張 芳，劉瑞寧，陳穎鈺，郭愛珍

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖北武漢 430070)

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文獻(xiàn)綜述

牛傳染性鼻氣管炎診斷方法研究進(jìn)展

張 芳，劉瑞寧，陳穎鈺，郭愛珍*

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖北武漢 430070)

牛傳染性鼻氣管炎(IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)，即牛皰疹病毒1型(BoHV-1)所引起的以上呼吸道炎癥為主的一種牛的急性、熱性、接觸性傳染病，呈世界性流行。IBR的早期準(zhǔn)確診斷，對(duì)該病的防控具有不可忽視的作用。目前，IBR的診斷方法主要包括病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷方法。病原學(xué)診斷具有特異和敏感及準(zhǔn)確等特點(diǎn)，而血清學(xué)診斷具有敏感、快速、方便和價(jià)廉等特點(diǎn)。為了實(shí)施IBR的凈化和根除計(jì)劃，部分國家和地區(qū)已逐漸采用IBR基因缺失疫苗，配套使用鑒別診斷方法來鑒別IBR疫苗免疫和自然感染。論文就牛傳染性鼻氣管炎常用診斷方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為IBR的診斷和防控提供參考。

牛傳染性鼻氣管炎；牛皰疹病毒1型；診斷；疫苗

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)，即牛皰疹病毒1型(Bovine herpesvirus-1，BoHV-1)所引起的牛的急性、熱性、接觸性傳染病，又稱為“壞死性鼻炎”、“紅鼻子病”或牛媾疫。本病于1955年在美國科羅拉多州育肥牛體內(nèi)被首次發(fā)現(xiàn)，隨后在洛杉磯和加利福尼亞等地相繼發(fā)現(xiàn)，并被命名為IBR。1956年，Madin S H等[1]首次從患牛分離出IBRV，Huck等于1964年確認(rèn)IBRV屬于皰疹病毒。此后證實(shí)，該病呈世界性流行。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報(bào)的疫病之一，在我國被列為二類動(dòng)物疫病，并列為進(jìn)出口牛、牛遺傳物質(zhì)及肉制品的必檢項(xiàng)目。

從該病發(fā)現(xiàn)到至今，關(guān)于IBR的診斷方法迅速發(fā)展起來，在實(shí)際生產(chǎn)中結(jié)合流行病學(xué)和臨床檢查對(duì)本病做出初步診斷，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的診斷方法對(duì)本病做出確診。實(shí)驗(yàn)室的診斷方法主要包括病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷。近年來BoHV-1基因缺失標(biāo)記疫苗的使用逐漸增加，如一些歐洲國家使用的BoHV-1 gE缺失疫苗?；蛉笔б呙绮粌H毒力較低，而且具有免疫標(biāo)識(shí)，可區(qū)分IBR疫苗免疫和自然感染。鑒別診斷方法的配套使用，有利于IBR的檢疫和防控[2]。

1 臨床診斷

牛體感染BoHV-1后，機(jī)體會(huì)呈現(xiàn)出相應(yīng)的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為高熱、鼻和氣管黏膜炎癥、咳嗽和呼吸困難等，同時(shí)伴發(fā)有傳染性膿皰性外陰-陰道炎、結(jié)膜炎、角膜炎，以及腸炎和小牛腦炎，并能引起母牛流產(chǎn)和死胎[3]。此外，BoHV-1是牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex，BRD)的病因之一，牛感染BoHV-1后，可引起免疫抑制，繼發(fā)細(xì)菌感染以及其他病毒的感染，并引起嚴(yán)重的牛肺炎[4]。BoHV-1感染機(jī)體后會(huì)呈潛伏感染狀態(tài)，它可以潛伏在三叉神經(jīng)和腰、薦神經(jīng)節(jié)內(nèi)，并在應(yīng)激條件下活化，并不斷向外排放，所以潛伏帶毒的?？沙蔀樵摬《緜鞑サ闹匾獋魅驹?，這給該病的防控和凈化帶來了很大困難[5]。因此，臨床上可以根據(jù)動(dòng)物的臨床檢查和病理剖檢等來對(duì)該病進(jìn)行初步診斷，但是無法進(jìn)行早期診斷和對(duì)疫病確診，所以實(shí)際上還需要借助病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷等方法來對(duì)該病進(jìn)行確診，以便及時(shí)治療和防控。

2 病原學(xué)診斷

IBR的病原學(xué)診斷方法主要包括病毒分離鑒定和分子生物學(xué)檢測方法等，病原學(xué)診斷具有特異、敏感及準(zhǔn)確等特點(diǎn)，其中分子生物學(xué)檢測方法以核酸檢測為基礎(chǔ)通過檢測特異性目標(biāo)片段來對(duì)該病進(jìn)行診斷，結(jié)果準(zhǔn)確且特異，所以在實(shí)際應(yīng)用中得到了廣泛使用。

2.1 病毒分離鑒定

臨床上，根據(jù)牛體不同的臨床癥狀，采集的樣品也會(huì)有所不同：鼻氣管炎以棉拭子采集處于發(fā)熱期的鼻液和眼分泌物；外陰-陰道炎時(shí)采集外陰部黏膜和陰道分泌物，公牛則采集精液和包皮的生理鹽水沖洗物；有流產(chǎn)胎兒時(shí)采集胎兒胸水、心包液、心血及肺等實(shí)質(zhì)臟器；腦炎時(shí)采集腦組織[6]。病毒分離鑒定主要是利用牛腎細(xì)胞(madin-darby bovine kidney，MDBK)對(duì)以上臨床上采集的樣品進(jìn)行病毒分離和鑒定。樣品感染MDBK后如果細(xì)胞產(chǎn)生圓縮、呈葡萄樣聚集以及空洞等典型細(xì)胞病變，既可以診斷為BoHV-1感染[7]。但是，由于病毒分離過程比較復(fù)雜、耗時(shí)長、實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高等缺點(diǎn)，只能作為實(shí)驗(yàn)室診斷方法，因此在實(shí)際應(yīng)用中很少應(yīng)用。

2.2 病毒核酸檢測

BoHV-1為DNA病毒，IBR核酸檢測方法主要有聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和熒光PCR檢測技術(shù)，此類方法通過一定的技術(shù)在體外對(duì)目標(biāo)基因DNA片段進(jìn)行快速擴(kuò)增，然后根據(jù)結(jié)果進(jìn)行疫病診斷。該方法與其他病原學(xué)檢測方法和血清學(xué)診斷方法相比較，病毒核酸檢測方法具有快速、高特異性和高敏感性等優(yōu)勢，因此在IBR的臨床診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。1993年，Vander、Vilcek和Wiedman等建立了BoHV-1的PCR診斷方法。此后，許多的學(xué)者研究并建立了BHV-1的核酸檢測方法。王嵩等[8]根據(jù)GenBank中登錄的BoHV-1保守基因gB序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，通過不斷優(yōu)化反應(yīng)體系后建立了快速檢測BoHV-1的PCR，該方法的檢測敏感性可達(dá)10-3TCID50/mL。林梅等[9]建立了基于BoHV-1 tk基因的PCR檢測方法，并對(duì)該P(yáng)CR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，該方法敏感、特異，可為牧場進(jìn)行IBR疫情監(jiān)測提供有效技術(shù)手段。喬波等[10]利用BoHV-1 gB基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)了特異性引物和MGB探針，建立了BoHV-1TaqMan-MGB熒光定量PCR，該方法靈敏、快速、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，適用于臨床疑似樣品的快速定量檢測。Marin M S等[11]建立了高分辨率熔解曲線的熒光PCR，可以同時(shí)檢測和區(qū)分BoHV-1和BoHV-5，該方法與病毒分離和傳統(tǒng)PCR相比，具有更高的敏感性，是一種快速、敏感、特異的檢測方法，可以廣泛應(yīng)用于BoHV-1的研究和診斷。

近年來，隨著環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)的快速發(fā)展，與普通PCR相比較，該方法不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程，因肉眼可以直接觀察結(jié)果，所以大大的節(jié)省了時(shí)間。LAMP的原理是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下(63℃左右)保溫30 min～60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。我國皇甫和平等[12]針對(duì)IBRV 的gE基因建立了LAMP快速檢測技術(shù)，為進(jìn)一步開發(fā)針對(duì)gE基因缺失的IBRV疫苗鑒別診斷方法奠定了基礎(chǔ)。印度的Pawar等建立了BoHV-1 gE的LAMP，在等溫條件下就可以快速地檢測和鑒別BoHV-1自然感染和BoHV-1 gE-疫苗株，大大提高了檢測的靈敏度，是檢測和鑒別BoHV-1自然感染及BoHV-1 gE缺失疫苗免疫的快速、敏感、特異、低成本的技術(shù)[13]。正因?yàn)長AMP具有簡易、快速、高效率及高特異性等優(yōu)點(diǎn)，所以 LAMP得到了廣泛的應(yīng)用[14]。

3 血清學(xué)診斷

3.1 中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)是IBR最常用、最經(jīng)典的血清學(xué)診斷方法，是OIE規(guī)定的國際貿(mào)易指定的方法之一，同時(shí)也是我國動(dòng)物檢疫規(guī)定的方法[15]，適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。中和實(shí)驗(yàn)的基本原理是將已知滴度的BoHV-1標(biāo)準(zhǔn)病毒與倍比稀釋的待檢血清中和后接種96孔板MDBK細(xì)胞，然后細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，如觀察到BoHV-1特異性細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)，則說明該血清樣品為BoHV-1中和抗體陽性，同時(shí)根據(jù)抑制50%接種細(xì)胞出現(xiàn)CPE的血清稀釋度可計(jì)算血清的中和抗體滴度。

由于中和試驗(yàn)的過程繁雜，用時(shí)比較長，且容易受到其他不確定因素(細(xì)胞污染等)的影響，所以目前對(duì)于IBR的診斷該方法使用較少，在IBR的檢疫中逐漸被酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)所取代。

3.2 ELISA

IBR ELISA是國際貿(mào)易中規(guī)定的診斷方法之一，因ELISA具有操作簡便、快速、敏感、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，在IBR的診斷和檢測上發(fā)揮著舉足輕重的作用。

構(gòu)建BoHV-1抗體檢測ELISA的靶抗原是具有免疫原性的囊膜糖蛋白。BoHV-1基因組有73個(gè)編碼框(open reading frame，ORF)，可以編碼73個(gè)蛋白質(zhì)，且這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能大部分都已知。其中g(shù)B、gC、gD、gE和gG具有良好的免疫原性。因此，這些蛋白被作為IBR的診斷靶蛋白，用于建立IBR ELISA診斷方法。

gB糖蛋白是BoHV-1在細(xì)胞上增殖所必需蛋白，具有免疫原性，曹翀等[16]將純化的gB蛋白作為診斷靶蛋白建立了gB間接ELISA，并證實(shí)其敏感性好，特異性強(qiáng)。雖然與糖蛋白gG和gD相比，gB的抗原性較弱，然而目前，已有商品化的gB阻斷ELISA檢測試劑盒，并得到了廣泛的應(yīng)用。

gC糖蛋白是感染細(xì)胞表面和病毒囊膜上表達(dá)量最大的糖蛋白，具有良好的免疫原性，是引起體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要靶標(biāo)，馬輝等[17]原核表達(dá)和純化BoHV-1 gC重組蛋白，并制備了gC的特異性單克隆抗體及建立了BoHV-1雙抗體夾心ELISA，該方法特異性和敏感性良好，為快速診斷IBR提供了診斷方法。

gD糖蛋白參與BoHV-1在細(xì)胞間的擴(kuò)散，且是BoHV-1免疫原性最好的糖蛋白，能夠誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，常被作為亞單位疫苗的首選蛋白[18]。因其具有良好的免疫原性，周躍輝[19]表達(dá)和純化BoHV-1 gD蛋白，并制備了gD的特異性單克隆抗體及建立了BoHV-1雙抗體夾心ELISA，具有良好的重復(fù)性、敏感性和特異性，為我國的IBR流行病學(xué)調(diào)查提供了快速、簡便的血清學(xué)診斷方法。

gE糖蛋白與病毒的順行和神經(jīng)毒性有關(guān)，同時(shí)具有免疫原性，是中和抗體的主要靶位點(diǎn)之一，已被作為診斷靶蛋白建立gE阻斷ELISA診斷方法[20]，且市場上已有商品化的gE阻斷ELISA檢測試劑盒供應(yīng)。同時(shí)，gE蛋白也是構(gòu)建標(biāo)記疫苗的靶蛋白之一，市場上已有商業(yè)化IBR gE缺失標(biāo)記疫苗免疫和自然感染產(chǎn)生的血清抗體，即自然感染產(chǎn)生抗體，疫苗因缺失gE基因、不表達(dá)免疫gE蛋白，因此不產(chǎn)生gE抗體。此外，Bertolotti等利用gE重組蛋白建立的間接ELISA方法，該方法敏感性和特異性分別可以達(dá)到98.41%和99.76%，可以用于BoHV-1的血清學(xué)檢測[21]。

gG糖蛋白也具有很強(qiáng)的抗原性，已被用于診斷抗原并建立了gG ELISA，試驗(yàn)證明效果良好。王冰[22]則以純化的gG蛋白免疫小鼠得到單克隆抗體，并用辣根過氧化酶標(biāo)記的單抗和表達(dá)蛋白建立了競爭ELISA，在牛傳染性鼻氣管炎流行病學(xué)調(diào)查方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

近年來，Elisabetta C等[23]建立了一個(gè)基于抗生物素蛋白-核酸的組裝體(avidin-nucleic-acid-nanoassembly，ANANAS)技術(shù)的新型ELISA。ANANAS技術(shù)與傳統(tǒng)的ELISA相比，最大的特色是由辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記抗體轉(zhuǎn)變成了用生物素蛋白-HRP標(biāo)記抗體，這是一種基于納米顆粒級(jí)別的膠狀多聚抗生物素蛋白新型的用于免疫診斷學(xué)的信號(hào)放大平臺(tái)，可廣泛應(yīng)用于診斷程序中[24]。與傳統(tǒng)的應(yīng)用HRP的商品化ELISA試劑盒相比，Elisabetta等建立的ANANAS技術(shù)新型ELISA在不降低特異性的基礎(chǔ)上提高了敏感性，具有很大的應(yīng)用前景。

3.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是利用BoHV-1抗原來檢測被檢血清中的沉淀抗體，反過來也可以利用IBR陽性血清來檢測臨床病料或細(xì)胞培養(yǎng)物中的相應(yīng)抗原。1993年，Suresh S建立了免疫擴(kuò)散和對(duì)流免疫擴(kuò)散檢測BoHV-1的方法[25]。 該方法操作簡單，成本較低，但是敏感性很低，不適用于BoHV-1的診斷和根除。

4 IBR根除計(jì)劃與鑒別診斷

如前所述，一些IBR陽性率較高的國家或地區(qū)一般采用IBR gE基因缺失標(biāo)記疫苗免疫以及聯(lián)合使用剔除IBR gE陽性牛的措施來進(jìn)行IBR的防控[6]。當(dāng)牛群的IBR gE陽性率降低至5%時(shí)，就可采用撲殺的方法剔除剩下的陽性牛，以達(dá)到根除IBR的目的。除了IBR gE缺失標(biāo)記疫苗外，一些歐洲國家也使用BoHV-1 gE-/tk-雙基因缺失疫苗，該疫苗缺失了tk毒力基因，因此被認(rèn)為是更安全的標(biāo)記疫苗[26]。目前，BoHV-1三基因缺失疫苗也在不斷研究和開發(fā)中。由于基因缺失標(biāo)記疫苗與野毒相比缺失了一個(gè)或多個(gè)具有免疫原性的糖蛋白，因此基因缺失標(biāo)記疫苗免疫并結(jié)合相應(yīng)的診斷方法即可鑒別診斷IBR自然感染和相關(guān)疫苗免疫。

BoHV-1 gE缺失疫苗以活疫苗或滅活疫苗形式在歐洲已得到廣泛的使用，與之配套使用的是IBR阻斷gE-ELISA試劑盒，試驗(yàn)證明其可有效的區(qū)分BoHV-1自然感染牛和BoHV-1 gE缺失疫苗免疫的牛。鄧碧華等[27]根據(jù)BoHV-1野毒株和BoHV-1 gE基因缺失疫苗株共有的BoHV-1 gB基因序列設(shè)計(jì)了一套引物，還根據(jù)缺失的BoHV-1 gE基因序列設(shè)計(jì)了另一套引物，并建立了檢測BoHV-1的套式PCR，該套式PCR方法敏感性高、特異性強(qiáng)且操作方便，能夠檢測BHV-1及有效區(qū)分BoHV-1野毒株和BoHV-1 gE基因缺失疫苗株。Shafiqul I等[28]制作了缺失了UL49.5和gE胞質(zhì)尾區(qū)的BoHV-1突變體，同時(shí)研制了一株針對(duì)BoHV-1 gE胞質(zhì)尾區(qū)表位的單克隆抗體，并建立了gE胞質(zhì)尾區(qū)的特異性阻斷ELISA，可以成功區(qū)分野生型BoHV-1感染和BoHV-1突變體的感染。Claire O H等[29]通過高分辨率熔化分析(high-resolution melting，HRM)和PCR-DNA測序的方法來鑒別BoHV-1疫苗免疫株和BoHV-1感染后的突變株，因?yàn)锽oHV-1疫苗免疫株和BoHV-1感染后的突變株有著不同的熔化曲線和不同的基因序列。BoHV-1感染牛后，gG蛋白可與體內(nèi)趨化因子受體結(jié)合，通過封閉趨化因子作用而抑制免疫。因此，gG蛋白也是基因缺失標(biāo)記疫苗的靶蛋白之一，本實(shí)驗(yàn)室Zhang M等[30]構(gòu)建了BoHV-1 gG-/tk-雙基因缺失疫苗，牛體試驗(yàn)表明疫苗毒力明顯減弱，同時(shí)具有良好的免疫原性。所以，基于gG蛋白的鑒別診斷ELISA亟待建立，并應(yīng)用于gG缺失標(biāo)記疫苗的鑒別診斷。

5 結(jié)語

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各國和地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)得到了發(fā)展和壯大，牛傳染性鼻氣管炎的流行和對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的威脅也日趨嚴(yán)重。綜上所述，雖然IBR的診斷方法多種多樣，但是由于各自技術(shù)的特點(diǎn)，在不同的實(shí)際應(yīng)用過程中，需要根據(jù)具體的實(shí)際情況選擇適宜的診斷方法，以達(dá)到診斷目的。

自IBR被發(fā)現(xiàn)以來，對(duì)于該病的診斷方法在不斷的革新和完善，傳統(tǒng)的病毒分離方法周期長，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還很容易受到外界的影響。傳統(tǒng)的核酸檢測在近年來發(fā)展迅速，診斷技術(shù)形式也多種多樣，靈敏度比較高，但是這些方法對(duì)儀器的要求非常高。LAMP克服了傳統(tǒng)核酸檢測的缺點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。血清學(xué)診斷方法具有快速、方便等優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)于潛伏感染的情況卻難以診斷。新材料的發(fā)展推動(dòng)了新的儀器和新的診斷技術(shù)的產(chǎn)生，IBR診斷朝著更加敏感、特異、快速、簡便、高效的方向發(fā)展，配合標(biāo)記疫苗的使用，將在IBR控制與凈化根除中發(fā)揮重要作用，預(yù)防和控制IBR，并達(dá)到凈化根除的目的。

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Progress on Diagnosis Method of Infectious Bovine Rhinotracheitis

ZHANG Fang,LIU Rui-ning,CHEN Ying-yu,GUO Ai-zhen

(TheStateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity/CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

Infectious bovine rhinotracheitis (IBR) in cattle caused by infectious bovine rhinotracheitis virus(IBRV),also called as bovine herpes virus-1 (BoHV-1)can be an acute,feverish,and contagious infectious disease characterized by inflammation in upper respiratory tracts.It is a worldwide popular disease.The early and accurate diagnosis is essential to control this disease.The common diagnosis methods include pathogenic detection and serolog.Pathogenic detection has advantages of highly specific,and sensitive but time-consuming and cost-consuming,while serological diagnosis has advantages of sensitivity,low cost,convenience and rapidity.As the marker vaccines are increasingly used in eradication of IBR,differential diagnosis techniques are used to idifferentiate vaccine immunization and natural infection.In this paper,the progress on IBR diagnosis was summarized in order to provide reference for IBR diagnosis and control.

Infectious bovine rhinotracheitis;Bovine herpesvirus 1; diagnosis；vaccine

2016-09-29

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛/牦牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CARS-38)；教育部高校博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20130146110003)

張 芳(1991-)，女，湖南益陽人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)傳染病學(xué)研究。*通訊作者

S852.659.1;S852.653

A

1007-5038(2017)04-0093-05