馬怡茗，柯欣，李曉霞，舒?zhèn)W(xué)，楊文翰，劉亞勇，顏霞，賈良輝，顏華

1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

2 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

角蛋白是一類在自然界中廣泛存在的不可溶蛋白，是表皮、羽毛、羊毛、魚鱗、頭發(fā)、蹄以及指甲的主要組成部分。由于它緊密交聯(lián)的氫鍵、疏水作用以及二硫鍵的存在，角蛋白相當(dāng)穩(wěn)定且難降解，也不易被大部分商品化的蛋白酶如木瓜蛋白酶、膠原酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解[1-3]。以禽類加工中產(chǎn)生的廢棄物羽毛 (90%為角蛋白，富含絲氨酸、脯氨酸、賴氨酸、色氨酸、胱氨酸) 為例，全世界每年產(chǎn)生約8000000 t羽毛廢棄物，這些羽毛廢棄物常常被掩埋或焚燒，導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，其資源化利用益發(fā)顯得重要。

角蛋白酶 (Keratinase) 是一大類可以降解羽毛等不可溶底物和多種蛋白的蛋白水解酶，主要是絲氨酸蛋白酶或者金屬蛋白酶類。由于可以特異性分解角蛋白，所以在飼料工業(yè)、食品工業(yè)、皮革加工、洗滌劑行業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)及環(huán)境治理等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[4-6]，越來越引起研究者的關(guān)注。目前在細(xì)菌、真菌和放線菌[7]中均已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了可以產(chǎn)生角蛋白酶從而降解角蛋白的菌株，其中又以芽胞桿菌屬的細(xì)菌居多。放線菌可以產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，同時，放線菌的生活史有基質(zhì)菌絲和氣生菌絲階段，這樣的特點非常有助于侵入羽毛等硬質(zhì)角蛋白，從而有助于角蛋白的完全降解，所以角蛋白降解放線菌及其角蛋白酶的研究得到了關(guān)注。

我們從家禽養(yǎng)殖場的羽毛堆積廢棄物中分離到1株能高效快速降解羽毛的放線菌Fea-10，經(jīng) 16S rDNA測序初步鑒定為微白黃鏈霉菌Streptomyces albidoflavus。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)Verneuil等曾報道微白黃鏈霉菌 K1-02具有很強(qiáng)的角蛋白酶活性，他們純化得到了角蛋白酶SAKase，并對其N端的31個氨基酸進(jìn)行了測序[8]，但該蛋白的完整編碼基因一直未見報道。我們對Fea-10進(jìn)行全基因組測序，利用BioEdit軟件進(jìn)行本地搜索，發(fā)現(xiàn)了極可能編碼角蛋白酶的基因gm2886，擬通過異源表達(dá)鑒定其表達(dá)產(chǎn)物并對表達(dá)出的蛋白進(jìn)行功能研究。

以往角蛋白酶基因的異源表達(dá)研究中應(yīng)用較多的表達(dá)宿主有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和畢赤酵母，鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)則較少有人關(guān)注。鏈霉菌 GC含量高達(dá) 70%以上，革蘭氏染色陽性，與革蘭氏陰性的大腸桿菌顯著不同。因此，鏈霉菌來源的基因更易于在鏈霉菌宿主中表達(dá)。此外，鏈霉菌有著豐富的外分泌系統(tǒng)，外源基因分泌性表達(dá)，可以簡化表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化過程。因此我們克隆了gm2886，構(gòu)建了鏈霉菌表達(dá)載體，實現(xiàn)了gm2886的表達(dá)純化，得到重組蛋白 GM2886-His6，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1　材料

1.1　菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基和抗生素

菌株：微白黃鏈霉菌Streptomyces albidoflavusFea-10、密旋鏈霉菌Streptomyces pactumACT12、大腸桿菌Escherichia coliTop10和大腸桿菌Escherichia coliS17-1 (均由本實驗室保藏)。質(zhì)粒：pMD18-T (TaKaRa公司)、pET28a、pIJ8641(含有紅霉素抗性基因啟動子PermE)、pSET152(本實驗室保存)。培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、改良2CMY培養(yǎng)基、2%脫脂牛奶培養(yǎng)基和TSBY培養(yǎng)基。抗生素：Ampicillin (終濃度 100 μg/mL)，Kanamycin (終濃度 50 μg/mL)，Apramycin (在LB培養(yǎng)基中終濃度為50 μg/mL，在高氏1號及改良2CMY終濃度為10 μg/mL)，萘啶酮酸 (終濃度為 25 μg/mL)。

1.2　工具酶和引物

工具酶：本實驗使用的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶以及Taq酶均購自TaKaRa公司，Pfu高保真酶購自Thermo公司；PCR引物的合成與測序均在生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。

2　方法

2.1　DNA操作

常規(guī)的分子生物學(xué)操作參照《分子克隆指南》[9]，鏈霉菌基因組的提取參照《鏈霉菌操作手冊》[10]。

2.2　角蛋白酶基因的獲取及序列分析

根據(jù)文獻(xiàn)，結(jié)合微白黃鏈霉菌Fea-10的全基因組，利用軟件BioEdit進(jìn)行l(wèi)ocal blast；序列比對在NCBI上進(jìn)行，信號肽在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/網(wǎng)站上進(jìn)行預(yù)測，蛋白大小及等電點在 http://web.expasy.org/compute_pi/網(wǎng)站上進(jìn)行分析。

2.3　gm2866基因的克隆以及鏈霉菌表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計引物F1 (帶有EcoRⅠ，序列見表1，下同) 和 R1 (帶有XhoⅠ)，以微白黃鏈霉菌Streptomyces albidoflavusFea-10基因組DNA為模版，使用Pfu酶PCR擴(kuò)增獲得gm2886的完整基因，使用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后連入pET28a構(gòu)建載體 pET28a-gm2886(提供 His Tag)，測序驗證。使用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pIJ8641獲得PermE即片段1。使用引物F2 (帶有BamHⅠ和RBS) 和R2 (帶有XbaⅠ和His Tag)，以pET28a-gm2886為模板，PCR擴(kuò)增，BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切 PCR產(chǎn)物獲得片段 2。pSET152用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切回收后，和片段1、2共孵育連接，獲得帶有His6融合標(biāo)簽的鏈霉菌組成型表達(dá)載體pSET152::Perm::gm2886，測序驗證。

表1　引物序列Table 1 Primer sequence

2.4　角蛋白酶的表達(dá)和純化

將測序正確的 pSET152::Perm::gm2886轉(zhuǎn)入大腸桿菌 S17-1，通過大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移的方法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入密旋鏈霉菌ACT12，篩選陽性接合子。接合子在 TSBY培養(yǎng)基發(fā)酵 96 h，離心除去菌體，將發(fā)酵液使用50%的硫酸銨4 ℃沉淀過夜，4 ℃、10000 r/min離心20 min收集沉淀，沉淀溶解于20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.9)，0.45 μm的濾膜過濾后，使用Ni柱進(jìn)行純化。純化后的蛋白使用Nanodrop進(jìn)行濃度測定，并4 ℃透析過夜。

2.5　酶活測定方法

使用酪蛋白 (Sigma公司) 進(jìn)行重組角蛋白酶酶活的測定，參照Li等[11]和Liu等[12]的方法，并進(jìn)行了改進(jìn)。將蛋白樣品使用 20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.9) 稀釋至終濃度 0.012 mg/mL后取1 mL，40 ℃水浴預(yù)熱2 min，加入1 mL同樣預(yù)熱過的 2%酪蛋白溶液，精確反應(yīng) 10 min后立刻加入2 mL 0.4 mol/L TCA終止反應(yīng)，并繼續(xù)在40 ℃保溫20 min，待殘余蛋白沉淀完全后離心取上清。上清液使用0.22 μm的濾膜過濾后取1 mL，加入5 mL 0.4 mol/L碳酸鈉以及適當(dāng)濃度 (0.5 mL) 的福林試劑，搖勻，40 ℃保溫發(fā)色20 min，測定OD660。定義每釋放出1 μg酪氨酸，酶活升高1個單位。

2.6　溫度和pH對酶活影響的測定

以酪蛋白為底物，反應(yīng)溫度為30?80 ℃分別測定重組蛋白的酶活，測得重組蛋白的最適反應(yīng)溫度；重組蛋白的溫度穩(wěn)定性分析則通過在最適pH下，30?80 ℃度不同溫度處理30 min后，測定酶活；酶最適pH通過測定最適溫度下在pH 4.0?12.0的不同緩沖液中的酶活(pH 3.0?6.0，50 mmol/L磷酸二氫鈉-檸檬酸鈉緩沖液；pH 7.0?8.0，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液；pH 9.0?12.0，50 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)。每種反應(yīng)均進(jìn)行3次重復(fù)取平均值。

2.7　金屬離子和化學(xué)試劑對酶活影響測定

以酪蛋白為底物，測定金屬離子和化學(xué)試劑對純化的重組蛋白 GM2886-His6酶活的影響。分別在4 mL的反應(yīng)體系中加入5 mmol不同的金屬離子 (Ca2+、Mg2+、K+) 或者不同的化學(xué)試劑 (5 mmol EDTA、5 mmol PMSF、1%DMSO、1% SDS、1%異丙醇、1% DTT以及1%β-巰基乙醇)，按上述酪蛋白作為底物的試驗方法進(jìn)行酶活測定。以未加入任何金屬離子和化學(xué)試劑時測定的酶活作為對照。每種反應(yīng)測定3次重復(fù)，取平均值。

2.8　不同底物對酶活影響的測定

分別以可溶的酪蛋白 (Casein)、偶氮酪蛋白 (Azo-casein)、牛血清白蛋白 (BSA)、血紅蛋白 (Hemoglobin) 和不可溶的天青角蛋白(Azure keratin)、羽毛粉 (Feather) 為底物測定重組蛋白對不同底物的酶活[13-15]?？扇苄缘孜锸紫扔?0 mmol/L Tris-HCl (pH 7.9) 配置成2%的溶液?？扇苄缘孜餃y定酶活的反應(yīng)總體系為2 mL，體系中含有 100 μL純化的重組蛋白(0.12 mg/mL)，1 mL 2%可溶底物溶液，900 μL pH 10.0的50 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，50 ℃反應(yīng)20 min，加入2 mL 0.4 mol/L TCA終止反應(yīng)，繼續(xù)置于40 ℃水浴鍋保溫20 min。離心取上清 1 mL，加入 1 mL 3%茚三酮溶液和1 mL醋酸緩沖液 (pH 4.5)，搖勻，置于100 ℃水浴鍋10 min，加入3 mL的60%乙醇，搖勻測定OD570。定義每釋放出1 μg酪氨酸，酶活升高1個單位。其中偶氮酪蛋白在加入TCA后直接測定上清的OD440。定義OD每升高0.01，酶活增加1個單位。不可溶底物酶活測定的反應(yīng)總體系為4 mL，其中含有 200 μL純化的 GM2886-His6(0.12 mg/mL)，20 mg不可溶底物，10 mmol/L DTT，補50 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液至總體積為4 mL。37 ℃、180 r/min振搖1 h，天青角蛋白直接測定OD595，羽毛測定OD280。定義OD每升高0.01，酶活增加1個單位。

3　結(jié)果與分析

3.1　gm2886編碼多肽的氨基酸序列分析及與已知鏈霉菌角蛋白酶同源性比較

利用BioEdit軟件在Fea-10基因組內(nèi)進(jìn)行本地搜索，遴選可能的角蛋白酶基因，得到候選基因gm2886。gm2886基因全長1083 bp，GC含量較高，達(dá)71%。編碼360個氨基酸的多肽，其中包括34個氨基酸的信號肽，138個氨基酸的N-末端前肽以及一個188個氨基酸的成熟蛋白酶結(jié)構(gòu)域。其成熟酶序列與NCBI上已知的角蛋白酶成熟酶序列同源性對比結(jié)果如圖1所示。它和灰色鏈霉菌外泌角蛋白酶 SGPD[16]的序列相似度最高，為83%。

3.2　gm2886在密旋鏈霉菌 ACT12中的表達(dá)、純化

重組質(zhì)粒 pSET152::Perm::gm2886轉(zhuǎn)化S17-1并通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)入密旋鏈霉菌 ACT12后，使用阿普霉素篩選出陽性接合子，并用2%脫脂牛奶平板對接合子進(jìn)行復(fù)篩，以野生型密旋鏈霉菌ACT12作為對照，出現(xiàn)降解圈即為有蛋白水解活性。結(jié)果如圖2所示。

挑取陽性接合子，使用 TSBY培養(yǎng)基發(fā)酵96 h后，離心取發(fā)酵液上清加入等體積的飽和硫酸銨溶液至 50%，4 ℃過夜，10000 r/min、4 ℃離心收集沉淀，將其溶解于20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.9) 即為粗蛋白液。粗蛋白液過濾后使用鎳柱親和純化。如圖 3所示，發(fā)酵液上清中可以純化到一個大小約為36 kDa的蛋白，說明該蛋白是外泌表達(dá)蛋白。

圖1　GM2886與幾種已知的鏈霉菌來源角蛋白酶的成熟酶序列同源性分析Fig. 1 Sequence alignment of mature protein sequence of GM2886 and several other known keratinases.

圖 2 密旋鏈霉菌 ACT12/pSET152::Perm::gm2886牛奶平板復(fù)篩Fig. 2 Secondary screening of Streptomyces pactum ACT12/pSET152::Perm::gm2886 using milk-agar plate.1: wild type ACT12; 2: ACT12/pSET152::Perm::gm2886.

使用酪蛋白為底物進(jìn)行非變性蛋白電泳，在重組蛋白對應(yīng)位置可以出現(xiàn)透明條帶 (圖4)，表明該純化到的蛋白具有蛋白水解活性。

3.3　重組蛋白GM2886-His6的產(chǎn)量與酶活

對純化到的重組蛋白產(chǎn)量進(jìn)行測定，得到重組蛋白 GM2886-His6在密旋鏈霉菌 ACT12中的異源表達(dá)產(chǎn)量為 1.108 mg/L。以酪蛋白為底物測得重組蛋白的最大酶活為5.36 kU/mg。

圖3　純化到的重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of purified GM2886-His6.1: premixed protein marker; 2: purified GM2886-His6.

圖4　以酪蛋白為底物的非變性蛋白電泳分析Fig. 4 Zymogram analysis of proteases excreted by S. pactum ACT12/pSET152::Perm::gm2886. (A)GM2886-His6 stained with Coomassie G-250. (B)GM2886-His6 with casein.

3.4　重組蛋白GM2886-His6最適pH、最適溫度及溫度穩(wěn)定性分析

以酪蛋白為底物分別測定重組蛋白在不同反應(yīng)溫度下的酶活，結(jié)果如圖 5所示，在30?70 ℃均有酶活，且在50 ℃時酶活最高，所以 50 ℃是重組蛋白 GM2886-His6的最適反應(yīng)溫度。分別以酪蛋白為底物測定重組蛋白在不同pH下的酶活，結(jié)果如圖6所示，在pH 4.0?11.0時均有酶活，在 pH 10.0時酶活最大，所以pH 10.0為重組蛋白GM2886-His6的最適pH。將重組蛋白分別在30?80 ℃下保溫30 min后測定以酪蛋白為底物時的酶活，結(jié)果如圖 7，在30?40 ℃處理下仍有酶活。

圖5　反應(yīng)溫度對重組角蛋白酶酶活的影響Fig. 5 Effect of temperature on recombinant keratinases.

圖6　pH對重組角蛋白酶酶活的影響Fig. 6 Effect of pH on recombinant keratinases.

圖7　重組角蛋白酶的溫度穩(wěn)定性Fig. 7 Temperature stability of recombinant keratinases.

3.5　金屬離子和化學(xué)試劑對重組蛋白GM2886-His6酶活影響分析

Ca2+、K+和 Mg2+對重組蛋白酶活具有抑制作用。DMSO、SDS對重組蛋白酶活具有較弱的抑制作用，EDTA、異丙醇對重組蛋白酶活沒有影響，PMSF明顯抑制重組蛋白的酶活，說明該重組蛋白為絲氨酸蛋白酶。β-巰基乙醇和DTT使酶活數(shù)據(jù)極大提高。結(jié)果見表2。

3.6　重組蛋白 GM2886-His6的底物特異性分析

分別測定純化的GM2886-His6對不同底物的酶活，結(jié)果見表3。重組蛋白可與大部分可溶底物反應(yīng)，其中酪蛋白為底物時酶活最高。重組蛋白水解天青角蛋白和羽毛，證明該重組蛋白具有角蛋白酶活性。

表2　金屬離子與化學(xué)試劑對重組角蛋白酶活的影響Table 2 Effect of metal ions and chemicals on recombinant keratinases

表3　不同底物對重組角蛋白酶活的影響Table 3 Effect of portein substrates on recombinant keratinase

4　討論

角蛋白酶由于可以特異性地降解角蛋白，在多個領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景，近來被人們廣泛關(guān)注。目前關(guān)于角蛋白酶的研究主要集中于角蛋白酶生產(chǎn)菌的篩選與鑒定[17]、角蛋白酶的純化與表征[18-19]以及角蛋白酶基因的異源表達(dá)[14,20-21]等方面，其中針對地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis[22-21]和綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa[14-15]來源的角蛋白酶的研究較多，鏈霉菌來源的角蛋白酶研究較少，主要是弗氏鏈霉菌Streptomycesfradiaesfp2[11-23-24]等。角蛋白酶異源表達(dá)常用宿主為大腸桿菌E.coli[22-21]、芽胞桿菌Bacillus subtilis等[14-20]以及畢赤酵母Pichia pastoris[15-20]，使用鏈霉菌作為表達(dá)宿主的并不常見。

實驗室前期分離得到一株短時間內(nèi)即可降解完整羽毛的微白黃鏈霉菌菌株Fea-10，在對其進(jìn)行全基因組測序后通過生物信息學(xué)方法篩選到了可能的角蛋白酶編碼基因gm2886。我們曾經(jīng)嘗試在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)gm2886，可能由于其序列GC含量比較高、大腸桿菌和鏈霉菌密碼子偏好性以及對角蛋白酶的加工處理機(jī)制不同等原因而沒能得到重組蛋白，因此我們選取了角蛋白酶酶活較弱的密旋鏈霉菌 ACT12作為異源表達(dá)的宿主。另外，鑒于角蛋白酶多屬于誘導(dǎo)酶，其自身的啟動子需要在羽毛等角蛋白的誘導(dǎo)下起始基因的轉(zhuǎn)錄，這樣限制了培養(yǎng)基的成分和營養(yǎng)，因此本實驗使用組成型的紅霉素啟動子替代gm2886原始啟動子，使其不需要通過羽毛的誘導(dǎo)就能進(jìn)行高效表達(dá)，可以使用營養(yǎng)更為豐富的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，從而增加菌體生長速度和角蛋白酶產(chǎn)量。經(jīng)過多方改進(jìn)，最終我們得到了一個大小約為36 kDa的重組蛋白，活性檢測表明其具有蛋白酶活性，在還原劑存在的情況下可以高效地降解水不溶性底物天青角蛋白和羽毛粉，說明gm2886確實為角蛋白酶基因，其成熟酶序列和已報道的角蛋白酶的成熟酶序列具有同源性，最高為83%，有一定的研究價值。

gm2886基因的序列分析表明它具有信號肽、前肽和成熟酶 3個結(jié)構(gòu)域。前肽是胞外蛋白酶的一個典型結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為參與幫助成熟酶的正確折疊[25-26]。大多數(shù)的研究表明，直接表達(dá)酶原編碼基因，所產(chǎn)生的具有正常生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物多為經(jīng)過切除前肽后的成熟酶，如地衣芽胞桿菌kerA[22]和弗氏鏈霉菌的sfp2[23-24]。gm2886編碼的成熟蛋白酶的理論分子量約為20 kDa (加上組氨酸標(biāo)簽)，在ACT12中純化得到的重組蛋白約為36 kDa，表明重組蛋白的前肽可能并沒有被前肽酶切割，但在實驗室條件下卻仍然表現(xiàn)出蛋白酶活性，這值得我們后續(xù)對其進(jìn)一步研究。

在底物特異性實驗中，我們發(fā)現(xiàn)重組蛋白GM2886-His6需要在還原劑DTT的存在下才可以水解不可溶底物天青角蛋白和羽毛。一般認(rèn)為，角蛋白水解主要有兩個過程，第一步是在還原劑的參與下裂解二硫鍵，第二步是肽鏈的水解[27]。許多微生物如高溫放線菌 CDF[28]、Thermoactinomyces candidus[29]和Bacillusspecies[5-30]等，均需在活細(xì)胞的存在下才可以完全降解羽毛，表明活細(xì)胞自身提供必要的還原劑來高效水解二硫鍵。本實驗底物特異性實驗的結(jié)果驗證了在水解角蛋白時，二硫鍵的裂解是必要的，且需要有還原劑的存在。

綜上所述，本實驗通過生物信息學(xué)分析獲得了角蛋白酶編碼基因gm2886，實現(xiàn)了其在密旋鏈霉菌ACT12中的異源表達(dá)，純化得到了具有羽毛粉降解活性的重組蛋白，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。本研究為解析羽毛高效降解菌Fea-10降解角蛋白的分子機(jī)理，從而進(jìn)一步開發(fā)其應(yīng)用潛力提供了基礎(chǔ)；并為同類蛋白的研究提供了借鑒。

[1] Kublanov IV, Perevalova AA, Slobodkina GB, et al. Biodiversity of thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities in hot springs of Uzon Caldera, Kamchatka (Russia). Appl Environ Microbiol, 2009, 75(1): 286–291.

[2] Son HJ, Park HC, Kim HS, et al. Nutritional regulation of keratinolytic activity inBacillus pumilis. Biotechnol Lett, 2008, 30(3): 461–465.

[3] Suzuki Y, Tsujimoto Y, Matsui H, et al.Decomposition of extremely hard-to-degrade animal proteins by thermophilic bacteria. J Biosci Bioeng, 2006, 102(2): 73–81.

[4] Gupta R, Rajput R, Sharma R, et al.Biotechnological applications and prospective market of microbial keratinases. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(23): 9931–9940.

[5] Gupta R, Ramnani P. Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 70(1): 21–33.

[6] Macedo AJ, da Silva WO, Gava R, et al. Novel keratinase fromBacillus subtilisS14 exhibiting remarkable dehairing capabilities. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(1): 594–596.

[7] Verma A, Singh H, Anwar S, et al. Microbial keratinases: industrial enzymes with waste management potential. Crit Rev Biotechnol, 2017,37(4): 476–491.

[8] Bressollier P, Letourneau F, Urdaci M, et al.Purification and characterization of a keratinolytic serine proteinase fromStreptomyces albidoflavus.Appl Environ Microbiol, 1999, 65(6): 2570–2576.

[9] Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001.

[10] Bibb MJ, Buttner MJ, Chater KF, et al. PracticalStreptomycesGenetics. Colney, Norwich: John Innes Foundation, 2000.

[11] Li JX, Chen DD, Yu ZQ, et al. Improvement of expression level of keratinase Sfp2 fromStreptomyces fradiaeby site-directed mutagenesis of itsN-terminal pro-sequence. Biotechnol Lett,2013, 35(5): 743–749.

[12] Liu BH, Zhang J, Li B, et al. Expression and characterization of extreme alkaline, oxidationresistant keratinase fromBacillus licheniformisin recombinantBacillus subtilisWB600 expression system and its application in wool fiber processing. World J Microbiol Biotechnol, 2013,29(5): 825–832.

[13] Lin HH, Yin LJ, Jiang ST. Cloning, expression,and purification ofPseudomonas aeruginosakeratinase inEscherichia coliAD494(DE3)pLysS expression system. J Agric Food Chem, 2009,57(9): 3506–3511.

[14] Lin HH, Yin LJ, Jiang ST. Expression and purification ofPseudomonasaeruginosakeratinase inBacillus subtilisDB104 expression system. J Agric Food Chem, 2009, 57(17):7779–7784.

[15] Lin HH, Yin LJ, Jiang ST. Functional expression and characterization of keratinase fromPseudomonas aeruginosainPichia pastoris. J Agric Food Chem, 2009, 57(12): 5321–5325.

[16] Sidhu SS, Kalmar GB, Willis LG, et al. Protease evolution inStreptomyces griseusdiscovery of a novel dimeric enzyme. J Biol Chem, 1995,270(13): 7594–7600.

[17] Yusuf I, Ahmad SA, Phang LY, et al. Keratinase production and biodegradation of polluted secondary chicken feather wastes by a newly isolated multi heavy metal tolerant bacterium-Alcaligenessp. AQ05-001. J Environ Manage,2016, 183: 182–195.

[18] Elhoul MB, Jaouadi NZ, Rekik H, et al.Biochemical and molecular characterization of new keratinoytic protease fromActinomadura viridiluteaDZ50. Int J Biol Macromol, 2016, 92:299–315.

[19] Bouacem K, Bouanane-Darenfed A, Jaouadi N Z,et al. Novel serine keratinase fromCaldicoprobacter algeriensisexhibiting outstanding hide dehairing abilities. Int J Biol Macromol, 2016, 86: 321–328.

[20] Radha S, Gunasekaran P. Purification and characterization of keratinase from recombinantPichiaandBacillusstrains. Prot Exp Purif, 2009,64(1): 24–31.

[21] Tiwary E, Gupta R. Extracellular expression of keratinase fromBacillus licheniformisER-15 inEscherichia coli. J Agric Food Chem, 2010,58(14): 8380–8385.

[22] Hu H, He J, Yu B, et al. Expression of a keratinase(kerA) gene fromBacillus licheniformisinEscherichia coliand characterization of the recombinant enzymes. Biotechnol Lett, 2013,35(2): 239–244.

[23] Li J, Shi PJ, Han XY, et al. Functional expression of the keratinolytic serine protease genesfp2fromStreptomyces fradiaevar. k11 inPichia pastoris.Prot Exp Purif, 2007, 54(1): 79–86.

[24] Li J, Shi PJ, Zhang WZ, et al. Gene cloning and expression of serine protease SFP2 fromStreptomyces fradiaevar. k11. Chin J Biotech,2005, 21(5): 782–788 (in Chinese).李江, 石鵬君, 張王照, 等. 弗氏鏈霉菌絲氨酸蛋白酶基因的克隆及表達(dá). 生物工程學(xué)報, 2005,21(5): 782–788.

[25] Baardsnes J, Sidhu S, MacLeod A, et al.Streptomyces griseusprotease B: secretion correlates with the length of the propeptide. J Bacteriol, 1998, 180(12): 3241–3244.

[26] Baker D, Silen JL, Agard DA. Protease pro region required for folding is a potent inhibitor of the mature enzyme. Proteins, 1992, 12(4): 339–344.

[27] Brandelli A, Daroit DJ, Riffel A. Biochemical features of microbial keratinases and their production and applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85(6): 1735–1750.

[28] Wang LY, Cheng GY, Ren YX, et al. Degradation of intact chicken feathers byThermoactinomycessp. CDF and characterization of its keratinolytic protease. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(9):3949–3959.

[29] Ignatova Z, Gousterova A, Spassov G, et al.Isolation and partial characterisation of extracellular keratinase from a wool degrading thermophilic actinomycete strainThermoactinomyces candidus. Can J Microbiol, 1999, 45(3): 217–222.

[30] Ramnani P, Singh R, Gupta R. Keratinolytic potential ofBacillus licheniformisRG1: structural and biochemical mechanism of feather degradation.Can J Microbiol, 2005, 51(3): 191–196.