李帥斐,趙安琪,楊 末,于 雷,汪 洋

(吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118)

堿法提取聯(lián)合高溫和酶法改性米糠蛋白的研究

李帥斐,趙安琪,楊 末,于 雷*,汪 洋

(吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118)

以脫脂米糠為原料,氮溶指數(shù)為指標,通過均勻設計優(yōu)化堿法提取聯(lián)合高溫和酶法改性米糠蛋白工藝。得到最優(yōu)條件為:提取溫度50 ℃,高溫改性時間4 min,酶解時間120 min,改性后的米糠蛋白氮溶指數(shù)達到96.08%。在該條件下,改性米糠蛋白的持水性、持油性、乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了15.8%、165.7%、48.9%和84.7%。通過對米糠蛋白游離巰基和二硫鍵含量測定和SDS-PAGE電泳分析表明,堿法提取聯(lián)合高溫和酶法改性米糠蛋白可使米糠蛋白中二硫鍵含量減少,游離巰基含量增加,蛋白水解,溶解度增加,從而改善其功能特性。

米糠蛋白,提取,改性,氮溶指數(shù)

米糠是水稻加工過程中的副產(chǎn)物,產(chǎn)量巨大,但一般用作飼料和肥料,其利用價值大大降低。米糠含有12%～22%的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)含量僅次于燕麥而遠高于小麥和玉米[1]。米糠蛋白是一種優(yōu)質(zhì)廉價的植物蛋白,蛋白的氨基酸配比合理平衡,與FAO/WHO推薦模式相近,其中含有較多的賴氨酸,生物價高,具有較高的吸收率,這些是其他植物蛋白無法比擬的[2-3]。米糠蛋白是已知谷物中過敏性最低的蛋白質(zhì),可用于嬰幼兒食品中[4]。另外,米糠蛋白還具有降低膽固醇、抗動脈粥樣硬化、抗疲勞和抗癌等作用[5]。

米糠蛋白的功能性質(zhì)決定了其在食品中的應用,因此,有必要對米糠蛋白進行深入研究,使其能夠滿足食品加工的需要。大量研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)與溶解性關系密切,溶解性是持油性、乳化性和乳化穩(wěn)定性的主要決定因素,隨著蛋白質(zhì)溶解度的提高,蛋白質(zhì)的持油性、乳化性和乳化穩(wěn)定性也會得到相應提高[6]。氮溶解指數(shù)(nitrogen solubility index,NSI)是蛋白質(zhì)溶解度的常用表示方法之一。目前,國內(nèi)外對蛋白的提取主要采用堿法、酸法、酶法、鹽法和醇法,其中堿法提取時,堿能水解米糠中的氫鍵、酰胺鍵和二硫鍵,從而釋放更多的蛋白質(zhì),米糠蛋白的提取率大大提高[7]。在蛋白質(zhì)改性方面,物理改性費用低、作用時間短、無毒副作用及對產(chǎn)品營養(yǎng)性能影響小[8];酶法改性具有條件溫和,有害副產(chǎn)物少等優(yōu)點。本文采用堿法提取聯(lián)合高溫和酶法改性米糠蛋白,酶法改性使用堿性蛋白酶,米糠蛋白提取和改性始終處于堿性環(huán)境,實驗連續(xù)進行,操作簡便。通過測定游離巰基和二硫鍵含量以及電泳分析初步研究了米糠蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的關系,為改性米糠蛋白在食品中的應用提供理論和技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮米糠(含蛋白質(zhì)15.66%) 吉林省萬昌米業(yè)有限公司;品上品笨榨大豆油 市售;堿性蛋白酶(酶活 20萬U) 上海源葉生物科技有限公司;牛血清白蛋白 鹽城賽寶生物科技有限公司;電泳試劑盒(WB-0201) 北京鼎國昌盛生物技術有限公司;考馬斯亮藍R250、Tris、SDS、甘氨酸 電泳級;其他試劑 均為分析純。

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;DYCZ-24D電泳槽 北京六一儀器廠;PHS-3D pH計 上海精密科學儀器有限公司;FD-1B-80冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;RH-800粉碎機 浙江榮浩工貿(mào)有限公司;BSA124S-CW分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;JY04S-3C凝膠成像儀 北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠蛋白的提取 用粉碎機將新鮮脫脂米糠粉碎,過100目篩,取米糠粉20 g加入180 mL水,攪拌均勻,調(diào)節(jié)pH為10,在設定溫度下提取90 min。然后在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min,得到上清液[9]。

1.2.2 改性米糠蛋白的制備 將上述上清液調(diào)節(jié)pH至4.5,在4000 r/min離心20 min,棄去上清液,將沉淀凍干備用,得到堿提蛋白;

將上述上清液在95 ℃下加熱一定時間,冷卻至室溫,再調(diào)節(jié)pH至4.5,在4000 r/min離心20 min,棄去上清液,將沉淀凍干備用,得到高溫改性蛋白;

將上述上清液加入4000 U/g的堿性蛋白酶,在60 ℃和一定pH條件下酶解一定時間,滅酶并冷卻至室溫,最后調(diào)節(jié)pH至4.5,在4000 r/min離心20 min,棄去上清液,將沉淀凍干備用,得到酶法改性蛋白;

將上述上清液在95 ℃下加熱一定時間,冷卻至60 ℃,加入4000 U/g的堿性蛋白酶在酶解一定時間,滅酶并冷卻至室溫,最后調(diào)節(jié)pH至4.5,在4000 r/min離心20 min,棄去上清液,將沉淀凍干備用,得到高溫和酶法聯(lián)合改性蛋白。

1.2.3 實驗設計 通過預實驗得到對米糠蛋白氮溶指數(shù)影響最重要的三個因素:提取溫度、高溫改性時間和酶解時間。采用均勻設計實驗來優(yōu)化提取改性的最優(yōu)條件。實驗因素和水平見表1。

表1 均勻設計實驗因素與水平

根據(jù)3因素和5水平,選取均勻設計表U5(53),進行五組實驗,以NSI為指標選出最優(yōu)的條件。

1.2.4 NSI的測定 改進劉穎等[10]的方法,取20 mL水解液,加蒸餾水至50 mL,在25 ℃下振蕩2 h,然后定容至100 mL,混勻后靜置2 min,將上層液體在4000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液用Folin-酚法測定蛋白含量,根據(jù)下式計算氮溶指數(shù)NSI:

式(1)

式中:A-上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量;B-測定前蛋白質(zhì)質(zhì)量。

1.2.5 持水性的測定 準確稱取m1(約為0.5 g)的米糠蛋白樣品至已知質(zhì)量m2的離心管中,再加10 mL的蒸餾水,混合均勻后在室溫下靜置30 min,然后在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,棄去上清液,將沉淀和離心管一起稱重,記為m3,持水性為每克米糠蛋白結(jié)合水的克數(shù),如下式(2)計算持水性[11]。

式(2)

1.2.6 持油性的測定 準確稱取米糠蛋白樣品m1(約0.6 g)于已知質(zhì)量m2的離心管中,加入4 mL大豆油,用玻璃棒輕輕攪拌至無明顯顆粒,再用移液管取2 mL大豆油沖洗玻璃棒和離心管壁,在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min,除去上層未吸附的大豆油,最后稱量離心管和沉淀總質(zhì)量,記為m3。按下式(3)計算蛋白質(zhì)的持油性[12]。

式(3)

1.2.7 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 改進江志煒[13]的方法,準確稱取0.25 g蛋白樣品,加入0.1 mol/L pH為7.5的磷酸鹽緩沖液20 mL,然后再加入10 mL大豆油,于均質(zhì)機中均質(zhì)2 min,立即從容器底部吸取50 μL,加入7 mL 0.1%的SDS溶液,混勻后在500 nm波長處測定吸光度值,以SDS溶液作為空白。室溫放置10 min后再次從底部取樣測定。米糠蛋白的乳化性(EAI)及其乳化穩(wěn)定性(ESI)分別按下式(4)和式(5)計算:

式(4)

式(5)

式中:C-樣品濃度(g/mL);φ-乳化液中油相的比例;ΔT-為10 min;L-比色杯光徑;A0-初始乳化液的吸光度值;A10-10 min時乳化液吸光度值。

1.2.8 巰基和二硫鍵含量的測定 采用羅明江等的Ellman’s試劑比色法[14]。

1.2.9 SDS-PAGE電泳 采用15%的分離膠和5%的濃縮膠對改性前后的米糠蛋白進行電泳分析。先采用100 V,50 mA,當條帶移動到分離膠時改為120 V,80 mA。結(jié)束后采用考馬斯亮藍R-250進行染色1 h,然后用脫色液進行脫色。待脫色完全后,利用膠凝膠成像儀進行照相。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理 該實驗中相關的實驗均設3次重復,實驗結(jié)果取平均值。數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0分析軟件進行分析,設置顯著性水平設置為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Folin-酚法測定蛋白的標準曲線

以牛血清白蛋白作為標樣,繪制蛋白的標準曲線,見圖1。根據(jù)標準曲線可以計算出均勻設計中各組實驗的NSI,再根據(jù)NSI進行最優(yōu)組合的選擇。

圖1 Folin-酚試劑法測蛋白的標準曲線Fig.1 Standard curve to measure protein in Folin-phenol reagent method

2.2 均勻設計實驗

表2為以NSI為指標的均勻設計實驗結(jié)果,利用回歸分析法對表2的實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析可知,實驗指標氮溶指數(shù)NSI與3個因素之間滿足線性關系。利用Excel進行回歸統(tǒng)計的結(jié)果見表3。

表2 均勻設計實驗結(jié)果

表3 回歸分析結(jié)果

注:復相關系數(shù)R=0.9999,R2=0.9999,significanceF=0.008274013,*表示影響顯著,**表示影響極顯著。

由表3的復相關系數(shù)R=0.9999,R2=0.9999,以及方差分析結(jié)果significanceF<0.01,說明該回歸方程非常顯著。由表3分析結(jié)果可知,回歸方程可寫為:

y=85.96+0.119A-1.93B+0.1015C

對偏回歸系數(shù)進行t檢驗時,︱t︱越大,所對應的偏回歸系數(shù)越顯著,相應的因素也越重要。根據(jù)表3中t檢驗的結(jié)果,可知因素的主次順序為B>C>A。即高溫改性時間>酶解時間>提取溫度。由回歸方程可知,A和C的系數(shù)為正,表明實驗指標氮溶指數(shù)隨著因素A提取溫度和C酶解時間的增加而增加;B的系數(shù)為負,說明氮溶指數(shù)隨著因素B高溫改性時間的增加而減小。可能是由于當提取溫度適當增加時,蛋白分子的構(gòu)象輕微的改變,立體結(jié)構(gòu)伸展,有利于蛋白分子和水分子的運動和相互作用,從而起到了增溶的作用;高溫改性時間作用過長,米糠蛋白部分變性,破壞了空間結(jié)構(gòu),分子內(nèi)部的疏水基團暴露,分子間相互凝結(jié)沉淀,從而起到減溶的作用[15]。酶法改性是通過切斷或者修飾蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈及肽鏈,去除蛋白質(zhì)的疏水性基團,破壞高級結(jié)構(gòu),隨著酶解時間的增加,蛋白質(zhì)大分子變小,更多的親水性氨基酸殘基能夠遇水接觸,達到增溶的作用,但是水解時間過長會造成過度水解,使高級結(jié)構(gòu)破壞而致使其他功能特性下降[16]。所以,在確定最優(yōu)方案時,因素A提取溫度和C酶解時間的取值應偏上限,因素B高溫改性時間的取值應偏下限,再根據(jù)實驗情況和以上綜合因素,得到優(yōu)方案為:提取溫度50 ℃、高溫改性時間4 min、酶解時間120 min。將以上各值帶入回歸方程得到氮溶指數(shù)y=96.37%,這一結(jié)果高于表2的五個結(jié)果。

2.3 均勻設計驗證實驗

按照上述的優(yōu)化結(jié)果即提取溫度50 ℃、高溫改性時間4 min、酶解時間120 min進行三次重復實驗,得到米糠蛋白的氮溶指數(shù)平均值為96.08%,與預測值基本吻合。聯(lián)合改性米糠蛋白的提取率為74.63%,純度為71.75%。

2.4 改性前后米糠蛋白的持水性和持油性比較

從圖2可以看出,以堿法提取的米糠蛋白作為對照,高溫改性使米糠蛋白的持水性增加,酶法改性使持水性降低,而高溫和酶法聯(lián)合改性使米糠蛋白的持水性增加。這可能是因為加熱破壞了米糠蛋白原有的具有高度規(guī)則性及緊密排列方式的蛋白質(zhì)肽鏈,變?yōu)椴灰?guī)則的松散排列方式使持水性增加[17];在堿性蛋白酶的作用下,米糠蛋白逐漸由大分子變?yōu)樾》肿?其氮溶指數(shù)增加,更多的蛋白溶于水中,使米糠蛋白的持水性降低[18]。在高溫和酶法聯(lián)合改性時,高溫改性彌補了酶法改性的這一缺點,聯(lián)合改性使米糠蛋白持水性升高。

圖2 堿提蛋白與三種改性蛋白的持水性和持油性比較Fig.2 Comparison on water and oil holding capacity of alkaline extraction protein and three modified proteins

蛋白的持油性與物理截留作用關系密切,高溫和酶法改性后,由于熱的作用,埋藏在球狀分子內(nèi)部的非極性側(cè)鏈由于離解和開鏈導致轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)分子表面,酶解的作用也是蛋白分子適度展開并由大分子變?yōu)樾》肿?比表面積變大,進而對油脂截留作用變大,最后使米糠蛋白具有較高的持油能力。高溫改性和酶法改性都使米糠蛋白的持油性增加,而高溫和酶法聯(lián)合改性使米糠蛋白的持油性達到最高。

2.5 改性前后米糠蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性比較

由圖3可以看出,高溫和酶法聯(lián)合改性使米糠蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性最高。乳化性是指蛋白質(zhì)將油和水結(jié)合在一起形成乳狀液的能力,由于可溶性蛋白質(zhì)能夠擴散并吸附在油/水界面是決定蛋白質(zhì)乳化性質(zhì)的重要特性之一,因此蛋白質(zhì)的高溶解度對其乳化性非常有益[19]。乳化性和乳化穩(wěn)定性增加的原因可能是高溫和酶法聯(lián)合改性后米糠蛋白的氮溶指數(shù)顯著增加,溶解性的增加使溶液中的蛋白濃度增加,增加界面膜的厚度,從而提高膜的強度,增加米糠蛋白的乳化性及其穩(wěn)定性[20]。

圖3 堿提蛋白與三種改性蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性比較Fig.3 Comparison on emulsification and emulsion stability of alkaline extraction protein and three modified proteins

2.6 巰基和二硫鍵的變化

米糠蛋白的溶解性差是因為其蛋白分子之間有較強的聚合和大量的二硫鍵交聯(lián)。由圖4可以看出，通過高溫改性之后,米糠蛋白游離巰基和二硫鍵變化不明顯,可能是由于加熱使米糠蛋白分子緊密結(jié)構(gòu)發(fā)生適度的展開,但二硫鍵沒有破壞。這與高溫改性米糠蛋白的持水性增加相一致。酶法改性使米糠蛋白的游離巰基增加,二硫鍵大大減少,這與酶法改性使米糠蛋白大分子裂解,氮溶指數(shù)增加,乳化性和持油性增加相一致。這是由于堿性蛋白酶對米糠蛋白分子的酶解作用,使蛋白由大分子變?yōu)樾》肿?使二硫鍵斷裂,游離巰基增加。高溫和酶法聯(lián)合改性米糠蛋白,二硫鍵含量減少和游離巰基含量增加的效果比酶法改性明顯,說明聯(lián)合改性破壞了米糠蛋白的二硫鍵,有利于米糠蛋白的溶出使溶解性提高,乳化性和乳化穩(wěn)定性增強;有利于規(guī)則緊密的肽鏈松散使持水性和持油性增加。這可能是由于高溫導致蛋白分子的展開,蛋白的展開增加了酶跟底物接觸的可能性,進而有利于酶解[21]。

圖4 堿提蛋白與三種改性蛋白的游離巰基和二硫鍵比較Fig.4 Comparison on free thiol groups and disulfide content of alkaline extraction protein and three modified proteins

2.7 SDS-PAGE電泳

由圖5可知,與堿法提取蛋白相比,高溫改性蛋白分子量變化不明顯,而酶法改性蛋白和高溫及酶法聯(lián)合改性在大分子區(qū)明顯減少,在小分子區(qū)明顯增多,改性后米糠蛋白分子質(zhì)量主要為14.4 kDa以下,有利于米糠蛋白的消化吸收。這說明高溫改性使米糠蛋白分子展開;酶法改性使米糠蛋白分子由大分子變?yōu)樾》肿?這對高溫改性降低溶解性,酶法改性增加溶解性,提高持油性、乳化性和乳化穩(wěn)定性做出了解釋。由于高溫和酶法聯(lián)合改性使米糠蛋白分子裂解,蛋白由大分子變?yōu)樾》肿?有利于氮溶指數(shù)的提高,高溶解度使溶液中米糠蛋白的濃度提高,從而使其乳化性和乳化穩(wěn)定性增高。高溫和酶法聯(lián)合使米糠蛋白變性,暴露了許多內(nèi)在基團,如肽鍵和極性側(cè)鏈,從而使得蛋白質(zhì)的親水性和親油性都得到了提高[22]。

圖5 堿提蛋白與三種改性蛋白的電泳圖比較Fig.5 Comparison on electrophoresis of alkaline extraction protein and three modified proteins注:M. Marker,1.堿提蛋白,2.高溫改性蛋白,3.酶法改性蛋白,4.高溫酶法聯(lián)合改性蛋白。

3 結(jié)論

通過均勻設計實現(xiàn)了對米糠蛋白的堿法提取與高溫和酶法聯(lián)合改性工藝的優(yōu)化,得到了最佳工藝條件:提取溫度50 ℃,高溫改性時間4 min,酶解時間120 min。堿法提取聯(lián)合高溫和酶法改性米糠蛋白,使米糠蛋白的溶解性、持水性、持油性、乳化性和乳化穩(wěn)定性得到了顯著提高。這是由于提取與改性共同作用可使米糠蛋白中二硫鍵含量減少,游離巰基含量增加,米糠蛋白大分子轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿铀隆?/p>

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Study on alkaline extraction joint heat and enzymatic modification of rice bran protein

LI Shuai-fei,ZHAO An-qi,YANG Mo,YU Lei*,WANG Yang

(College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)

The rice bran protein was alkaline extracted jointing with heat and enzymatic modification by using fresh defatted rice bran as raw materials and nitrogen solubility index as index. The process was optimized by uniform design. The best conditon parameters were as follows:extraction temperature 50 ℃,heat modification time 4 min and enzymatic reaction time 120 min. The nitrogen solubility index of modified rice bran protein reached 96.08%. Under the optimum conditions,water absorption,oil absorption,emulsion and emulsion stability were increased by 15.8%,165.7%,48.9%and 84.7%,respectively. Finally,free thiol groups and disulfide bonds determination and SDS-PAGE electrophoresis indicated that alkaline extracted and heat and enzymatic modified rice bran protein increased its functional properties by decreasing disulfide bonds,increasing free thiol groups,which led to the hydrolysis of rice bran protein and improvement of solubility.

rice bran protein;extraction;modification;nitrogen solubility index

2016-07-25

李帥斐(1990-)，男，碩士，研究方向：食品科學，E-mail:704609828@qq.com。

*通訊作者:于雷(1973-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學，E-mail:354038827@qq.com。

TS201.1

A

1002-0306(2017)06-0153-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.021