孟維一,黃明泉,孫寶國,鄭福平,孫金沅,孫嘯濤,李賀賀

(1.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京工商大學(xué),北京 100048;2.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京工商大學(xué),北京 100048)

HS-SPME結(jié)合GC-O-MS技術(shù)分析不同大曲中的香氣活性化合物

孟維一,黃明泉*,孫寶國,鄭福平,孫金沅,孫嘯濤,李賀賀

(1.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京工商大學(xué),北京 100048;2.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京工商大學(xué),北京 100048)

通過頂空-固相微萃取(HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜(GC-O-MS)聯(lián)用技術(shù),研究了大曲的香氣成分,同時(shí)考察了萃取頭、萃取時(shí)間、萃取溫度和樣品量對大曲樣品中揮發(fā)性成分分析的影響。結(jié)果表明:取1.5 g樣品在50 ℃下平衡10 min后,用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭在50 ℃下萃取30 min,萃取效果較好;在此條件下分析大曲樣品,7種大曲中共檢出69種揮發(fā)性成分,包括醇類9種、酯類13種、醛類8種、酮類4種、酸類3種、吡嗪類9種、芳香族類8種、酚類5種、雜環(huán)類2種、烷烴類3種和其他類5種;采用GC-O-MS檢出17種為香氣活性化合物,定性出14種化合物,其中2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、苯乙醛是OAV值較大且香氣強(qiáng)度較大的香氣活性化合物,貢獻(xiàn)了烤土豆香、蜂蜜香、甜香,綜合組成了大曲獨(dú)特的風(fēng)味。

大曲,頂空-固相微萃取,氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜,風(fēng)味活性化合物,香氣活性值

大曲是以小麥為主要原料制成的形狀較大的、且含有多種菌類和酶類物質(zhì)的曲塊[1]。大曲自古就有“酒之骨”之稱,是大曲酒釀造生產(chǎn)中的重要物質(zhì),是釀酒生產(chǎn)的糖化、發(fā)酵、酒化和生香劑,含有多種微生物及其酶,其品質(zhì)對大曲酒的出酒率和酒質(zhì)都有極大的影響[2]。目前,對大曲的研究主要集中于其微生物功能和多樣性及曲中的酶[3-4],同時(shí)實(shí)際生產(chǎn)中對大曲的質(zhì)量多從糖化力、發(fā)酵力、液化力、酯化力、淀粉含量等方面進(jìn)行考察和控制[5],對大曲風(fēng)味關(guān)注較少。另外,對大曲揮發(fā)性成分的研究中,張春林等[6]對瀘州老窖濃香型大曲的研究表明,其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中含量較高的是醇類、酯類和酮類化合物,另外還含有一些吡嗪類化合物。并且張春林等[7]對其香氣活性成分進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)己醛、苯乙醛,4-乙基愈創(chuàng)木酚和一種未知物對大曲風(fēng)味貢獻(xiàn)大,可為濃香型白酒香味成分的來源提供參考依據(jù)。這表明,大曲的風(fēng)味對酒的品質(zhì)也有重要的影響,因此對大曲風(fēng)味的研究具有重要意義。

目前,揮發(fā)性成分常用的前處理方法有溶劑輔蒸餾萃取法(SAFE)、液液萃取法(LLE)、同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)和頂空-固相微萃取法(HS-SPME)。HS-SPME無需溶劑,集采樣、萃取、進(jìn)樣于一體,靈敏度高,選擇性好,能方便快捷地分離鑒定食品中的風(fēng)味物質(zhì)[8-13]。氣相色譜-嗅聞檢測技術(shù)(GC-O)以人的鼻子作為檢測器,能有效地在眾多揮發(fā)性化合物中找到真正對食品風(fēng)味有貢獻(xiàn)的活性化合物,因此,近年來被廣泛應(yīng)用于食品研究中[14-20]。例如,鄭楊等[19]利用GC-O技術(shù)分析了芝麻香型白酒中的關(guān)鍵香氣化合物,發(fā)現(xiàn)3-甲硫基丙醛、二甲基三硫醚、3-甲基丁醛等對芝麻香白酒風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)。香氣活性值(Odor activity value,OAV)是評價(jià)香氣化合物重要性的一個(gè)指標(biāo),是物質(zhì)的濃度與香氣閾值之比,能更好的衡量一個(gè)香氣物質(zhì)對大曲的香氣貢獻(xiàn)大小。化合物的OAV值大于或者等于1 則對樣品香氣組成有貢獻(xiàn),OAV值越大,該香氣化合物貢獻(xiàn)越大[21]。因此,可以通過對風(fēng)味活性物質(zhì)OAV值的比較,來分析各風(fēng)味活性物質(zhì)對大曲整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)大小。

本文以兩個(gè)芝麻香白酒廠家的7種大曲樣品為原料,通過頂空-固相微萃取和氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜檢測聯(lián)用技術(shù)對其揮發(fā)性成分進(jìn)行定性和半定量分析,采用頻率法和強(qiáng)度法鑒定了大曲的風(fēng)味活性物質(zhì),結(jié)合香氣活性值(OAV)確定了其中的關(guān)鍵香氣活性成分,本文的研究可為建立芝麻香白酒大曲的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1號廠家大曲(6月曲B1、7月曲B2、8月曲B3) 山東扳倒井股份有限公司;2號廠家大曲(低溫曲J1、中溫曲J2、高溫曲J3、醬香曲J4) 山東景芝酒業(yè)股份有限公司;2-辛醇標(biāo)樣(色譜純,純度>98.0%) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;氯化鈉(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;ODP3嗅聞儀 德國Gerstel公司;DB-WAX(60 m×0.250 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱 美國Agilent公司;SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄及50/30 μm DVB/CAR/PDMS,65 μm PDMS/DVB,75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭 美國SUPELCO公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 將采集到的冷凍儲(chǔ)存的大曲塊粉碎后過40目篩,在密封冷藏保存,待萃取分析。

1.2.2 頂空固相微萃取 稱取一定量大曲樣品于20 mL頂空瓶中,加入5 mL飽和NaCl溶液和50 μL內(nèi)標(biāo)(0.50 μg/mL 2-辛醇,溶劑:無水乙醇),蓋上瓶蓋。在一定溫度下平衡10 min,將老化后的萃取頭插入樣品瓶中,頂空吸附一定時(shí)間,然后250 ℃解析5 min后,進(jìn)行GC-MS分析。為防止樣品間相互污染,每次樣品萃取前,纖維萃取頭都在250 ℃老化20 min。

1.2.3 萃取頭對萃取效果的影響 稱取0.5 g大曲樣品于20 mL頂空瓶中,加入5 mL飽和NaCl溶液和50 μL內(nèi)標(biāo)(0.50 μg/mL 2-辛醇,溶劑:無水乙醇),蓋上瓶蓋。在40 ℃下平衡10 min,將老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶中,頂空吸附30 min,然后250 ℃解析5 min后,進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.4 萃取時(shí)間對萃取效果的影響 稱取0.5 g大曲樣品于20 mL頂空瓶中,加入5 mL飽和NaCl溶液和50 μL內(nèi)標(biāo)(0.50 μg/mL 2-辛醇,溶劑:無水乙醇),蓋上瓶蓋。在40 ℃下平衡10 min,將老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶中,頂空吸附10、20、30、40、50 min,然后250 ℃解析5 min后,進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.5 萃取溫度對萃取效果的影響 稱取0.5 g大曲樣品于20 mL頂空瓶中,加入5 mL飽和NaCl溶液和50 μL內(nèi)標(biāo)(0.50 μg/mL 2-辛醇,溶劑:無水乙醇),蓋上瓶蓋。在30、40、50、60 ℃下平衡10 min,將老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶中,頂空吸附30 min,然后250 ℃解析5 min后,進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.6 樣品量對萃取效果的影響 稱取0.5、1.0、1.5、2.0 g大曲樣品于20 mL頂空瓶中,加入5 mL飽和NaCl溶液和50 μL內(nèi)標(biāo)(0.50 μg/mL 2-辛醇,溶劑:無水乙醇),蓋上瓶蓋。在50 ℃下平衡10 min,將老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶中,頂空吸附30 min,然后250 ℃解析5 min后,進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.7 GC-MS分析 GC條件:DB-WAX型毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:40 ℃保持3 min,以3 ℃/min升至150 ℃,保持2 min,以7 ℃/min升至230 ℃,保持5 min;載氣(He)流速1.0 mL/min,進(jìn)樣口溫度250 ℃;不分流進(jìn)樣。

MS條件:電子轟擊離子源;電子能量70 eV;傳輸線溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;掃描模式為全掃描,質(zhì)量掃描范圍m/z 30～550。

1.2.8 GC-O-MS分析 GC-O-MS是由氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890B-5977A)和嗅聞儀(ODP3)裝置組成。樣品經(jīng)進(jìn)樣口解析5 min后,經(jīng)GC分離后分別進(jìn)入質(zhì)譜檢測器和嗅聞檢測器,分流比為1∶1,嗅聞口溫度210 ℃,檢測時(shí)為了防止實(shí)驗(yàn)員鼻腔干燥通入濕潤的空氣。GC-O實(shí)驗(yàn)由三個(gè)感官評價(jià)員完成,每名評價(jià)人員對每個(gè)樣品至少嗅聞3次。感官評價(jià)人員在嗅聞過程中描述香氣化合物的氣味特征及強(qiáng)度(1=微弱的,可識別的味道;2=清晰,但不強(qiáng)烈的味道;3=強(qiáng)烈的味道;4=非常強(qiáng)烈的味道),只有被兩名以上的評價(jià)人員嗅聞到的化合物才能被確定為風(fēng)味活性物質(zhì)。

1.2.9 定性定量分析

1.2.9.1 定性分析 以NIST11譜庫檢索結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品比對(保留時(shí)間定性)及保留指數(shù)定性對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)品比對即在相同的色譜條件下,比較待測物與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間是否一致來判斷是否為同一個(gè)化合物?；衔锏谋Ａ糁笖?shù)(Retention Index,RI)通過正構(gòu)烷烴(C6～C30)計(jì)算得到,與文獻(xiàn)中報(bào)道(查閱NIST11譜庫檢索RI數(shù)據(jù)庫)的RI值相比較,RI按以下公式計(jì)算:

式中:RI值為樣品a的保留指數(shù)值;ta為樣品a保留時(shí)間(min)(在正構(gòu)烷烴Cn和Cn+1之間);tn為正構(gòu)烷烴Cn保留時(shí)間(min);tn+1為正構(gòu)烷烴Cn+1保留時(shí)間(min)。

1.2.9.2 定量分析 通過內(nèi)標(biāo)(2-辛醇)對大曲中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了半定量分析,即在大曲樣品進(jìn)行固相微萃取時(shí)加入2-辛醇,根據(jù)添加的2-辛醇的量、揮發(fā)性化合物的色譜峰面積及2-辛醇的色譜峰面積,計(jì)算出每一種揮發(fā)性化合物相對于2-辛醇的含量,相對響應(yīng)因子假定為1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行相應(yīng)數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萃取頭對萃取效果的影響

不同萃取頭對萃取效果的影響如圖1所示。從圖1可知,50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取的揮發(fā)性成分總峰面積最大,峰個(gè)數(shù)也是最多,是較優(yōu)的萃取頭,這和文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致。

圖1 萃取頭對萃取效果的影響Fig.1 Effect of fiber type on volatile extraction

2.2 不同萃取時(shí)間對萃取效果的影響

不同萃取時(shí)間對萃取效果的影響如圖2所示。由圖2可知,隨著萃取時(shí)間延長,即從10 min增加到30 min時(shí),萃取物總峰面積和峰個(gè)數(shù)逐漸增加;但當(dāng)萃取時(shí)間繼續(xù)延長時(shí),總峰面積稍有增加,但不明顯,吸附和解析趨于平衡。因此,綜合考慮實(shí)驗(yàn)效率,選取萃取時(shí)間30 min為較優(yōu)的萃取時(shí)間。

圖2 萃取時(shí)間對萃取效果的影響Fig.2 Effect of time on volatile extraction

2.3 不同萃取溫度對萃取效果的影響

不同萃取溫度對萃取效果的影響如圖3所示。由圖3可知,隨著溫度的升高,總峰面積和峰個(gè)數(shù)逐漸增加,在50 ℃時(shí)達(dá)到最大;但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高到60 ℃時(shí),萃取效果反而變差,總峰面積較50 ℃減少,峰個(gè)數(shù)不變。這是因?yàn)閷τ陧斂展滔辔⑤腿《?溫度升高,有機(jī)成分的揮發(fā)性增強(qiáng),頂空氣相濃度增加,有利于吸附,但當(dāng)溫度太高時(shí),吸附在萃取頭上的揮發(fā)性成分解析速度也大大加快了,導(dǎo)致其吸附能力下降。因此,選取50 ℃為較優(yōu)的萃取溫度。

圖3 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.3 Effect of temperature on volatile extraction

2.4 不同樣品量對萃取效果的影響

不同樣品量對萃取結(jié)果的影響如圖4所示。由圖4可知隨樣品量的增加,萃取物總峰面積和峰個(gè)數(shù)也隨之增加,在樣品量1.5 g時(shí)達(dá)到最大,而繼續(xù)加大樣品量,萃取效果變差,總峰面積減少,峰個(gè)數(shù)只有微弱增加。因?yàn)檩腿☆^吸附揮發(fā)性成分是有限度的,大曲樣品量增加,頂空氣相揮發(fā)性成分濃度也增加,在相同的萃取時(shí)間內(nèi),纖維萃取頭很快達(dá)到吸附飽和,此時(shí)解析速度加快,在剩下的萃取時(shí)間內(nèi),解析速度會(huì)高于吸附速度,導(dǎo)致纖維萃取頭吸附量下降。因此,綜合考慮,選取樣品量為1.5 g。

圖4 樣品量對萃取效果的影響Fig.4 Effect of sample weight on volatile extraction

綜上所述,固相微萃取較優(yōu)的萃取條件為:樣品1.5 g,萃取頭類型 50/30 μm DVB/CAR/PDMS,萃取溫度50 ℃,萃取時(shí)間30 min。

2.5 GC-MS分析大曲中揮發(fā)性化合物

利用優(yōu)化好的頂空固相微萃取條件對大曲樣品進(jìn)行萃取,然后進(jìn)行GC-MS分析,分析結(jié)果如表1所示。

表1 不同廠家七種大曲揮發(fā)成分HS-SPME-GC-MS分析結(jié)果

續(xù)表

注:RIL:文獻(xiàn)中化合物的保留指數(shù);n.a.:譜庫中未查到該化合物的保留指數(shù);MS:使用NIST11檢索定性,匹配度大于 85%;RI:保留指數(shù)定性;S:標(biāo)準(zhǔn)品比對定性;-:未檢出；表2同。

由表1分析結(jié)果可知,采用HS-SPME-GC-MS分析了7種大曲樣品,共檢出69種揮發(fā)性化合物;在大曲樣品B1中化合物的數(shù)量最多,共檢出50個(gè),而B3樣品中化合物的數(shù)量最少,只檢出38個(gè),其余的5種大曲樣品化合物的檢出數(shù)量相當(dāng);揮發(fā)性成分可分為醇類(9種)、酯類(13種)、醛類(8種)、酮類(4種)、酸類(3種)、吡嗪類(9種)、芳香族類(8種)、酚類(5種)、雜環(huán)類(2種)、烷烴類(3種)和其他類(5種)。

在檢測到的揮發(fā)性化合物中,酯類化合物的數(shù)量最多。7種大曲樣品中酯類化合物的含量介于1.34～280.86 ng/g,其中J1和J2大曲樣品中的酯類化合物最多,并且這兩種大曲樣品的酯類化合物與其他大曲樣品相比,其相對含量也最大,分別達(dá)35.7%、23.9%?？梢?對于2號廠家的四種大曲,低溫曲和中溫曲中的酯類化合物較多,而高溫曲和醬香曲中相對較少。棕櫚酸甲酯在7種大曲樣品中都有檢出,且含量都相對較高。十四酸甲酯除了J4樣品外,在其他樣品中都有檢出。同時(shí),己酸甲酯在檢測到的大曲樣品中含量均較高。酯類成分主要是在大曲的培菌發(fā)酵和貯存期間,由酵母菌和其它微生物利用醇類物質(zhì)和羧酸類物質(zhì)合成的[23]。這些化合物絕大多數(shù)同樣在白酒中也被檢測出,這些物質(zhì)可能對白酒的風(fēng)味有一定影響[24-25]。

在檢測到的揮發(fā)性化合物中,醇類和吡嗪類化合物的數(shù)量也居于第二位。7種大曲樣品中B1大曲樣品中的醇類化合物最多,同時(shí)1號廠家大曲樣品中的醇類物質(zhì)多于2號廠家。1-辛烯-3-醇、2,3-丁二醇這兩種化合物在7種大曲中均有檢出,1-辛醇也在絕大多數(shù)大曲樣品中都有檢出。2,3-丁二醇在7種大曲中的含量較其他醇類物質(zhì)相對較高。對于同一廠家的不同類別曲,其醇類物質(zhì)數(shù)量基本接近,差別不大。一般來說,醇類物質(zhì)的產(chǎn)生主要是由于大曲發(fā)酵期間有氧條件下的糖類物質(zhì)的降解或者微氧條件下的氨基酸降解產(chǎn)生。由于大曲原料富含豐富的氨基酸類物質(zhì),酵母能夠利用氨基酸通過代謝途徑合成醇類物質(zhì)[23];另外,酵母降解醛類物質(zhì)也能生成醇類物質(zhì)[23]。對于吡嗪類化合物,7種大曲樣品中,B1、B2樣品的吡嗪類化合物最多,其中B1樣品相對其他6種曲樣中吡嗪類化合物的含量也最大,同時(shí)1號廠家樣品的吡嗪類化合物個(gè)數(shù)多于2號廠家,并且2號廠家的中溫曲吡嗪類化合物數(shù)量最少。2,6-二甲基吡嗪、3-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪這三種化合物在7種大曲樣品中均有檢出,并且3-甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪這兩種化合物在7種大曲中含量均較大。吡嗪類化合物的來源可能是大曲生產(chǎn)過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)形成,由于大曲在培菌發(fā)酵期間溫度會(huì)達(dá)到50 ℃以上,這樣高的溫度有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行,促使大量含氮類化合物生成[23]。

芳香族類和醛類化合物在被檢測的大曲中數(shù)量也較大。對于7種大曲樣品中芳香族類化合物,其含量介于1.22 ng/g到324.34 ng/g之間,其中苯乙醇含量在7種大曲樣品中較其他芳香類物質(zhì)含量是最高的,該化合物可由釀酒酵母大量合成[26]。同時(shí)苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛和2,4-二叔丁基苯酚這五種芳香族化合物在7種大曲中均被檢測出。此外,苯甲酸甲酯、苯乙酸甲酯、苯乙酸乙酯在大多數(shù)大曲中均被檢出。其次是苯甲醛含量也較高。個(gè)別芳香族化合物如愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚僅在J1樣品中檢出,2-羥基-6-甲基苯甲醛僅在J2樣品中檢出,但其含量較大。對于醛類物質(zhì),J4樣品中檢測到的醛類物質(zhì)最多,同時(shí)2號廠家大曲樣品的醛類物質(zhì)較多。己醛、壬醛、反-2-辛烯醛這3種醛在7種大曲樣品中均有檢出,并且在7種大曲樣品這3種醛的含量也較大。大曲中醛類物質(zhì)的產(chǎn)生可由微生物降解大曲原料中的淀粉類物質(zhì),在糖酵解過程中產(chǎn)生,特別可能是在酵母的作用下產(chǎn)生[27]。

在大曲樣品中,還檢測出茴香腦、草蒿腦這兩種化合物。在J2、J3和J4樣品中茴香腦的含量均很高,分別是55.52、91.66和78.2 ng/g,說明2號廠家的高溫曲和醬香曲中茴香腦的含量較高,同時(shí),草蒿腦只在高溫曲中被檢出。另外,萘和1-石竹烯在部分樣品中也有檢出。

7種大曲樣品各自分別檢出的化合物含量箱線圖如圖5所示。由圖5可知,7種大曲樣品呈現(xiàn)相同的趨勢,樣品中揮發(fā)性化合物的含量分布在1.34 ng/g到57.01 ng/g之間。每種樣品中位數(shù)線分布在10 ng/g左右,呈現(xiàn)明顯的拖尾,說明樣品中化合物含量在10 ng/g以上的有約50%,且含量跨度較大,圖中的異常值就表明大曲中個(gè)別揮發(fā)性化合物的含量很高。對1號廠家的B1、B2、B3樣品和2號廠家的J1、J2、J3、J4樣品進(jìn)行比較可知,2號廠家化合物含量總體上比1號廠家要高一些。

圖5 7種大曲樣品箱線統(tǒng)計(jì)圖Fig.5 Seven samples of Daqu Bexplot

各大類化合物占總揮發(fā)性物質(zhì)含量的平均百分比如圖6所示,芳香族類、醛類、吡嗪類、酯類為所有大曲樣品中含量較高的化合物,分別占總揮發(fā)性物質(zhì)含量的22%、19%、18%、14%,其次是醇類、酸類、酚類化合物等。對于不同廠家的大曲,1號廠家吡嗪類物質(zhì)含量百分比明顯比2號廠家高,約為2號廠家的三倍,同時(shí)1號廠家大曲醛類和酸類物質(zhì)含量也相對較高,而醇類、芳香類、酯類這幾種化合物在2號廠家大曲中的百分比含量高。不同廠家生產(chǎn)使用的大曲揮發(fā)性物質(zhì)個(gè)數(shù)和含量均有差異,用不同曲釀制出來的酒的味道就可能會(huì)大不相同。

圖6 化合物大類占大曲樣品總揮發(fā)性化合物的平均百分比Fig.6 The average percentage of volatile chemical groups in Daqu注:總體百分比=此物質(zhì)所有含量/所有化合物含量×100;1號廠家百分比=1號廠家此物質(zhì)含量/1號廠家所有化合物含量×100;2號廠家百分比=2號廠家此物質(zhì)含量/2號廠家所有化合物含量×100。

2.6 GC-O-MS分析大曲中香氣活性化合物

通過GC-O分析,在大曲樣品中,共有17種香氣活性化合物可被至少兩個(gè)嗅聞人員聞到,其嗅聞結(jié)果如表2所示。由表2可知,有14種香氣活性化合物被檢出,另外3種香氣化合物(8號、12號、13號)未被定性出,可能是由于這幾種化合物的含量很低。6號(2-乙基-3,5-二甲基吡嗪)、10號(苯乙醛)、11號(異戊酸)、15號(苯乙醇)、17號(γ-壬內(nèi)酯)都有很高的香氣強(qiáng)度,貢獻(xiàn)著烤土豆香、蜂蜜香、甜香、酸味、玫瑰香及椰子味,說明這5種香氣物質(zhì)可能對大曲整體香氣特征具有重要貢獻(xiàn)。同時(shí),4號(2,3,5-三甲基吡嗪)、5號(反-2-辛烯醛)、7號(苯甲醛)和12號(未知)這四種化合物的香氣強(qiáng)度評分值也較高,貢獻(xiàn)著烤土豆香、堅(jiān)果香、焦糖香及米香?？傆?jì)有10種化合物在7種大曲中都能被嗅聞到,分別是2,3,5-三甲基吡嗪、反-2-辛烯醛、苯甲醛、2,3-丁二醇、苯乙醛、異戊酸、苯乙醇、γ-壬內(nèi)酯及兩種未知物。這些香氣物質(zhì)可能是構(gòu)成大曲整體香氣特征的基本物質(zhì)。有個(gè)別化合物:3-辛醇只在J3和J4樣品中檢出,苯甲醇只在J4樣品中檢出。

表2 不同廠家七種大曲GC-O-MS香氣活性成分分析結(jié)果

注:-:未被嗅聞到。

在這些香氣活性化合物中,芳香族類化合物的香氣強(qiáng)度較大,可能也是大曲香氣的重要來源。芳香族化合物一般會(huì)呈現(xiàn)出玫瑰花香、蜂蜜香、水果香。如苯乙醛和苯乙醇,都具有花香、甜香、蜂蜜香,與苯丙氨酸的代謝相關(guān)[23],它們是多種食物的關(guān)鍵香氣組成。吡嗪類化合物也具有較高的香氣強(qiáng)度,這些含氮類化合物一般具有堅(jiān)果香、烘焙香和烤肉類香味,最終能被帶入到成品白酒中,成為白酒香氣形成的重要來源之一。沈海月[27]對醬香白酒的聞香結(jié)果表明,2,5-二甲基吡嗪是醬香型白酒中香氣強(qiáng)度最大的吡嗪類物質(zhì)。這是因?yàn)樵诎拙粕a(chǎn)工藝中,大曲的用量很大,一般會(huì)占到窖池發(fā)酵中用糧的25%左右。含氮類化合物的來源可能是大曲生產(chǎn)過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)形成,由于大曲在培菌發(fā)酵期間溫度會(huì)達(dá)到 50 ℃以上,這樣高的溫度有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行,促使大量含氮類化合物生成[28]。

表3 不同廠家七種大曲香氣強(qiáng)度較大活性成分的濃度及香氣活性值

注:a指文獻(xiàn)報(bào)道該化合物在水中的閾值;-表示J4樣品中未檢測到6號化合物;n.a.表示查詢不到該化合物在水中的閾值。

2.7 大曲香氣活性化合物的香氣活性值(OAV)分析

由表3可知,對于兩個(gè)廠家的大曲,2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和苯乙醛都是風(fēng)味活性物質(zhì)中香氣活性值較高的兩種化合物,分別貢獻(xiàn)著烤土豆味、蜂蜜味和甜香。這些化合物對大曲的整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)作用。芳香族類是大曲中主要的香氣貢獻(xiàn)物質(zhì),這與此前的研究結(jié)果一致[29]。就整體而言,1號廠家大曲中2,3,5-三甲基吡嗪的香氣活性值較2號廠家高。另外,2號廠家J4大曲樣品的苯乙醛的香氣活性值較其他樣品高。異戊酸(酸味)、苯乙醇(玫瑰香)、γ-壬內(nèi)酯(椰子味、桃味)這3種化合物的OAV<1,但它們的香氣評分均很高,GC-O結(jié)果與香氣活性值分析結(jié)果存在差異,已有研究中也有過類似現(xiàn)象[28]。原因可能是化合物在水中的閾值與其在大曲體系中的閾值有一定偏差,也或許因?yàn)橄銡饣衔镌谑称坊|(zhì)中的協(xié)同與拮抗作用,這些OAV<1 的化合物能被感官評價(jià)人員聞到很可能是因?yàn)槟承┢渌衔锏膮f(xié)同作用[28]。

3 結(jié)論

本文以2種芝麻香白酒廠家的7種大曲為研究對象,采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜/嗅聞(GC-MS/O)聯(lián)用技術(shù)對大曲揮發(fā)性活性成分進(jìn)行了研究,同時(shí)考察了萃取頭纖維類型、萃取時(shí)間、萃取溫度以及樣品量因4個(gè)因素對萃取效果的影響。研究結(jié)果表明,在50 ℃條件下,對1.5 g大曲樣品采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附30 min效果較佳;在7種大曲中共分離鑒定出69種揮發(fā)性化合物,分為11類,其中醇類(9種)、酯類(13種)、醛類(8種)、酮類(4種)、酸類(3種)、吡嗪類(9種)、芳香族類(8種)、酚類(5種)、雜環(huán)類(2種)、烷烴類(3種)和其他類(5種)。不同廠家的大曲揮發(fā)性化合物個(gè)數(shù)和含量均有差異,是形成不同酒風(fēng)味特征的一個(gè)原因。

通過GC-O實(shí)驗(yàn),2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、苯乙醛、異戊酸、苯乙醇、γ-壬內(nèi)酯等都有很高的香氣強(qiáng)度,貢獻(xiàn)著烤土豆香、蜂蜜香、甜香、酸味、玫瑰香及椰子味。此外2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和苯乙醛這兩種化合物的香氣活性值OAV>1,與其他香氣活性化合物共同組成了大曲獨(dú)特的風(fēng)味。

[1]沈怡方.白酒生產(chǎn)技術(shù)全書[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2015:45-53.

[2]涂榮坤,錢志偉,秦輝,等.大曲檢測指標(biāo)研究進(jìn)展[J].釀酒科技,2016(1):110-112.

[3]申孟林,張超,王玉霞. 白酒大曲微生物研究進(jìn)展[J].中國釀造,2016,35(5):1-5.

[4]向雙全,黃應(yīng)予,劉麗娟,等.大曲蛋白酶對固態(tài)釀酒發(fā)酵的影響[J].中國釀造,2016,35(6):101-104.

[5]倪雪.西鳳酒大曲理化指標(biāo)的優(yōu)化與創(chuàng)新[J].釀酒,2015,42(1):118-120.

[6]張春林,敖宗華,炊偉強(qiáng),等.頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用快速測定大曲中的揮發(fā)性風(fēng)味成分[J].食品科學(xué),2011,32(10):137-140.

[7]ZHANG Chunlin,AO Zonghua,CHUI Weiiang,et al.Characterization of the aroma-active compounds in Daqu:a tradition Chinese liquor starter[J].European Food Research and Technology,2012(234):69-76.

[8]RISTICEVIC S,NIRI V H,VUCKOVIC D,et al. Recent developments in solid-phase microextraction[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2009,393(3):781-795.

[9]DU Liping,HE Tingting,LI Wei,et al. Analysis of volatile compounds in Chinese Laobaigan liquor using headspace solid-phase microextration coupled with GC-MS[J].Analytical methods,2015,7(5):1906-1913.

[10]趙謀明,曹永,蔡宇,等. SDE和HS-SPME法與GC-O聯(lián)用分析陽江豆豉的香氣活性化合物的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2016,32(5):264-275.

[11]李婷婷,索化夷,鄭炯.頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析永川豆豉中揮發(fā)性成分[J].中國調(diào)味品,2013,38(12):86-90.

[12]ZHU Wenyou,REN Cong,NIE Yao,et al. Quantification of ochratoxin A in Chinese liquors by a new solid-phase extraction clean-up combined with HPLC-FLD method[J].Food Control,2016(64):37-44.

[13]LUO Tao,FAN Wenla,XU Yan. Characterization of volatile and semivolatile compounds in chinese rice wines by headspace solid phase microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of the Institute of Brewing,2008,114(2):172-179.

[14]郝寶瑞,張坤生,張順亮,等. 基于GC-O-MS和AEDA法對清醬肉揮發(fā)性風(fēng)味成分分析[J].食品科學(xué),2015,36(16):153-157.

[15]夏亞男,遲超逸,郭潔,等. GC-O-MS法對比3種紅棗白蘭地的揮發(fā)性成分[J].中國釀造,2014,33(2):119-124.

[16]王露,江偉,劉玉梅,等. GC-O-MS法對酒花中香氣活性成分的分析[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2015,34(6):640-646.

[17]GAO Wenjun,FAN Wenla,XU Yan,et al. Characterization of the Key Odorants in Light Aroma Type Chinese Liquor by Gas Chromatograph-Olfactometry,Quantitative Measurements,Aroma Recombination,and Omission Studies[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014(62):5796-5804.

[18]劉廷竹,黃明泉,鄒青青,等.GC-O與GC-MS結(jié)合分析竹蓀牛肉香精中的揮發(fā)性成分[J].食品科學(xué),2016,37(2):92-98.

[19]ZHENG Yang,SUN Baoguo,ZHAO Mouming,et al.Characterization of the Key Odorants in Chinese Zhima aroma-type Baijiu by Gas Chromatography-Olfactometry,Quantitative Measurements,Aroma Recombination,and Omission Studies[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2016.

[20]趙謀明,蔡宇,馮云子,等.HS-SPME-GC-MS/O聯(lián)用分析醬油中的香氣活性化合物[J]. 現(xiàn)代食品科技,2014,30(11):204-211.

[21]Monica N,Roberto LS,Armando T,et al. Evaluation of fruit aroma quality:comparison between gas chromatography-olfactometry(GC-O)and odor activity value(oav)aroma patterns of strawberries[J]. Food Analysis Methods,2008(1):270-282.

[22]Luo T,Fan W L,Xu Y.Characterization of volatile and semi-volatile compounds in chinese rice wines by headspace solid phase microextraction followed by gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of The Institute of Brewing,2008,114(2):172-179.

[23]張春林.瀘州老窖大曲的質(zhì)量、微生物與香氣成分的關(guān)系[D].無錫:江南大學(xué),2012:15-25.

[24]Fan W L,Qian M C.Characterization of aroma compounds of Chinese“ Wuliangye” and “Jiannanchun” liquors by aroma extract dilution analysis[J]. Journal of Agricultural and FoodChemistry,2006,54(7):2695-2704.

[25]Fan W L,Qian M C.Headspace solid phase microextraction and gas chromatography-olfactometry dilution analysis of young and aged Chinese “Yanghe Daqu” l iquors[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(20):7931-7938.

[26]Chen S,Xu Y.The Influence of yeast strains on the volatile flavour compounds of Chinese rice wine[J].Journal of the Institute of Brewing,2010,116(2):190-196.

[27]沈海月. 醬香型白酒香氣物質(zhì)研究[D]. 無錫：江南大學(xué),2010.

[28]Pang X L,Guo X F,Qin Z H,et al.Identification of aroma-active compounds in Jiashi muskmelon juice by GC-O-MS and OAV calculation[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(17):179-185.

[29]汪玲玲.醬香型白酒微量成分及大曲香氣物質(zhì)研究[D]. 無錫:江南大學(xué),2013:31-33.

Identification of aroma-active compounds in Daqu by HS-SPME-GC-MS/O

MENG Wei-yi,HUANG Ming-quan*,SUN Bao-guo,ZHENG Fu-ping,SUN Jin-yuan,SUN Xiao-tao,LI He-he

(1.Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China;2.Beijing Technology and Business University,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

The aroma compounds of Daqu were analyzed by headspace-solid-phase microextraction(HS-SPME)combined with gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry(GC-O-MS). At the same time,the conditions of fiber type,adsorption time,extraction temperature and sample amount for analysis of volatile compounds in Daqu samples were optimized. The conditions of SPME were optimized by single factor experiment,such as fiber type,adsorption time,extraction temperature and sample amount. The optimum extraction conditions were 1.5 g sample,50/30 μm DVB/CAR/PDMS fiber,extraction time 30 min and extraction temperature 50 ℃. With the potimal conditons,69 volatile compounds were identified from the tested Daqu sample,including 9 alcohols,13 esters,8 aldehydes,4 ketones,3 acids,9 pyrazines,8 aromatic compounds,5 phenols,2 heterocyclic,3 alkanes and 5 others. 17 aroma-active compounds were detected by GC-O-MS,14 compounds were identified. The key aroma-active compounds were 2-ethyl-3,5-dimethyl pyrazine and phenylacetaldehyde. Their odor activity values(OAVs)and their aroma intensities were stronger than others. They contribute honey-like,baked potato-like,and the all aroma-active compounds constitute the unique aroma of Daqu.

Daqu;headspace solid-phase microextraction(HS-SPME);gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry(GC-O-MS);aroma-active compounds;odor activity value

2016-09-02

孟維一(1992-)，女，碩士研究生，研究方向: 香精香料的分析與應(yīng)用，E-mail：meng_weiyi@163.com。

*通訊作者:黃明泉(1977-)，男，副教授，研究方向: 食品檢測分析，E-mail：hmqsir@163.com。

國家自然科學(xué)基金 (31471665)；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(CIT&tcd201404034)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)06-0054-09

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.002