李 欣，田守龍，何柳芬，劉百強，賈 佳，任邵娜，蒲文珺，張浩吉

(佛山科學技術學院動物醫(yī)學系，廣東佛山 528231)

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鵝蛔蟲ITS rDNA的分子特征及種類分析

李 欣，田守龍，何柳芬，劉百強，賈 佳，任邵娜，蒲文珺，張浩吉*

(佛山科學技術學院動物醫(yī)學系，廣東佛山 528231)

為探究從廣東省清遠的鵝體內采集的蛔蟲(Ascaridiaanseris)的種類，對臨床采集的鵝蛔蟲樣品，在形態(tài)觀察的基礎上，用保守引物NC5和NC2擴增鵝蛔蟲的ITS rDNA基因片段，將擴增產物經克隆測序后，獲得大小為1 009 bp的鵝蛔蟲ITS rDNA基因序列(GenBank登錄號為KC905082)。序列比對和系統(tǒng)進化分析表明，鵝蛔蟲5.8 S rRNA基因與GenBank 收錄的雞蛔蟲(登錄號為AJ001508)同源性為96%，而與不同地理株的鴿蛔蟲的同源性在91%～96%之間；禽蛔科的雞蛔蟲、鴿蛔蟲和鵝蛔蟲同一進化分支，鵝蛔蟲、雞蛔蟲和鴿蛔蟲處于各自的獨立進化分支。上述證明，鵝蛔蟲是不同于鴿蛔蟲的一個獨立有效種，在系統(tǒng)發(fā)生關系上與雞蛔蟲更親近。

鵝蛔蟲；內轉錄間隔區(qū)核糖體DNA；聚合酶鏈反應；序列分析

鵝蛔蟲(Ascaridiaanseris)隸屬于禽蛔科(Ascarididae)禽蛔屬的一種大型線蟲，蟲體寄生于鵝的小腸，主要分布于我國和前蘇聯(lián)的一些地區(qū)[1]。鵝感染后主要癥狀為食欲不振、精神沉郁、羽毛松亂、下痢、消瘦，對養(yǎng)鵝業(yè)帶來一定的危害。蟲體種類鑒定是寄生蟲病診斷和防控的基礎，傳統(tǒng)的寄生蟲鑒定方法主要是依據蟲體形態(tài)學特征進行鑒定，此法簡單通用，但是對形態(tài)相近的蟲體、蟲卵以及幼蟲，形態(tài)學鑒定具有一定局限性[2-3]。隸屬于禽蛔科的雞蛔蟲(A.galli)、鴿蛔蟲(A.columbae)和鵝蛔蟲(A.anseris)各自寄生的宿主不同，但蟲體形態(tài)差異很小，尤其是鵝蛔蟲，在臨床上鮮有感染和發(fā)病的報道，而且對鵝蛔蟲種類的有效性也存在爭議[4]。

隨著現代分子生物學技術的不斷發(fā)展，將PCR擴增和序列分析技術相結合，可以在基因水平揭示物種間的差異和系統(tǒng)發(fā)生關系[5]。其中ITS rDNA是最常選用的遺傳標記[6]。ITS是核糖體DNA中介于18 S和28 S之間的內轉錄間隔區(qū)，包括 ITS1、5.8S和ITS2三段序列[7]。由于其兩端為小亞基和大亞基，不會像rRNA基因那樣受到功能上的限制。 ITS區(qū)域傾向于比較高的進化速率，在核苷酸序列和長度上導致了很大的變異性[8]。ITS rDNA在物種進化過程中顯示種的特征，在種內具有高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異，是最廣泛應用于寄生蟲種間分類鑒定的理想遺傳標記[9-10]。本試驗對采集自廣東鵝小腸的鵝蛔蟲在形態(tài)學觀察的基礎上進行基因組DNA抽提，用能擴增蟲體ITS區(qū)的通用引物進行PCR擴增和序列分析，以期為鵝蛔蟲的分子鑒定提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 試驗所用的蟲體均為2012年9月從廣東省清遠鵝場的臨床病鵝的小腸里收集的鵝蛔蟲，樣本標注為A.anseris-1和A.anseris-2，經生理鹽水清洗干凈后保存于750 mL/L的酒精溶液中備用。

1.1.2 主要試劑 LB Broth，上海生工生物工程技術服務有限公司產品；Amp、IPTG、X-Gal、Agar、EcoRⅠ、HindⅢ、DNA Marker DL 2 000、DL 5 000、ExTaqDNA聚合酶、pMD-18T載體、DH5ɑ感受態(tài)細胞、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，寶生物工程(大連)有限公司產品。其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 蟲體DNA抽提 從保存于750 mL/L酒精中取出單個的成蟲，用雙蒸水反復吹打沖洗3次，稱重10 mg，將蟲體組織置于1.5 mL EP管中，用滅菌且經紫外燈照射過的微型剪刀將蟲體組織剪碎，根據DNA提取試劑盒推薦的步驟提取蟲體DNA，作為PCR反應的模板，置-20℃冰箱保存。

1.2.2 蟲體ITS rDNA的PCR擴增 參照文獻報道[11-12]的擴增寄生蟲ITS rDNA的引物，引物序列為NC5：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′；NC2：5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，使用時加入滅菌雙蒸水稀釋成10 μmol/mL，分裝后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應體系為50 μL， 其中ExTaqDNA聚合酶25 μL，引物NC5和NC2各2 μL(10 μmol/mL)，蟲體DNA模板 4 μL，加入滅菌雙蒸水至50 μL。以實驗室保存的鴿蛔蟲基因組DNA為模板作為陽性對照，以蒸餾水為模板作為陰性對照。輕微振蕩并離心之后進行PCR反應。PCR擴增條件為：94℃ 5 min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，于12℃終止。

取6 μL 的PCR擴增產物，用10 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳儀設置電壓150 V，100 mA，紫外透射儀觀察結果，并拍照記錄。

1.2.3 PCR產物的克隆鑒定和序列測定 將膠回收純化的基因片段連接至pMD-18T載體，轉化至DH5ɑ感受態(tài)細胞，涂布LB/Amp/X-gal/IPTG平板培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12 h～24 h，從每個平板上隨機挑選單個白色菌落，再使用 LB/Amp+培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12 h～16 h。按照質粒提取試劑盒說明書將菌體中的質粒提取，再將質粒進行PCR檢測，選出陽性質粒，取10 μL質粒，用EcoRⅠ和HindⅢ，37℃ 4 h，雙酶切檢驗重組質粒，挑選出陽性重組質粒送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。

1.2.4 序列比對和系統(tǒng)進化分析 對測序獲得序列進行拼接，除去頭尾載體通用引物部分序列，截取完整NC引物擴增序列全長，將檢測的序列提交至NCBI進行Blast比較和分析。用Clustal X 2.1[13]對獲得的序列分別進行比對分析，用DNA Star 7.0軟件將測序結果與GenBank收錄的對不同種類的蛔蟲的內轉錄間隔區(qū)基因序列進行核苷酸同源性比對，構建種系關系進化樹，確定鵝蛔蟲的種類分子特征和系統(tǒng)發(fā)生關系。

登錄NCBI網站，從GenBank下載蛔目的代表性種類的ITS rDNA序列。包括蛔科(Ascaridae)蛔屬(Ascaris)的人蛔蟲(A.lumbricoides)和豬蛔蟲(A.suum)，禽蛔科(Ascarididae)禽蛔屬(Ascaridia)的雞蛔蟲(A.galli)和鴿蛔蟲(A.columbae)，弓首科(Toxocaridae)弓首屬(Toxocara)的犬弓首蛔蟲(T.canis)、貓弓首蛔蟲(T.cati)以及弓蛔屬的獅弓蛔蟲(Toxascarisleonina)，進行進行同源性分析以及種系進化樹的繪制(表1)。

2 結果

2.1 蟲體ITS rDNA的擴增結果

用保守引物NC5/NC2對蟲體的ITS rDNA進行PCR擴增，結果采自清遠某鵝場的2個樣品和以鴿蛔蟲作為陽性對照，均擴增出大小約1 100 bp的目的條帶(圖1)，與預期片段大小相符，無非特異性條帶出現。

M.DNA 標準DL 2 000;1.陰性對照；2.陽性對照；3.A.anseris-1；4.A. anseris-2

2.2 重組質粒的鑒定

將膠回收純化的目的片段連接至pMD-18T載體，轉化至DH5ɑ感受態(tài)細胞中。對構建的重組質粒按上述方法進行PCR擴增，得到和蟲體DNA條帶大小相同的片段。用限制酶EcoRⅠ單酶切，再用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ對構建的重組質粒進行雙酶切，雙酶切結果得到3條大小750 bp～800 bp、250 bp～350 bp和2 000 bp～3 000 bp的條帶，根據載體的酶切位點，限制酶EcoRⅠ和HindⅢ將目的片段切割成2個大小不同的片段(圖2)。

M1.DNA標準 DL 2 000；M2.DNA標準 DL 5 000；1.A.anseris-1；2.A.anseris-2

2.3 DNA序列的比對分析

2.3.1 序列測定比對以及同源性分析 核苷酸同源性分析結果見表2。

表2 鵝蛔蟲與蛔蟲代表性樣品的5.8 S rRNA基因的核苷酸同源性分析

對試驗獲得的鵝蛔蟲2個樣品的擴增結果，經測序后除去特異性引物和前后端載體的通用引物片段，均得到一段長度為1 009 bp的鵝蛔蟲ITS rDNA序列，該序列C+G含量為39.06%，包括ITS1、ITS2的大部分序列以及全長5.8 S rRNA基因的序列，2個鵝蛔蟲樣品ITS rDNA的序列同源性為100%，該序列提交至GenBank收錄登錄號為KC905802。與禽蛔科的其他蛔蟲一樣，試驗獲得的鵝蛔蟲5.8 S rRNA基因長度為157 bp的序列，ITS1長為475 bp，ITS2長為377 bp。在NCBI網站基于5.8 S rRNA基因的禽蛔科多種蛔蟲的Blast分析顯示，試驗獲得的鵝蛔蟲5.8 S rRNA基因與GenBank收錄的雞蛔蟲(登錄號為AJ001508)和鴿蛔蟲的(登錄號為：JQ995321)5.8 S rRNA基因核苷酸序列的同源性均為96%，與鴿蛔蟲(登錄號為：AJ001509)的同源性為93%。與本實驗室采集自佛山鴿蛔蟲(登錄號為：KF147909)[14]的同源性為91%。

使用DNA Star7.0軟件，通過Clustal W方法，將試驗獲得序列與GenBank收錄的蛔目不同科、屬的蛔蟲代表性樣品的5.8 S rRNA基因的核苷酸同源性比較結果見表2。

2.3.2 ITS rDNA序列的系統(tǒng)進化分析 試驗獲得的鵝蛔蟲ITS rDNA序列包括ITS1、ITS2的大部分序列以及全長5.8 S rRNA基因的序列，基于5.8 S rRNA基因和ITS1+5.8 S+ITS2繪制的蛔蟲系統(tǒng)發(fā)育樹分別見圖3和圖4。

圖3 基于5.8 S rRNA基因的鵝蛔蟲與其他相關蛔蟲的系統(tǒng)進化樹

圖4 基于ITS1+5.8 S+ITS2序列的鵝蛔蟲與其他相關蛔蟲的系統(tǒng)進化樹

3 討論

據陳淑玉等主編的《禽類寄生蟲學》記載，禽蛔科的雞蛔蟲(A.galli)可寄生于雞、鷓鴣、針尾鴨和番鴨的腸道，其特征是尾乳突10對，交合刺長度為0.65 mm～1.95 mm；鴿蛔蟲(A.columbae)可寄生于鴿、孔雀和山斑鳩，尾乳突為14對～15對，交合刺長度為1.76 mm～2.04 mm；前兩種是非常普遍的禽蛔蟲種類。而鵝蛔蟲寄生于鵝的小腸，尾乳突為13對～14對，交合刺長度約為0.82 mm，僅報道于我國和前蘇聯(lián)[1]。而對鵝蛔蟲種類的有效性，尚存在爭議。國外有學者認為鵝蛔蟲不是一個有效種，而是鴿蛔蟲的同物異名[4]。因此，在我們將試驗獲得鵝蛔蟲(A.anseris)ITS rDNA序列提交GenBank后，被認定為鴿蛔蟲(A.columbae)，登錄號為KC909582。一般認為，5.8 S rRNA基因具高度的保守性。試驗從鵝蛔蟲樣品擴增獲得的5.8 S rRNA基因與GenBank收錄的雞蛔蟲(登錄號為AJ001508)同源性為96%，而與不同地理株的鴿蛔蟲5.8 S rRNA基因核苷酸序列的同源性在91%～96%之間，這表明鵝蛔蟲是不同于鴿蛔蟲的一個獨立有效種，在系統(tǒng)發(fā)生關系上與雞蛔蟲更親近。

林輝環(huán)[15]首次在我國廣東報道了鵝蛔蟲的感染，認為鵝蛔蟲的形態(tài)跟雞蛔蟲相似，雄蟲體長65 mm，雌蟲體長91 mm，但其肛前吸盤周圍沒有輻射狀的結構, 翼較小, 肛后乳突只有2對，這些特征可與雞蛔蟲區(qū)別之。目前，在除廣東外，在貴州、浙江、湖南等地也有鵝感染蛔蟲(Ascaridia)的報道，但由于缺乏種類的詳細觀察，往往都稱之為禽蛔蟲或雞蛔蟲(A.galli)[16-18]。本試驗從廣東清遠鵝腸道采集的蛔蟲的形態(tài)特征與林輝環(huán)所描述的相似，初步確定為鵝蛔蟲。在形態(tài)學觀察的基礎上獲得了具有分類鑒定意義的鵝蛔蟲ITS rDNA序列，并藉此與蛔目的多個代表性蛔蟲種進行系統(tǒng)進化分析。結果顯示，不論是5.8 S rRNA基因和ITS1+5.8 S+ITS2都獲得了相近的系統(tǒng)進化關系樹形圖，證明禽蛔科的3種蛔蟲處于同一進化支，而鵝蛔蟲形成了相對獨立的進化分支。序列比對分析也發(fā)現，鵝蛔蟲、雞蛔蟲和鴿蛔蟲的ITS1序列相對保守，不同種類間的差異性小，種間同源性高達98%～100%。試驗獲得的鵝蛔蟲ITS rDNA序列資料反映了蟲種分子遺傳特征，為鵝蛔蟲的分子鑒定提供了依據。

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Species Analysis and ITS rDNA Molecular Characteristics ofAscaridiaanseris

LI Xin，TIAN Shou-long，HE Liu-fen，LIU Bai-qiang，JIA Jia，REN Shao-na，PU Wen-jun，ZHANG Hao-ji

(DepartmentofVeterinaryMedicine，FoshanUniversity，Foshan，Guangdong,528231，China)

In order to explore the species of theAscaridiaanseriscollected from the geese of Qingyuan,Guangdong provience,the conserved primers NC5 and NC2 were used to amplify the ITS rDNA of specimen ofAscaridiaanseriscollected from intestine of infected geese,and the recombinant plasmids were identified by polymerase chain reaction(PCR) and the products were sequenced.A 1 009 bp sequence in length of ITS rDNA ofA.anseris(KC905082) was obtained.Sequence Blast and phylogenetic analysis showed that the 5.8 S rDNA sequence ofA.anseriswas 96% identical with the same gene ofAscaridiagalli(AJ001508),and similarity was between 91% and 96% compared with specimens ofAscaridiacolumbaefrom different areas available in GenBank.TheA.anseris,A.galliandA.columbaerespectively grouped into each solitary clade.The results showed that theA.anserisis a independent valid species,which appeared to be closely related toA.gallion the phylogenetic relationship.

Ascaridiaanseris；ITS rDNA； PCR；sequence analysis

2016-08-25

廣東省教育廳科技創(chuàng)新項目 (2013KJCX0187)

李 欣(1992-)，女，福建三明人，碩士研究生，主要從事動物疾病防控研究。

S852.731;S858.33

A

1007-5038(2017)04-0019-05

*通訊作者