汪 洋, 李 玲, 李 真，李 峰，2*

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600)

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豬博卡病毒病原學和檢測方法研究進展

汪 洋1, 李 玲1, 李 真1，李 峰1，2*

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600)

豬博卡病毒是2009年新發(fā)現(xiàn)的一種豬細小病毒，近幾年來在我國感染率日益升高，且常常與其他病原混合感染，增加了疫病防控的難度。論文就豬博卡病毒病原學與檢測方法做一綜述，為提高我國豬博卡病毒的綜合防控能力提供參考。

豬博卡病毒；病原學；檢測方法

豬博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)是一種新型的豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)，于2009年首次在患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post weaning multisystemic wating syndrome,PMWS)的仔豬淋巴結(jié)中分離鑒定出來[1]，隨后世界養(yǎng)豬密集地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病毒的感染，目前該病毒已呈世界范圍內(nèi)流行[2-5]。PBoV感染引起的臨床癥狀與普通的PPV感染相似，仔豬的發(fā)病率和病死率高，成年豬的發(fā)病率和病死率較低[6-7]，近年來該病毒在我國豬群中感染情況呈逐漸上升的趨勢[8]。PBoV是一種人畜共患病毒，該病毒不僅能感染豬，還可以感染牛和人，不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來經(jīng)濟損失，還威脅人類健康，加強PBoV防控技術研究，對保障養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全均至關重要。論文綜述了PBoV病原學與檢測方法的最新研究現(xiàn)狀與未來發(fā)展趨勢，旨在為我國PBoV防控措施的制定提供技術支持，進而逐步提高我國PBoV的綜合防控能力。

1 豬博卡病毒的病原學

1.1 豬博卡病毒分類

豬博卡病毒屬于細小病毒科(Parvoviridae)細小病毒亞科(Parvovirinae)博卡病毒屬(Bocavirus)，博卡病毒屬成員包括牛細小病毒(Bovine parvovirus,BPV)，大猩猩博卡病毒(Gorilla parvovirus,GBoV)，犬細小病毒(Canine parvovirus,CnMV)，豬博卡病毒(PBoV)和人博卡病毒(Human parvovirus,HBoV)[9]。PBoV為單股DNA病毒，病毒基因組全長5.2 kb，正二十面體結(jié)構(gòu)，無囊膜，病毒粒子大小為25 nm～30 nm[10]。國際病毒分類委員會(ICTV)根據(jù)PBoV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的核苷酸同源性將豬博卡病毒分為5個基因型(PBoV1-5)[11]，目前，5種基因型的PBoV在豬體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)，PBoV1首先在瑞典患多系統(tǒng)衰竭綜合征病豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，PBoV2在美國感染豬圓環(huán)病毒豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，PBoV3、PBoV4在中國健康豬群糞便中發(fā)現(xiàn)，PBoV5在香港腹瀉仔豬糞便中發(fā)現(xiàn)[12]。

1.2 豬博卡病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能

PBoV與CnMV核苷酸同源性最高，為52%～55%，其次與GBoV核苷酸同源性為50 %，與HBoV核苷酸同源性為44%～48%，與BPV核苷酸同源性為44%～45%[13]。PBoV基因組為單股線狀DNA，全長4786 bp～5905 bp，5種基因型的PBoV基因組結(jié)構(gòu)基本一致，基因組序列從5′端依次含有ORF1、ORF2、ORF3 3個主要的開放閱讀框[14-15]。其中，ORF1全長1 911 bp，編碼636個氨基酸，ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，是與病毒的滾環(huán)復制方式、解螺旋酶活性及三磷酸腺苷酶活性相關的一段保守序列[16]。ORF2全長657 bp，編碼218個氨基酸，ORF2編碼衣殼蛋白VP1、VP2，VP1序列內(nèi)含有與病毒感染性有關的磷脂酸序列，VP1、VP2是病毒的主要抗原性基因[17-18]。ORF3全長1 872 bp，編碼623個氨基酸，ORF3是病毒特有的開放閱讀框，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NP1[19]。

1.3 豬博卡病毒流行病學

PBoV自2009年被首次發(fā)現(xiàn)和報道后，在短短幾年的時間內(nèi)，關于PBoV感染方面已經(jīng)有大量報道，更有發(fā)生PBoV與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)混合感染的報道。PBoV在當前豬群中感染十分普遍，侯美如等[20]的統(tǒng)計表明,5種基因型的PBoV在臨床中都有發(fā)現(xiàn)，PBoV1和PBoV3感染的陽性率最高，分別為39.3%～63.2%和12.59%～64.4%。PBoV4感染的陽性率為16.5%，PBoV2 的感染陽性率為0.76%～6.6%，PboV5感染率相對較低。PBoV對各種消毒劑敏感，常用的消毒劑都有一定的殺滅作用，PBoV在秋末和早春寒冷季節(jié)多發(fā)，病毒可以通過消化道、呼吸道接觸傳播，也可以通過血液和胎盤垂直傳播[21]。PBoV感染可以引起支氣管炎、肺炎和胃腸炎，母豬感染引起流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎，感染仔豬發(fā)生嘔吐、腹瀉，病豬嚴重消瘦，精神沉郁，最后發(fā)生嚴重脫水而死亡，剖檢可見腸壁變薄、充血和出血[22]。

2 豬博卡病毒的檢測方法

PBoV感染后的臨床癥狀與PPV感染的臨床癥狀極其相似，且PBoV常與PRRSV、PCV2、PRV等病毒混合感染，增加了PBoV臨床診斷的難度，對于PBoV感染的確診需借助實驗室診斷技術。隨著分子生物學和免疫學的快速發(fā)展與其在動物疫病診斷中的推廣應用，PBoV的分子生物學與血清學檢測方法亦得到了快速發(fā)展與完善。

2.1 聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應(PCR)操作簡單、檢測快速、敏感、特異，適合于基層實驗室進行PBoV感染的快速診斷與流行病學調(diào)查等，是一種值得基層推廣應用的快速診斷技術。付朋飛等[23]根據(jù)GenBank中登錄的PBoV1/2型的高度同源保守序列設計1對特異性引物，經(jīng)PCR擴增條件優(yōu)化，建立了檢測PBoV1/2型的PCR方法。該方法可以從PBoV1型或2型的陽性樣品中特異性的擴增出751 bp的目的片段，而對PRV、PCV2、大腸埃希菌、沙門菌核酸樣品的檢測均為陰性，對PBoV1/2重組質(zhì)粒標準品的最低檢測限為34.8 copies/μL，為PBoV1/2型的診斷和監(jiān)測提供了技術支持。同時，付朋飛等[24]建立了可同時擴增出PBoV3/4/5型的PCR檢測方法，為PBoV3/4/5型的快速檢測提供了有效的技術支持。胡軍勇等[25]根據(jù)PBoV NS1基因序列設計1對引物，建立了PBoV的PCR檢測方法，該方法可以特異性的擴增出482 bp的片段，對PBoV的最低檢測量為213.6 copies，利用該檢測方法對湖北、湖南、河南等省的各大豬場進行了流行病學調(diào)查，在79個規(guī)模化豬場采集的248份病料樣品中有172份樣品為PBoV陽性，PBoV在腹瀉豬群中的陽性率達到73.95 %，表明PBoV在國內(nèi)豬群中流行廣泛而且感染率高。翟少倫等[26]也建立了PBoV的PCR檢測方法，通過對2009年我國部分省市豬場的191份臨床樣品進行檢測，結(jié)果75份為豬博卡病毒陽性，表明我國豬群中PBoV相當流行，該PCR可以作為PBoV臨床診斷上的一種診斷技術。

2.2 多重PCR

多重PCR是在同一PCR反應體系中，加入多對特異性引物，實現(xiàn)兩種或多種病原核酸的檢測，廣泛用于各種臨床疾病的快速診斷和分型研究。宏春慧等[27]根據(jù)PBoV基因序列分別設計3對針對PBoV 1型、2型和3型3種基因型保守區(qū)域的引物進行PCR擴增，擴增目的片段大小分別為645 bp(PBoV1型)、352 bp(PBoV2型)和259 bp(PBoV3型)，建立了PBoV不同基因型三重PCR檢測方法，該方法最低檢測限為8×10-7ng/μL，對臨床樣品進行三重PCR和單項PCR檢測，二者符合率為100 %，該方法的建立為PBoV 3種不同基因型的鑒別檢測提供了有效手段。李小鵬等[28]利用同源性分析設計3對引物分別擴增PboV1、PBoV2、PBoV3，也建立了PBoV多重PCR檢測方法，實現(xiàn)了PBoV快速多基因型檢測。蔡雨函等[29]根據(jù)PBoV1/2型和PBoV3/4/5型的基因組序列，分別設計擴增PBoV1/2型和PBoV3/4/5型的檢測引物，在建立單一PCR檢測方法的基礎上，通過反應條件的優(yōu)化，建立了PBoV1/2/3/4/5型的雙重PCR檢測方法，應用本方法對189份仔豬腹瀉病料進行了檢測，結(jié)果共檢出PBoV陽性樣品121份，陽性率達到64.2%，121份陽性樣品中有79份為PBoV 3/4/5型，29份為PBoV 1/2型，13份為PBoV 1/2型及3/4/5型混合感染，表明四川地區(qū)主要的流行毒株可能是PBoV 3/4/5型。

2.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR是結(jié)合常規(guī)PCR技術和光譜技術發(fā)展起來的一種新型分子生物學定量檢測技術，與常規(guī)PCR相比具有敏感性更高、全封閉反應、不需核酸電泳檢測、實時定量等優(yōu)點。陳鵬強等[30]建立了PBoV5型SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR，該方法在3.64×102copies/μL～3.64×107copies/μL范圍內(nèi)有很好的線性關系，擴增產(chǎn)物的熔解曲線僅出現(xiàn)單一特異峰，無引物二聚體，Tm值為83.12℃±0.12℃，可重復性好，組內(nèi)變異系數(shù)為0.35%～1.24%，組間變異系數(shù)為0.43%～1.46%，此方法的建立為定量分析PBoV5型感染豬的感染程度和靶器官提供了精確檢測手段。鄧波等[31]根據(jù)PBoV序列，通過VP1/2基因設計引物和TaqMan探針，建立了檢測PBoV的實時熒光定量PCR，該方法檢測PPV、PRRSV、PCV2均為陰性，具有較高特異性，在107copies/mL～101copies/mL模板范圍內(nèi)具有良好的線性關系，所制作的標準曲線相關系數(shù)為0.997，最低可檢測到101copies/mL的陽性質(zhì)粒，所建立的PBoV實時熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性好和精確性高等優(yōu)點。熒光定量PCR的靈敏度雖高，但該方法對儀器設備和操作人員技術水平要求較高，一般基層實驗室由于不具備實驗條件而無法開展。

2.4 環(huán)介導等溫擴增

環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型核酸擴增技術，該技術通過應用多條特異性引物和具有鏈置換功能的DNA聚合酶可以實現(xiàn)等溫擴增，不需要特殊的儀器設備，操作方法簡單，肉眼判讀結(jié)果，更加直觀，方便。李帥偉等[32]應用DNA Star生物學軟件對GenBank中PBoV進行同源性分析，獲得PBoV保守靶序列，根據(jù)保守序列設計4條特異性引物，經(jīng)LAMP反應條件的優(yōu)化，建立了檢測PBoV的LAMP檢測方法，并組裝了試劑盒，該試劑盒檢測豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)、輪狀病毒(Rotavirus,RV)、PRRSV、PCV2、PPV均為陰性，可以檢測到10-6倍稀釋的PBoV陽性病料核酸DNA，實現(xiàn)了PBoV的體外快速診斷，該研究成果已經(jīng)申請國家發(fā)明專利。LAMP方法操作簡單、檢測快速，不需要昂貴的實驗儀器，適合在基層臨床疫病診斷中推廣應用。

2.5 間接免疫熒光

間接免疫熒光方法以熒光物質(zhì)標記抗體，通過抗原抗體的特異性結(jié)合，是用熒光抗體檢測相應抗原的方法。McKillen J等[33]利用豬原代腎細胞建立了PBoV的原代細胞培養(yǎng)方法，通過間接免疫熒光試驗判定病毒在細胞上的增殖情況，PBoV可以在豬原代腎細胞上生長復制并主要存在于豬原代腎細胞的細胞核中。間接免疫熒光方法根據(jù)抗原抗體特異性反應原則，特異性強，敏感性高，但需要細胞培養(yǎng)等無菌操作較嚴格的實驗技術，操作復雜、繁瑣，專業(yè)人員需要一定的技術水平，一般基層實驗室很難具備試驗條件。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗

鄭英帥[34]分別對NP1基因和VP2基因進行B細胞線性抗原表位的預測分析，設計合成特異性引物，采用降落PCR技術擴增NP1基因和截短的VP2基因，并分別將其與原核表達載體pET32a連接，經(jīng)IPTG誘導后SDS-PAGE電泳可分別檢測到分子質(zhì)量約為44 ku和35 ku的蛋白，重組蛋白純化后經(jīng)Western blot結(jié)果顯示，NP1和VP2重組蛋白均與PBoV陽性血清具有良好的反應原性，分別以純化的兩種重組蛋白作為包被抗原，通過對各自反應條件的優(yōu)化，分別建立了檢測PBoV NP1抗體和VP2抗體的間接ELISA檢測方法，NP1-ELISA和VP2-ELISA檢測CSFV、PRRSV、PPV、PCV2陽性血清均為陰性，批內(nèi)和批間重復性試驗的變異系數(shù)均值都小于10%，臨床樣品檢測表明NP1-ELISA比VP2-ELISA的檢出率高，VP2-ELISA為PBoV感染的快速診斷與流行病學調(diào)查等提供了一種簡便、快速、高通量的血清學檢測方法。ELISA簡單、快速、敏感、特異、穩(wěn)定性好，非常適用于大批量樣品的檢測，具有良好的應用前景。

3 小結(jié)與展望

國內(nèi)的現(xiàn)階段流行病學調(diào)查證明PBoV的感染情況，無論在健康豬群還是表現(xiàn)呼吸道以及腹瀉癥狀的豬群中都有很高的陽性率，PBoV值得關注和持續(xù)化監(jiān)測[35]。目前PBoV防控還沒有疫苗可以應用，養(yǎng)豬場防控本病主要通過加強飼養(yǎng)管理和加強環(huán)境衛(wèi)生，定期做好疫病監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)病情，及早隔離病豬。在PBoV的各種診斷方法之中，PCR和多重PCR簡單、快速，但該方法敏感性低于熒光定量PCR、LAMP等，容易出現(xiàn)漏檢。熒光定量PCR彌補了常規(guī)PCR不能定量的缺點，且其敏感性大大提高，但該方法對儀器、試劑、操作人員的要求均較高，限制了在基層獸醫(yī)部門的推廣應用。LAMP是新興的分子生物學檢測方法，對儀器、試劑、操作人員的要求較低，特別適合基層獸醫(yī)部門適用，但敏感性太高，易導致假陽性結(jié)果。ELISA操作簡單、高通量，將是PBoV血清學抗體監(jiān)測的主要方法，具有廣闊的開發(fā)應用前景。綜合判斷，PBoV的各種監(jiān)測方法均具有各自的優(yōu)缺點，檢測人員可根據(jù)自身實驗條件選擇適合的方法。相信隨著分子生物學和血清學技術的不斷發(fā)展，PBoV的各種檢測方法亦會得到不斷完善，同時也會有更多的新型檢測方法不斷建立，不斷為PBoV的診斷、流行病學調(diào)查和防控提供技術保障。

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Advance in Etiology and Detection Methods of Porcine Bocavirus

WANG Yang1,LI Ling1,LI Zhen1, LI Feng1,2

(1.ShandongLvduBio-SciencesandTechnologyCo.Ltd.,Binzhou,Shandong,256600,China; 2.ShandongBinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong,256600,China)

Porcine bocavirus is a swine parvovirus recently discovered.In recent years the infection rate was increasing in China,and often mixed infection with other pathogens,thus increasing the difficulty of disease prevention and control.This paper makes a review on the etiology and detection methods of porcine bocavirus,in order to provide reference for improving the comprehensive prevention and control of porcine bocavirus in China.Key words:Porcine bocavirus;etiology;detection methods

2016-10-08

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊建設任務項目(SDAIT-08-17)

汪 洋(1973-)，男，安徽人，碩士，主要從事預防獸醫(yī)學研究。

S854.43;S852.659.2

A

1007-5038(2017)04-0098-04

*通訊作者