趙長青,徐 莎,楊 陽,趙 陽

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000)

濃香型白酒釀造大曲及糟醅中功能芽孢桿菌的篩選

趙長青,徐 莎,楊 陽,趙 陽

(四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院,四川自貢 643000)

為從白酒釀造中分離篩選出有助于提高濃香型白酒風(fēng)味成分的芽孢桿菌，本文從濃香型白酒釀造的大曲和糟醅中分離得到了55株芽孢桿菌,通過篩選得到了一株在發(fā)酵液中產(chǎn)生較多己酸乙酯和較少正丙醇的菌株,編號(hào)為YB-16,該菌株所產(chǎn)己酸乙酯含量符合國標(biāo)高度優(yōu)級(jí)酒的范圍,所產(chǎn)正丙醇含量符合國標(biāo)特級(jí)食用酒精的范圍。通過對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生理生化特征分析、分子生物學(xué)鑒定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)YB-16與Bacilluscereusstrain CCM NBRC 15305聚為一個(gè)分支,親緣關(guān)系最近,可將菌株YB-16鑒定為蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bacilluscereus)。若將篩選的該Bacilluscereus應(yīng)用至濃香型白酒傳統(tǒng)釀造工藝,將能夠提升濃香型白酒的香味和品質(zhì)。

濃香型白酒,功能菌,芽孢桿菌

中國白酒歷史悠久,其中瀘州老窖特曲酒為典型代表的濃香型白酒。多年的研究證實(shí),釀造過程中功能菌液的質(zhì)量影響著窖泥微生物生態(tài)功能及酒糟發(fā)酵生態(tài),從而決定著濃香型白酒的質(zhì)量和風(fēng)格特征[1]。濃香型白酒釀造微生物主要來源于釀酒大曲、窖泥、糟醅、原料及環(huán)境攜帶,但參與發(fā)酵產(chǎn)香微生物主要來自于大曲、窖泥、糟醅及人工添加的生香菌純培養(yǎng)或復(fù)合菌液、強(qiáng)化曲、人工窖泥等[2-3]。

隨著微生物學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用,我國對(duì)濃香型白酒產(chǎn)香或參與產(chǎn)香細(xì)菌的認(rèn)識(shí)愈發(fā)細(xì)致,對(duì)其種群和分布情況做了深入研究。張麗鶯研究了瀘州老窖糟醅中的細(xì)菌區(qū)系,發(fā)現(xiàn)以芽孢桿菌和芽孢乳桿菌為主要類群[4]。施安輝研究了山東蘭菱美大曲和崋縣酒廠發(fā)酵糟醅中的細(xì)菌類群,發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌為芽孢菌屬[5]。劉莉萌等發(fā)現(xiàn)糟醅和窖泥中的乳酸菌以乳酸片球菌和芽孢乳桿菌為主[6-7]。還有研究表明:對(duì)濃香型白酒香氣貢獻(xiàn)最大的是梭狀芽孢桿菌,其主要代謝產(chǎn)物是己酸、丁酸和氫[8]。由上述可知,窖池中的產(chǎn)香細(xì)菌均以芽孢桿菌為主。有報(bào)道稱,芽孢桿菌也是大曲中數(shù)量較多的細(xì)菌之一,它具有一定水解蛋白質(zhì)和淀粉的能力,在白酒固態(tài)發(fā)酵中能代謝生成多種風(fēng)味成分[9]。因此,本文希望能夠從釀酒大曲和糟醅中分離篩選出有助于提高濃香型白酒風(fēng)味成分的芽孢桿菌。而己酸乙酯被確定為濃香型白酒的主體香味物質(zhì),成為制約濃香型白酒優(yōu)質(zhì)酒產(chǎn)率的重要因素[10-11]。

在分離高產(chǎn)己酸乙酯的芽孢桿菌時(shí),應(yīng)注意到所分離菌株產(chǎn)雜醇油的問題。由于雜醇油的含量過高則容易引起上頭、口干[12];同時(shí)它也是白酒產(chǎn)生白色渾濁的原因之一[13],因此,我國對(duì)白酒中雜醇油的含量有明確的規(guī)定。作為雜醇油的重要組分之一,被認(rèn)為是酒精發(fā)酵副產(chǎn)物的正丙醇已經(jīng)成為我國新食品酒精質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)[14]。因此,本文希望能夠分離出高產(chǎn)己酸乙酯和低產(chǎn)正丙醇的功能芽孢桿菌。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

大曲和糟醅 均由瀘州老窖提供,取樣于2015年1月;色譜純己酸乙酯、正丙醇、乙酸正戊酯(規(guī)格:5 mL) 天津市光復(fù)精細(xì)化工所;無水乙醇(優(yōu)級(jí)純) 成都市科龍化工試劑廠;氣相色譜儀(型號(hào):GC-7860) 上海宜友電子科技有限公司;色譜柱(型號(hào):DB-WAX) 南京伽諾色譜技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基:乙酸鈉改良培養(yǎng)基:乙酸鈉5 g,硫酸銨0.5 g,磷酸氫二鉀0.4 g,七水硫酸鎂0.2 g,酵母膏1 g,碳酸鈣5 g,蒸餾水1000 mL,pH6.0～pH6.5,以121 ℃滅菌20 min,接種前加無水乙醇20 mL[14]。

蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖30 g,酵母膏1 g,氯化鈉6 g,巴豆酸 2 g,蘇氨酸 2.5 g,蒸餾水1000 mL,115 ℃滅菌30 min[14]。

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基[15]:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化鈉10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0,121 ℃滅菌20 min。

1.3 芽孢桿菌的分離

取2.0 g大曲和糟醅混合樣品于100 mL滅菌蒸餾水中,充分震蕩3～5 min后,過濾。然后取2 mL濾液于100 mL富集培養(yǎng)基中,置于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。富集培養(yǎng)完成后,將富集培養(yǎng)基放在90 ℃水浴鍋中加熱5 min,殺滅菌體,使芽孢得到富集。再取富集的芽孢桿菌液稀釋到10-20～10-1二十個(gè)梯度。稀釋完成后,將不同濃度的菌液分別接種到LB培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布,然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。從平板上選擇菌落形態(tài)不同且處于單獨(dú)位置的菌株,待長出菌苔后,進(jìn)行鏡檢,按無菌操作方法在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離,置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng),每隔6 h觀察菌體生成情況。重復(fù)此操作,直至出現(xiàn)單一菌落后,將該單一菌落接種到LB培養(yǎng)基斜面中,然后分別進(jìn)行編號(hào)[15-16]。

1.4 芽孢桿菌的篩選

將經(jīng)過初篩后保藏于斜面培養(yǎng)基中的各株芽孢桿菌分別接種2環(huán)至100 mL已滅菌的蘇氨酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,使其初始菌落數(shù)為107～3×107CFU/mL,置于28 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)4 d。發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵液取出,用超高速離心機(jī)以10000 r/min于4 ℃離心20 min,取上清液。過濾后用氣相色譜儀測(cè)定發(fā)酵液中的乙酸乙酯和正丙醇含量,篩選出能在發(fā)酵液中生成較多己酸乙酯和較少正丙醇的芽孢桿菌。

氣相色譜條件:色譜柱為DB-WAX 60 m×250 μm×0.25 μm,進(jìn)樣口溫度210 ℃;檢測(cè)器溫度230 ℃。柱箱升溫程序:40 ℃保持5 min,然后以5 ℃/min升至80 ℃,保持2 min,最后以10 ℃/min到升至230 ℃,保持5 min,運(yùn)行時(shí)間35 min。載氣:N2,N2:H2=80∶20,載氣流量:5 mL/min,載氣壓力:0.08 MPa,進(jìn)樣量1 μL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確吸取色譜純標(biāo)準(zhǔn)試劑2 mL于100 mL容量瓶中,萬分之一分析天平稱重?cái)?shù)為2%的標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度單位為(mg/100 mL)。準(zhǔn)確吸取體積分?jǐn)?shù)為2%的各標(biāo)準(zhǔn)溶液3 mL于25 mL容量瓶中,用60%乙醇(超純水稀釋無水乙醇得)定容至刻度,由此配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用于建立系統(tǒng)模板和計(jì)算校正因子。

模板建立及校正因子的計(jì)算:根據(jù)各種物質(zhì)在同一色譜柱和相同儀器條件下有確定不變的保留值,因此可以定性混合標(biāo)準(zhǔn)液中各種成分,從而確定其出峰順序。取混合標(biāo)準(zhǔn)液1 μL進(jìn)樣色譜分析,進(jìn)樣4次。出峰順序依次為:正丙醇、乙酸正戊酯(內(nèi)標(biāo))、己酸乙酯。根據(jù)峰面積和混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度(mg/100mL)計(jì)算校正因子。校正因子=內(nèi)標(biāo)物的峰面積×標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度/內(nèi)標(biāo)物的濃度/標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積。

發(fā)酵液測(cè)定:取各樣品1.5 mL,加入0.15 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)物(乙酸正戊酯),內(nèi)標(biāo)物濃度208.596 mg/100 mL?；靹蚝?在與 f 值測(cè)定相同的條件下進(jìn)樣,根據(jù)保留時(shí)間確定己酸乙酯和正丙醇峰的位置,并測(cè)定己酸乙酯和正丙醇與內(nèi)標(biāo)峰面積,求出峰面積之比,計(jì)算出樣品中己酸乙酯和正丙醇的含量。己酸乙酯和正丙醇的濃度=校正因子×香氣物質(zhì)的峰面積×內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度/內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.5 芽孢桿菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察 將所篩選的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色和芽孢染色[15]。

1.5.2 生理生化鑒定 將所篩選的菌株進(jìn)行生理生化鑒定,包括甲基紅實(shí)驗(yàn)、V.P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、明膠水解實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)[17]。

1.5.3 分子生物學(xué)鑒定 參考文獻(xiàn)[18] 利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法在高離子強(qiáng)度的溶液中可以與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,但是卻不能沉淀核酸的原理,并充分結(jié)合酶法、SDS法提取DNA,通過有機(jī)溶劑的抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、酚類等雜質(zhì)(膠孔里沒有明顯的蛋白質(zhì)殘留,條帶清晰),并加入異丙醇沉淀使核酸分離出來。

步驟如下:首先接種2環(huán)菌種于液體LB培養(yǎng)基中,150 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)12 h。然后收集0.2 g菌體于2 mL離心管中,再加入500 μL CTAB溶液和50 μL溶菌酶(100 mg/mL),置于225 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。在經(jīng)過溶菌酶作用后的菌液中加入250 μL,20% SDS和25 μL蛋白酶(20 mg/mL),置于65 ℃恒溫水浴鍋中水浴1 h,每15 min震蕩混勻1次。當(dāng)水浴完成過后,將離心管于-80 ℃冰箱冷凍15 min后又置于65 ℃恒溫水浴鍋中水浴15 min,如此反復(fù)三次。再加入與離心管中液體等體積tris酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1),經(jīng)過渦旋混勻后靜置10 min。然后以12000 r/min于4 ℃離心15 min,取上清液,重復(fù)至無白色沉淀為止。然后,加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1),經(jīng)過渦旋混勻后靜置10 min,于12000 r/min離心15 min,取上清液。在取得的上清液中加入0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇并混勻,放入-20 ℃冰箱中沉淀1 h。沉淀完成后,于4 ℃,12000 r/min離心15 min,棄去上清液取沉淀。隨后用1 mL乙醇(70%)洗滌,再于4 ℃,12000 r/min離心15 min,取沉淀重復(fù)一次。然后將離心管于超凈工作臺(tái)烘干至無酒精味后加入50 μL無菌雙蒸水,放入65 ℃恒溫水浴鍋中水浴1 h。最后將所提取的DNA送至上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序,獲得DNA拼接序列。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi.nlm.nih. gov/)中進(jìn)行比對(duì)并采用MEGA 6.0軟件(鄰接法)構(gòu)建16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)液的校正因子Table 1 Correction factors for the mixed standard solution

2 結(jié)果與討論

2.1 校正因子

如表1所示,混合標(biāo)準(zhǔn)樣品(正丙醇、乙酸正戊酯、己酸乙酯)中3種成分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)相對(duì)較小,校正因子可靠,適用于香氣成分定量分析。

2.2 色譜圖

圖1是混合標(biāo)準(zhǔn)樣品(正丙醇、乙酸正戊酯、己酸乙酯)的氣相色譜離子流色譜圖。由圖1可知,三種混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的溶液離子流色譜圖出峰清楚,因此是可信的。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of mixed standard solution注：1:正丙醇；2：乙酸正戊酯；3:己酸乙酯。

2.3 芽孢桿菌的篩選

經(jīng)稀釋平板法篩選出菌株共55株,從YB-1到Y(jié)B-55編號(hào)后分別于斜面試管培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后按與校正因子值測(cè)定相同的條件下進(jìn)樣,測(cè)其發(fā)酵液中產(chǎn)生的己酸乙酯和正丙醇含量。各菌株發(fā)酵液中測(cè)定出的己酸乙酯含量和正丙醇含量如表2所示。

己酸乙酯是濃香型白酒的主體香味物質(zhì),能較大程度提高白酒的風(fēng)味成分,正丙醇較少能夠降低因正丙醇含量過高而帶來的上頭、口干[10-12]。中國國標(biāo)GB/T 10781.1-2006《濃香型白酒》規(guī)定,高度優(yōu)級(jí)酒的己酸乙酯含量為120～280 mg/100 mL。而國標(biāo)GB/T 10343-2008《食用酒精》規(guī)定,特級(jí)食用酒精中的正丙醇含量應(yīng)≤2.0 mg/L。由表2可以看出,YB-12、YB-13和YB-16菌株產(chǎn)己酸乙酯量較多,分別為245.99、256.62、233.70 mg/100 mL,但YB-12和YB-13產(chǎn)正丙醇含量也較多,分別為4.6792、3.9235 mg/100 mL,超過了優(yōu)級(jí)酒中的正丙醇含量要求。YB-16產(chǎn)正丙醇含量為0.0392 mg/100 mL,符合優(yōu)級(jí)酒對(duì)正丙醇含量的要求。此外,YB-8菌株產(chǎn)的正丙醇含量(0.0356 mg/100 mL)略低于YB-16,但YB-8產(chǎn)己酸乙酯量(76.59 mg/100 mL)遠(yuǎn)小于YB-16。因此,可選擇YB-16菌株作為本實(shí)驗(yàn)的目的菌株,即高產(chǎn)己酸乙酯、低產(chǎn)正丙醇。

表2 各菌株產(chǎn)己酸乙酯與正丙醇產(chǎn)量Table 2 The ethyl hexanoate and propanol yields for each strain

續(xù)表

2.4 菌株的形態(tài)觀察

表3 生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 3 Identification of physiological and biochemical characteristics

注:“+”表示“有”或“陽性反應(yīng)”。在普通瓊脂培養(yǎng)基上,用低倍物鏡(10倍)觀察菌株YB-16菌落特征為:菌落大,直徑約為5 mm,表面粗糙、扁平、不規(guī)則。在高倍鏡(40倍)下觀察,該菌株YB-16菌體呈桿狀,菌體細(xì)胞桿狀,成短或長鏈。革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)中,在油鏡(100倍)下觀察,該菌體被染成藍(lán)紫色,證明為革蘭氏陽性菌。芽孢染色實(shí)驗(yàn)中,如圖3所示,在油鏡(100倍)下觀察,有芽孢,芽孢呈橢圓形,約1.0 μm,位于菌體中央,芽孢囊不膨大。

圖2 革蘭氏染色(1000×)Fig.2 Gram staining image(1000×)

圖3 芽孢染色(1000×)Fig.3 Spores staining image(1000×)

2.5 生理生化鑒定結(jié)果

該YB-16菌株的生理生化鑒定結(jié)果如表3所示。由表3知,甲基紅實(shí)驗(yàn)、V.P反應(yīng)、吲哚實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、明膠水解和過氧化氫酶反應(yīng)均為陽性,說明YB-16在糖代謝過程中,具有發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸的能力;具有發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乙酰四基甲醇的能力;能水解淀粉和蛋白質(zhì);能將H2O2催化分解成H2O和O2。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,初步認(rèn)定YB-16為芽孢桿菌屬。

2.6 目的菌DNA序列的鑒定

圖5 YB-16的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree for strain YB-16

將如圖4的16S rDNA序列輸入NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中,在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)目地菌株YB-16與蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bacilluscereus)具有最高同源性達(dá)100%。建立系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖5所示,觀察發(fā)現(xiàn),YB-16菌株與Bacilluscereusstrain NBRC 15305聚為一個(gè)分支,親緣關(guān)系最近。查閱《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,發(fā)現(xiàn)YB-16菌株的形態(tài)特征和生理生化特征與蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)基本一致。因此,將YB-16號(hào)菌株鑒定為蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

圖4 YB-16序列測(cè)序結(jié)果Fig.4 The DNA sequencing result for YB-16

3 討論與結(jié)論

蠟質(zhì)芽孢桿菌在工業(yè)化社會(huì)中常被認(rèn)為是食物病源菌。它能產(chǎn)生一種嘔吐毒素和腸毒素,主要引發(fā)嘔吐和腹瀉型食物中毒[19]。但近年來,蠟質(zhì)芽孢桿菌也被認(rèn)為是一種有益的微生物。應(yīng)用微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物來防治植物病害是目前生物防治的一種主要方式,蠟質(zhì)芽孢桿菌是芽孢菌屬中具有生防應(yīng)用價(jià)值的拮抗細(xì)菌之一[20]。楊春霞、廖永紅等人對(duì)酒醅中的蠟質(zhì)芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵風(fēng)味分析,發(fā)現(xiàn)其在發(fā)酵液中能形成12種風(fēng)味物質(zhì),其中含己酸乙酯1.54%;發(fā)酵液中含有數(shù)量較多的酯類和醛酮類化合物,占總數(shù)的58%;蠟質(zhì)芽孢桿菌不產(chǎn)醚類、含氮化合物和酸類化合物[21]。而本實(shí)驗(yàn)所篩選的蠟質(zhì)芽孢桿菌能夠產(chǎn)生產(chǎn)己酸乙酯含量為233.70 mg/100 mL,符合國標(biāo)高度優(yōu)級(jí)酒的范圍;而正丙醇產(chǎn)量為0.0392 mg/100 mL,符合國標(biāo)特級(jí)食用酒精的范圍。

本文從濃香型白酒釀酒大曲和糟醅中富集培養(yǎng)共分離出了55株芽孢桿菌,以高產(chǎn)己酸乙酯和低產(chǎn)正丙醇為指標(biāo),篩選出了一株能在發(fā)酵液中形成較多己酸乙酯和較少正丙醇的芽孢桿菌,命名為YB-16的菌株。通過對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生理生化特征鑒定和DNA序列分析,將YB-16菌株鑒定為蠟質(zhì)芽孢桿菌。該菌株所產(chǎn)己酸乙酯含量符合國標(biāo)高度優(yōu)級(jí)酒的范圍,所產(chǎn)正丙醇含量符合國標(biāo)特級(jí)食用酒精的范圍。若將篩選的該蠟質(zhì)芽孢桿菌應(yīng)用至濃香型白酒傳統(tǒng)釀造工藝,將有利于提高濃香型白酒的風(fēng)味,并具有一定降低上頭、口干的作用。

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Selecting of functionalBacillusstrain from omagari and fermented grains of Luzhou-flavor liquor

ZHAO Chang-qing,XU Sha,YANG Yang,ZHAO Yang

(College of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China)

To isolateBacillusstrain from Luzhou-flavor liquor so that the flavor components could be improved,55 strains ofBacilluswere obtained in the omagari and fermented grains of Luzhou-flavor liquor in total in this study. Through screening,one strain producing high-yield ethyl hexanoate and low-yield propanol was screened out which was then named as YB-16. The produced ethyl hexanoate belonged to excellent strong liquor of the national standard and the produced propanol belonged to extra edible alcohol of the national standard. After strain morphology,physiological and biochemical characteristics,molecular biology assay and the constructed phylogenetic tree,YB-16 andBacilluscereusstrain CCM NBRC 15305 clustered into a branch and were each other’s closest relatives. Thus,YB-16 was identified asBacilluscereus. It is expected that the application ofBacilluscereusstrain to the traditional brewing process of Luzhou-flavor liquor could improve its flavor and quality.

Luzhou-flavor liquor;functional strain;Bacillus

2016-10-28

趙長青(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物,E-mail:zhaocq2010@163.com。

釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(NJ2015-11)；四川理工學(xué)院“瀘州老窖科研獎(jiǎng)學(xué)金”項(xiàng)目(15ljzk09)；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201510622054)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0151-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.021