中起關(guān)鍵作用[8-9]。整合素蛋白可能參與到了細(xì)胞的免疫反應(yīng)中，研究整合素蛋白的功能將對家蠶疾病的防治起到一定的積極作用，并為人類血液疾病的治療提供參考。

家蠶既是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是具有研究價值的鱗翅目模式生物。2009年，有研究人員在家蠶中克隆出了BGIBMGA006878(β1)和BGIBMGA006002(β2)。到 2014年，在家蠶中整合素家族共鑒定出11種亞基，包括6個α亞基和 5個 β亞基，比其他無脊椎動物有更多的家族成員[10]。我們團(tuán)隊(duì)也參與了整合素家族的鑒定，并且對α亞基與β亞基怎樣結(jié)合發(fā)揮功能很感興趣，但是該難題一直未解決，而Bmintegrin β1蛋白區(qū)別于家族外的其他成員，在各組織均有表達(dá)，其可能發(fā)揮重要功能。在前人研究的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步探索整合素家族的具體功能，我們選取Bmintegrin β1作為研究對象。系統(tǒng)地克隆與分析了Bmintegrin β1的基因全長，通過原核表達(dá)、蛋白純化免疫小鼠等一系列技術(shù)獲得該蛋白鼠源的多克隆抗體，為進(jìn)一步研究該基因在家蠶血淋巴細(xì)胞的增殖分化、家蠶個體的生長發(fā)育中所扮演的角色及研究其參與的免疫反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1　實(shí)驗(yàn)昆蟲

家蠶 (品種P50) 來自西南大學(xué)[11-12]。家蠶在27 ℃、相對濕度80%左右的恒溫培養(yǎng)箱中催青并飼養(yǎng)[13]。

1.1.2　實(shí)驗(yàn)主要試劑

本實(shí)驗(yàn)所使用的Rosetta表達(dá)菌株P(guān)ET-32、PET-28、PET22-b表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。提取 RNA的試劑盒購自 Omega公司；提取質(zhì)粒的試劑盒購自 Qiagen公司；膠回收試劑盒由Axygen公司提供；RACE試劑盒由 Invitrogen公司提供；HiFi酶、限制性內(nèi)切酶、載體PMD19-T、DNA marker、SolutionⅠ連接酶購自TaKaRa公司；多聚甲醛購買于上海生工生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑是Promega公司產(chǎn)品；抗熒光淬滅劑和 DAPI為碧云天公司產(chǎn)品；引物由北京華大基因科技股份有限公司合成。

1.2　方法

1.2.1　蠶體RNA的提取及cDNA的合成

從家蠶四齡4 d起一直到其上簇，在各時期各取6頭家蠶500 μL血液，離心去上清，加適量Trizol于–80 ℃裂解[11]。在家蠶五齡3 d時，取家蠶各組織 (頭、皮、中腸、血液、馬氏管、絲腺、精巢、卵巢、脂肪體)，快速放入液氮冷凍研磨后加 Trizol進(jìn)行裂解。之后使用苯酚與氯仿進(jìn)行總RNA的抽提[11]，根據(jù)說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA模板。

1.2.2　RACE法擴(kuò)增Bmintegrinβ1的全長序列

在NCBI上下載晚期智人、果蠅、煙夜蛾以及其他昆蟲的integrin β1的mRNA序列。根據(jù)Blast比對，在SilkDB (http://www.silkdb.org/silkdb/) 網(wǎng)站上下載預(yù)測的Bmintegrin β1的mRNA序列[11]。參考預(yù)測序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物Bmintegrin β1-F、Bmintegrin β1-R(見表 1)，以五齡 3 d家蠶血液cDNA為模板擴(kuò)增其部分中間序列，經(jīng)測序得到已知片段，據(jù)此設(shè)計(jì)RACE特異引物GSP1、GSP2、NGSP1、NGSP2 (表 1) 對Bmintegrin β1的 3′和5′端進(jìn)行擴(kuò)增。測序成功后，將已知序列進(jìn)行拼接，獲得完整的Bmintegrin β1的cDNA序列。

1.2.3　Bmintegrin β1蛋白序列分析

根據(jù)獲得的全長序列，使用在線預(yù)測網(wǎng)站ORF Finder預(yù)測出該基因的開放閱讀框[11]。同樣運(yùn)用在線SignalP 4.1 Server[14]、TMHMM Serverv.2.0網(wǎng)站對其信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測，使用SMART、ExPasy等對該蛋白的分子量、等電點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)等信息進(jìn)行預(yù)測[14-15]。

1.2.4　Bmintegrin β1蛋白進(jìn)化分析

根據(jù)ORF在線預(yù)測得到Bmintegrin β1編碼的蛋白，在 NCBI中進(jìn)行蛋白序列比對后下載了煙夜蛾、臍橙螟、亞洲玉米螟、甜菜夜蛾、果蠅等24個物種的同源序列。通過Clustalx軟件對蛋白序列進(jìn)行比對，將比對結(jié)果導(dǎo)入MEGA 6.0軟件，通過該軟件使用NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹[16]。

1.2.5　Bmintegrin β1 表達(dá)譜分析

以反轉(zhuǎn)錄得到的家蠶各組織與各時期的血液cDNA為模板，以肌動蛋白3 (BmActin3) 為內(nèi)參對Bmintegrin β1進(jìn)行半定量PCR檢測[12]。通過瓊脂糖凝膠電泳分析，得到轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)譜[17-18]。使用獲得的抗體，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)獲得其蛋白水平的表達(dá)譜。

1.2.6　Bmintegrin β1 原核表達(dá)

參考蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果，選取家蠶Bmintegrinβ1蛋白 32aa–780aa這段整合素結(jié)構(gòu)域保守序列，使用 Primer5.0設(shè)計(jì)特異引物Bmintegrin β1-YH-F、Bmintegrin β1-YH-R，并在引物兩端分別加上BamHⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基 (引物序列見表1)。通過PCR擴(kuò)增及測序驗(yàn)證后，將特異片段分別連接到原核表達(dá)載體 pET-32(a)、pET-28(a)上，然后導(dǎo)入Rosseta感受態(tài)，細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證[11,19]。成功后分別將陽性克隆在試管中小規(guī)模放大，放大后各取50 μL菌液接種到3只裝有30 mL含抗生素的LB培養(yǎng)基的試管中(試管編號分別為A、B、C、A1、B1、C1)，通過測量OD值將細(xì)菌培養(yǎng)到對數(shù)生長期，之后向其中4只試管 (A、B、A1、B1) 加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，其中兩只試管 (C、C1) 不加誘導(dǎo)劑處理作為陰性對照。將 (A、A1、C、C1) 在37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)7 h，將 (B、B1) 在16 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)22 h。分別收集實(shí)驗(yàn)組和對照組菌液用冷凍高壓儀進(jìn)行高壓沖擊破碎，4 ℃離心后收集上清液與沉淀，通過SDS-PAGE后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色觀察，選出表達(dá)效率最高的原核表達(dá)載體以及表達(dá)的最適溫度。之后用同樣的方法進(jìn)行IPTG最適濃度的篩選，最后將最適表達(dá)載體菌株調(diào)至最適IPTG濃度，在最適溫度下大規(guī)模誘導(dǎo)。

1.2.7　Bmintegrin β1 蛋白純化

細(xì)菌進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)后，離心收集菌體并將其溶于50 mmol/L Tris-HCl中，同時加入溶菌酶0.2 mg/mL和MgCl21 g/L。使用冷凍高壓破碎儀將菌液反復(fù)高壓破碎 4次。收集上清與沉淀。進(jìn)行SDS-PAGE檢測[19]。結(jié)果目的蛋白在包涵體中，使用洗滌劑將包涵體進(jìn)行洗滌。最后將包涵體溶解于pH值為12.0的8 mol/L尿素、25 mmol/L Tris-HCl、0.3 mol/L NaCl混合液中，攪拌過夜，次日離心，吸取上清進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果顯示上清液中含有目的蛋白。將上清液進(jìn)行過濾除雜后壓入裝有 Ni+親和層析的填料中，由于目的蛋白上掛有 His組氨酸的標(biāo)簽，該標(biāo)簽可以和Ni+相互吸附，再根據(jù)咪唑具有與 His標(biāo)簽相似的結(jié)構(gòu)可以競爭將目的蛋白洗脫下來的原理，我們用不同濃度的咪唑洗脫層析柱，分別收取洗脫液并進(jìn)行凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，挑選單一并且大小合適的條帶進(jìn)行透析、脫鹽、濃縮。之后根據(jù)His標(biāo)簽做免疫印跡，檢測該條帶是否為重組的目的蛋白。驗(yàn)證成功后，加30%甘油冷凍保存。

1.2.8　Bmintegrin β1多克隆抗體制備

將純化的蛋白分 5次注入 8周左右的昆明鼠體內(nèi)，5次注射所用蛋白量依次上升，分別為每只 50、60、70、90、120 μg，每次注射前先測定蛋白濃度，根據(jù)濃度計(jì)算出每次要注射的體積[11]。并且第一次與同體積比的費(fèi)式完全佐劑混合后注射，后三次與同體積比的費(fèi)式不完全佐劑混合后注射，最后一次不加佐劑進(jìn)行注射[11]。最后一次注射3–5 d后取血，取血后先室溫靜置 4 h，然后 1100、4000、8000、13500 r/min各 33 min，進(jìn)行梯度離心收集上清液，最后將收集的上清液加入 30%左右的甘油進(jìn)行分裝并于–80 ℃保存。

1.2.9　Bmintegrin β1多克隆抗體效價檢測

根據(jù)ELISA說明書要求，分別進(jìn)行特異性抗原的包被，封閉，加含抗體目的血清、加無抗體陰性血清，添加酶標(biāo)抗體，顯色，終止反應(yīng)，用分光光度計(jì)測定儀各孔OD值，計(jì)算后得出抗體效價。

1.2.10　利用免疫印跡方法檢測 Bmintegrin β1蛋白抗血清特異性

首先制備一塊12% SDS-PAGE膠，以得到的重組蛋白作為上樣樣品，經(jīng)跑膠后轉(zhuǎn)膜，再用 BSA 室溫封閉 3 h，4 ℃孵育一抗 (即Bmintegrin β1抗血清和陰性對照血清) 過夜，TBST洗滌后二抗孵育，最后加化學(xué)反應(yīng)液曝光分析[20]。

表1　引物序列Table 1 Primer seuences

2　結(jié)果

2.1　家蠶Bmintegrin β1全長克隆與分析

以提取的五齡3 d家蠶血液cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Bmintegrin β1-F、R引物擴(kuò)增獲得了一個2300 bp左右的片段 (圖1A)。利用 RACE技術(shù)根據(jù)特異引物 GSP1、NGSP1、GSP2、NGSP2 (參照表 1) 擴(kuò)增 3′、5′端 cDNA序列。經(jīng)RACE擴(kuò)增得到了Bmintegrin β1的全長[21]。Bmintegrin β1共有 3 個剪切體，其 mRNA全長分別為3647、3606、3785 bp。三種剪切體具有共同的開放閱讀框，其長為2502 bp，共編碼833個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為91.14 kDa，等電點(diǎn)為 5.507。位于 10號染色體且與基因組序列比對顯示該基因組全長14.61 kb，包括18個外顯子和17個內(nèi)含子。

圖1　家蠶Bmintegrin β1全長序列分析Fig. 1 The complete sequence analysis of Bmintegrin β1 in silkworm, Bombyx mori. (A) 1% Agar gel analysis of the Bmintegrin β1 PCR product. M: marker; 1: PCR product of partial fragment; 2: 5′ RACE product; 3: 3′ RACE product. (B) Total length of CDs. (C) The three kinds of shear of mRNA. (D) Chromosome location analysis.

2.2　Bmintegrin β1蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過在線工具SignalP對其信號肽進(jìn)行分析預(yù)測，該蛋白在 1–32區(qū)域?yàn)?1個信號肽區(qū)域(圖2B)[21]。根據(jù)TMHMM Server v.2.0對Bmintegrinβ1表達(dá)蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行了在線預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其含有一個跨膜區(qū)域且其位置為 764–786 aa，并且1–763 aa在細(xì)胞膜外，只有787–833 aa在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，并且含有4個糖基化位點(diǎn)、6個結(jié)構(gòu)域。

2.3　Bmintegrin β1同源進(jìn)化分析

使用Clustalx軟件對24種與Bmintegrin β1具有同源序列的物種進(jìn)行聚類分析，根據(jù)MEGA6.0中的NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。通過進(jìn)化樹分析，我們發(fā)現(xiàn)家蠶Bmintegrin β1與同鱗翅目的煙夜蛾和黑脈金斑蝶的整合素基因相似性最高。

2.4　Bmintegrin β1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物Bmintegrin β1-YH-F (BamHⅠ)、Bmintegrin β1-YH-R (NotⅠ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測序驗(yàn)證后，將該片段分別連接到 pET-28a(+)、pET-32a(+) 載體上。將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞Trans1T1后，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并使用BamHⅠ與NotⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，分別獲得2532 bp和5300 bp左右的條帶。證明成功獲得重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-28a(+)-Bmintegrin β1、pET-32a(+)-Bmintegrin β1。將表達(dá)質(zhì)粒分別導(dǎo)入Rosseta表達(dá)菌株中，加入帶有抗性的LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，成功獲得表達(dá)菌株[23]。

2.5　Bmintegrin β1原核誘導(dǎo)表達(dá)及誘導(dǎo)條件優(yōu)化

將以上得到的兩株表達(dá)菌種 pET-28a(+)-Bmintegrin β1、pET-32a(+)-Bmintegrin β1分別編號為A與B，并分別接種于3只裝有抗性的LB培養(yǎng)基中，命名為A1、A2、A3和B1、B2、B3。按照材料與方法中的操作進(jìn)行培養(yǎng)之后提取總蛋白進(jìn)行凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色觀察到pET-28a(+)-Bmintegrin β1菌株在 37 ℃條件下包涵體中的誘導(dǎo)表達(dá)量最高 (圖3A)。之后我們又根據(jù) pET-28a(+)-Bmintegrin β1菌株設(shè)計(jì)了不同的IPTG誘導(dǎo)濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株在 0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度下表達(dá)量最高 (圖 3B)。得出最優(yōu)的誘導(dǎo)表達(dá)條件后，我們將 pET-28a(+)-Bmintegrin β1菌株在 0.8 mmol/L IPTG、37 ℃的條件下擴(kuò)大培養(yǎng)與誘導(dǎo)。

圖2　家蠶Bmintegrin β1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析Fig. 2 Prediction and analysis of the Bmintegrin β1 protein’s structure. (A) The prediction of the Bmintegrin β1 protein signal peptide. (B) The prediction of Bmintegrin β1 transmembrane helices protein. (C) The prediction of the Bmintegrin β1 protein’s position of Hydroxylation. (D) The prediction of the Bmintegrin β1 protein domain.

圖3　Bmintegrin β1蛋白進(jìn)化分析Fig. 3 The phylogenetic tree of the Bmintegrin β1 family.

2.6　Bmintegrin β1蛋白純化以及抗血清的制備以及Western blotting驗(yàn)證

經(jīng)過以上大規(guī)模培養(yǎng)與誘導(dǎo)、離心菌液、冷凍高壓破碎細(xì)菌、離心、洗滌、上柱等一系列處理后，通過 Ni+柱親和層析法初步純化蛋白，再經(jīng)脫鹽柱洗脫與透析液透析得到純度>99%的 Bmintegrin β1重組蛋白 (圖 4C)。再通過Western blotting方法，使用His標(biāo)簽抗體與純化出的蛋白進(jìn)行孵育，成功確定純化出的蛋白為我們需要的重組蛋白 (圖4D)。之后用純化的家蠶 Bmintegrin β1重組蛋白免疫昆明鼠，2個月后取血，獲得鼠源抗血清。用純化出的重組蛋白作為上樣樣品，進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示在85 kDa左右有單一的條帶 (圖4E)，以上結(jié)果表明我們自制的抗體能夠特異性識別Bmintegrin β1 蛋白[13]。

2.7　Bmintegrin β1在家蠶各組織以及血液不同時期的表達(dá)譜

為了查看該基因在家蠶不同組織以及血細(xì)胞不同時期中是否有表達(dá)差異，我們在五齡3 d時收集了家蠶各組織，在四齡3 d到熟蠶各時期收集家蠶血液，制備cDNA模板，以肌動蛋白3 (BmActin3)為內(nèi)參對Bmintegrin β1進(jìn)行半定量PCR檢測[24]。半定量結(jié)果顯示Bmintegrin β1在以下各組織中均有較高表達(dá)，尤其在血液中表達(dá)量最高，其次是頭與表皮 (圖5A)。并且Bmintegrin β1在四齡3 d到熟蠶時期持續(xù)性高表達(dá) (圖5B)。隨后我們使用制備的抗體通過Western blotting實(shí)驗(yàn)獲得了家蠶各組織的蛋白表達(dá)譜，如圖5C所示，其結(jié)果與半定量結(jié)果基本相似。

圖5　各組織與各時期Bmintegrin β1表達(dá)譜Fig. 5 Tissue and stage expression profile of Bmintegrin β1. (A) The expression of Bmintegrin β1 mRNA in the different tissues of the 3rd day of the 5th larvae. (B) The expression of Bmintegrin β1 mRNA in hemocytes from the molting period of the 4th larvae to the 2st day of spinning. L4D3: day 3 of the fourth instar larval; L4M: molting stage of the fourth instar larval; L5M: molting stage of the fifth instar larval; W: wandering stage; PP1: day 1 of prepup; PP2: day 2 of prepup. (C) The expression of Bmintegrin β1 protein in the different tissues of the 3rd day of the 5 th larvae.

2.8　Bmintegrin β1抗血清效價的評定

使用間接ELISA法對我們制備的抗血清進(jìn)行檢測并進(jìn)行效價評定。簡略步驟如下：1) 抗原的包被；2) 洗滌酶標(biāo)板；3) 用5%BSA進(jìn)行封閉處理；4) 孵育一抗4 ℃過夜；5) 孵育二抗室溫2 h；6) 顯色曝光處理；7) 抗體效價的計(jì)算。經(jīng)過以上實(shí)驗(yàn)步驟我們計(jì)算出制備的抗血清效價高達(dá)1542300。

3　討論

整合素是由α、β兩個亞基組成的一類跨膜異二聚體蛋白，在生物體的生理和病理等諸多生命過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[5]。在哺乳動物中，整合素在免疫反應(yīng)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞的遷移等許多反應(yīng)過程發(fā)揮著關(guān)鍵作用[25-31]。除此之外，整合素也與炎癥反應(yīng)、血栓的形成、動脈硬化、免疫功能障礙以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及侵襲密切相關(guān)[32-33]?？傊纤夭粌H在生物體中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，還是腫瘤治療的一個潛在的重要靶標(biāo)。

在家蠶中，整合素的研究雖有一定的進(jìn)展，但是仍然停留在較低的水平上。在前人研究的基礎(chǔ)上，我們應(yīng)用PCR及RACE技術(shù)系統(tǒng)克隆及分析了Bmintegrin β1全長。該基因共有3種具有相同開放閱讀框的剪切體。我們根據(jù)其蛋白序列利用NJ法進(jìn)行了進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)其與同鱗翅目的煙夜蛾和黑脈金斑蝶進(jìn)化關(guān)系最為接近，探究該基因的功能也將為以鱗翅目為主的病蟲害防治提供一定的參考價值。隨后，我們進(jìn)行了蛋白序列分析，預(yù)測到其有 4個羥基化位點(diǎn)和 5個保守的整合素家族結(jié)構(gòu)域，也驗(yàn)證了該蛋白為保守的整合素 β家族成員。通過軟件預(yù)測到該蛋白含有信號肽，預(yù)示著其為一個跨膜蛋白，根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)整合素中單獨(dú)的 α亞基或β亞基均不能直接定位到細(xì)胞膜上來發(fā)揮作用[34]。為了進(jìn)一步分析其功能，我們構(gòu)建了原核表達(dá)載體，通過對原核表達(dá)條件的優(yōu)化，成功獲得了高度純化的蛋白[35]。重組后的蛋白比我們預(yù)測的蛋白偏大，我們猜測可能因?yàn)镠is-tag帶有較強(qiáng)的正電荷，降低了蛋白在SDS-PAGE中的泳動速率，導(dǎo)致了表觀分子量的變大。經(jīng)過His標(biāo)簽驗(yàn)證我們確認(rèn)得到了家蠶整合素β1的重組蛋白，經(jīng)文獻(xiàn)報道其可能參與了昆蟲的免疫反應(yīng)，之后我們也將設(shè)計(jì)細(xì)菌凝集、細(xì)菌吞噬等免疫相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該蛋白在免疫方面的功能。隨后我們用該純化得到的重組蛋白對小鼠進(jìn)行免疫注射，成功獲得了該蛋白的多克隆抗體，為進(jìn)一步揭示該蛋白的功能提供了有效的抗體工具。我們也將通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)，使用獲得的多克隆抗體，查看該蛋白的細(xì)胞定位。通過半定量PCR及Western blotting分析均顯示該基因持續(xù)在血細(xì)胞中高量表達(dá)，同樣預(yù)示其可能在昆蟲的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[36]，之后我們也將進(jìn)一步在家蠶血液、中腸、脂肪體等免疫組織中進(jìn)行免疫應(yīng)答反應(yīng)的研究。研究整合素蛋白的功能將對家蠶疾病的防治起到一定的積極作用，并對人類血液疾病的治療提供參考。

4　結(jié)論

從家蠶中克隆得到整合素家族 β1基因全長，該基因共有3個剪切體，長度分別為3647、3606、3785 bp，從進(jìn)化樹來看，家蠶Bmintegrin β1與同鱗翅目的煙夜蛾和黑脈金斑蝶同源關(guān)系最高。該基因在家蠶各組織中都有較高表達(dá)，尤其在血液各時期中持續(xù)高表達(dá)。我們利用大腸桿菌構(gòu)建了原核表達(dá)載體，成功表達(dá)并純化出Bmintegrin β1蛋白。我們用該蛋白免疫小鼠成功獲得了該重組蛋白的特異抗體。這為進(jìn)一步研究家蠶Bmintegrin β1以及整合素家族功能奠定了基礎(chǔ)。

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