任勰珂,陳 莉,*,盧紅梅,佘榮洪,賈青慧2,,張玉梅,白成松

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025；3.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,貴州貴陽 550025)

多菌種混合固態(tài)發(fā)酵秸稈的研究

任勰珂1,2,陳 莉1,2,*,盧紅梅1,2,佘榮洪3,賈青慧2,3,張玉梅1,2,白成松1,2

(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025；3.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,貴州貴陽 550025)

實驗以綠色木霉(Trichodermaviride)、黑曲霉(Aspergillusniger)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)、青霉(Penicillium)、長枝木霉(LongibrachiatumRifai)為菌種,在已有單因素實驗的基礎(chǔ)上選取影響較明顯的4個因素(發(fā)酵溫度、時間、混菌接種量和酵母接入時間)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵正交優(yōu)化實驗(其中混菌組合比例均為1∶1∶1),通過測定纖維素酶活、粗纖維素降解率來確定最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明:以纖維素酶活為指標(biāo),酶活最高的是綠色木霉、黑曲霉和假絲酵母三種菌種的組合,其混菌接種量為5%,發(fā)酵時間為3 d,酵母與混菌同時接入,發(fā)酵溫度為30 ℃,纖維素酶活達(dá)到85.73 U/mL;以粗纖維素降解率為指標(biāo),降解率最高的是長枝木霉、青霉和假絲酵母三種菌種的組合,其混菌接種量為10%,酵母第1 d接入,30 ℃發(fā)酵4 d,纖維素降解率達(dá)到38.89%。農(nóng)作物經(jīng)混菌固態(tài)發(fā)酵后,營養(yǎng)價值得到提高,可作為一種優(yōu)質(zhì)飼料來飼喂家畜,這對于充分利用可再生資源,改善農(nóng)村環(huán)境污染有著積極作用。

秸稈,混合發(fā)酵,纖維素酶,固態(tài)發(fā)酵

秸稈指農(nóng)作物莖葉部分,主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,富含氮、磷等元素[1],是一種非常豐富的可再生資源。我國是秸稈生產(chǎn)大國,年產(chǎn)量7億多t,約占全世界秸稈總量的20%～30%[2-3]。秸稈多用作飼料、燃料及有機(jī)肥料,少部分用作工業(yè)原料及食用菌基料[4]。目前,我國普遍采用就地焚燒處理秸稈,不僅污染了環(huán)境,還影響群眾健康。因此如何優(yōu)化處理秸稈成為了社會性問題[5],其中微生物發(fā)酵是近年來的研究熱點,其原理是利用霉菌分泌多種酶類,同時將飼料中纖維物質(zhì)、淀粉及果膠質(zhì)等轉(zhuǎn)化為各種糖類[6];或利用酵母菌將秸稈的某些成分進(jìn)一步合成營養(yǎng)價值較高或適口性較好的物質(zhì),如蛋白質(zhì)、維生素、有機(jī)酸、未知生長因子等[7-8]。發(fā)酵使秸稈變成質(zhì)地松軟、濕潤蓬松、酸香適口的粗飼料,消除了青貯和氨化的不足,有效解決了人畜爭糧的問題[9]。

本實驗采用產(chǎn)生纖維素分解酶的菌株與酵母菌混合發(fā)酵,即同步糖化發(fā)酵(SSF)[10]。酵母菌接種量5%,在已有單因素實驗基礎(chǔ)上,選擇發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、混菌接種量及酵母接入時間4個因素進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵正交優(yōu)化研究,測定發(fā)酵過程中綜合因素對酶活的影響及纖維素降解率來確定最佳的發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

實驗用綠色木霉(Trichodermaviride),黑曲霉(Aspergillusniger),產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis),青霉(Penicillium),長枝木霉(longibrachiatumRifai) 均由貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院微生物實驗室提供,保藏于4 ℃冰箱中;(NH4)2SO4、KH2PO4、CaCl2、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4、MnSO4、CoCl2·6H2O、NaOH 市售,分析純;稻草秸稈、麩皮 市集，40 ℃恒溫烘干,粉碎過60目篩。。

SPX-25013電熱生化培養(yǎng)箱、DHG-9140B電熱鼓風(fēng)干燥箱 上?，樮巸x器有限公司;SHZ-82臺式恒溫振蕩器、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;LDZH-100KBS立式壓力滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1F超凈工作臺 上海博尋實業(yè)有限公司;722S分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;TD4ZWS離心機(jī) 北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 DNS試劑:稱取DNS 6.3 g,溶解后加2 mol/L NaOH溶液262 mL到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉(C4H4OKNa·4H2O,M=282.22)的熱水中,再加5 g結(jié)晶苯酚(C6H5OH,M=94.11)和5 g亞硫酸鈉(Na2SO3,M=126.04)攪拌溶解,冷卻后稀釋至1000 mL容量瓶中混勻,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:將葡萄糖干燥至恒重,稱取100 mg蒸餾水溶解后,定容至100 mL。

0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na):稱取CMC-Na 5 g,加入適量pH5.0、0.05 mol/L檸檬酸緩沖液,加熱溶解定容至1000 mL。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:0.5%(NH4)2SO4、0.1%KH2PO4、0.06%CaCl2、0.05%MgSO4·7H2O微量FeSO4·7H2O、ZnSO4、MnSO4、CoCl2·6H2O、稻草粉80%、麩皮20%。比例為10 g固體加入20 mL營養(yǎng)液,121 ℃滅菌30 min。

1.2.2 制備菌懸液與標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2.1 種子菌懸液的制備 將實驗菌株在超凈工作臺接種到平板上,30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。分別挑去平板上的單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上,30 ℃恒溫靜止培養(yǎng)72 h。將菌株純種分別用無菌水將整個活化斜面洗下后接種到液體種子培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶裝液量100 mL,各做兩組),30 ℃恒溫175～180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后得種子菌懸液[11]。

1.2.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 按表1規(guī)定量,分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和DNS試劑于各管中搖勻后同時置于沸水浴10 min,冷卻至室溫后定溶于20 mL刻度試管中搖勻,在540 nm波長處測其吸光度。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,三次實驗的均值獲得線性回歸方程。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線配制表Table 1 The configuration of the standard curve of glucose

1.2.3 混合菌固態(tài)發(fā)酵條件的正交優(yōu)化 采用同步糖化發(fā)酵(SSF),在前期單因素實驗基礎(chǔ)上,選擇發(fā)酵溫度、時間、混菌接種量和酵母接入時間四個因素進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵正交優(yōu)化實驗(其中混菌組合比例均為1∶1∶1)。正交水平方案如表2,其他因素為:硫酸銨含量3%,麩皮含量20%,稻草含量80%,含水量為250%[11]。

表2 L9(34)正交實驗設(shè)計Table 2 L9(34)orthogonal experimental design

1.2.4 纖維素酶活的測定 制備粗酶液:按10 g固體干重加100 mL水,40 ℃,80 r/min浸提1 h,發(fā)酵液過濾后在4000 r/min離心20 min,取上清液得到酶液。

測定原理:根據(jù)國際理論應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(IUPAC)推薦的方法,利用纖維素酶能夠水解纖維素產(chǎn)生葡萄糖,以5%的CMC-Na溶液作為底物,通過酶的水解成葡萄糖,DNS顯色液使還原糖顯色,其溶液顏色用分光光度計(540 nm處)測得OD值。借助于標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)計算出葡萄糖的含量,計算公式為已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式[12]。

步驟:試管中先加入1.5 mL檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液(pH5),加5 mL5%的CMC-Na溶液,振蕩混合后,在50 ℃水浴中預(yù)熱5～10 min后,然后用移液槍加0.5 mL以檸檬酸緩沖液(pH=5)稀釋的酶液;保溫30 min,加1.5 mL DNS顯色液,沸水浴5 min,終止反應(yīng),冰水冷卻;最后加蒸餾水混合均勻,定容20 mL,等剩余底物完全沉淀后,于540 nm處測光密度值。(以有底物無酶樣為空白對照調(diào)零)。

酶活定義:在上述條件下每小時,每毫升粗酶液水解底物產(chǎn)生1 μmol的葡萄糖定義為一個酶活力單位[13]。

酶活的計算方法:

式(1)

式中:M-葡萄糖的含量;5.56-1 mg葡萄糖的μ摩爾數(shù)(μmol/mL);T-反應(yīng)時間(h);0.5-酶液加入量(mL);n-酶液稀釋倍數(shù);v-固體曲提取液體積(mL);m-固體曲的質(zhì)量(g)。

1.2.5 粗纖維含量的測定 由貴州大學(xué)環(huán)境與資源研究所測定,分析方法:粗纖維-酸堿醇醚處理法[14]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程分析采用Excel 2007軟件,正交優(yōu)化實驗結(jié)果分析采用spss軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程

分析圖1可知,在一定范圍內(nèi),吸光度隨著葡萄糖含量的的增加呈線性上升,線性擬合顯示R平方值為0.9980,說明線性相關(guān)度較好,可使用在后續(xù)分析中。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程Fig.1 The standard curve of glucose and the linear regression equation

2.2 固態(tài)發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

以纖維素酶活為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵條件的正交優(yōu)化:

2.2.1 綠色木霉、黑曲霉和假絲酵母組合 由表3可知,極差D>B>C>A,即發(fā)酵時間>混菌接種量>酵母接入時間>發(fā)酵溫度,混菌接種量對酶活影響最大,發(fā)酵溫度影響最小。正交優(yōu)化結(jié)果:固態(tài)發(fā)酵條件為D1B1C1A1,即混菌接種量為5%,酵母與混菌同時接入,30 ℃發(fā)酵3 d,纖維素酶活達(dá)到85.73 U/mL。

表3 纖維素酶活結(jié)果分析表Table 3 Analysis of cellulase activity

表4 纖維素酶活結(jié)果分析表Table 4 Analysis of cellulase activity

2.2.2 綠色木霉、青霉和假絲酵母組合 從表4可知,極差C>A>D>B,即酵母接入時間>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間>混菌接種量,說明酵母接入時間對酶活影響最大,而混菌接種量的影響最小,正交優(yōu)化結(jié)果:此組合的固態(tài)發(fā)酵條件為C3A3D2B1,即酵母在混菌接種2 d后接入,36 ℃發(fā)酵4 d,混菌接種量5%,纖維素酶活達(dá)到72.43 U/mL。

2.2.3 長枝木霉、青霉和假絲酵母組合 從表5可知,極差依次為D>A>C>B,即發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>酵母接入時間>混菌接種量,這說明對酶活影響最大的因素是發(fā)酵時間,發(fā)酵溫度次之,而影響最小的是混菌接種量,正交優(yōu)化結(jié)果:此組合的固態(tài)發(fā)酵條件為D1A1C2B2,即30 ℃發(fā)酵3 d,酵母接入1 d后接入,混菌接種量10%,纖維素酶活達(dá)到52.94 U/mL。

表5 纖維素酶活結(jié)果分析表Table 5 Analysis of cellulase activity

表6 纖維素酶活結(jié)果分析表Table 6 Analysis of cellulase activity

2.2.4 長枝木霉、黑曲霉和假絲酵母組合 從表6知,極差依次為B>A>C>D,即混菌接種量>發(fā)酵溫度>酵母接入時間>發(fā)酵時間,說明在此組合發(fā)酵過程中,對酶活影響最大的因素是混菌接種量,發(fā)酵溫度次之,而發(fā)酵時間的影響最小,正交優(yōu)化結(jié)果為B1A2C2D3,即接種量5%,酵母1 d后接入,33 ℃發(fā)酵5 d,纖維素酶活達(dá)到74.92 U/mL。

以纖維素降解率為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵條件的正交優(yōu)化:

2.2.5 綠色木霉、黑曲霉和假絲酵母組合 從表7可看出,極差依次為B>C>A>D,即混菌接種量>酵母接入時間>培養(yǎng)溫度>發(fā)酵時間,說明在此組合的固態(tài)發(fā)酵過程,對產(chǎn)粗纖維影響最大的因素是混菌接種量,其次是酵母的接入時間,而發(fā)酵時間的影響最小,正交優(yōu)化結(jié)果:固態(tài)發(fā)酵條件為B3C2A2D1,即接種量15%,酵母1 d后接入,33 ℃發(fā)酵時間3 d,粗纖維素降解率達(dá)到16.83%。

表7 粗纖維素降解率結(jié)果分析表Table 7 Analysis results of curde cellulose degradation rate

表8 粗纖維素降解率結(jié)果分析表Table 8 Analysis results of curde cellulose degradation rate

2.2.6 綠色木霉、青霉和假絲酵母組合 由表8知,極差依次為C>D>A>B,即酵母接入時間>發(fā)酵時間>培養(yǎng)溫度>混菌接種量,說明在此組合的固態(tài)發(fā)酵過程中,對產(chǎn)粗纖維影響最大的因素是酵母的接入時間,其次為發(fā)酵時間以及培養(yǎng)溫度,優(yōu)化結(jié)果:固態(tài)發(fā)酵條件為C1D3A2B1,酵母與混菌同時接入,33 ℃發(fā)酵5 d,接種量5%,粗纖維素降解率達(dá)到36.45%。

2.2.7 長枝木霉、青霉和假絲酵母組合 從表9看出,極差依次為B>D>C>A,即發(fā)酵時間>酵母接入時間>混菌接種量>培養(yǎng)溫度,說明此組合的發(fā)酵過程中,時間對產(chǎn)粗纖維的影響最大,其次為混菌接種量、培養(yǎng)溫度。此組合固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)條件為B2D2C2A1,接種量10%,酵母第1 d接入,30 ℃發(fā)酵4 d,粗纖維素降解率達(dá)到38.89%。

表9 粗纖維素降解率結(jié)果分析表Table 9 Analysis results of curde cellulose degradation rate

表10 粗纖維素降解率結(jié)果分析表Table 10 Analysis results of curde cellulose degradation rate

2.2.8 長枝木霉、黑曲霉和假絲酵母組合 由表10可知,極差依次為D>A>B>C,即發(fā)酵時間>培養(yǎng)溫度>混菌接種量>酵母接入時間,說明發(fā)酵時間對產(chǎn)粗纖維的影響最大,其次為培養(yǎng)溫度及酵母接入時間,正交優(yōu)化結(jié)果:固態(tài)發(fā)酵條件為D2A2B3C3,混菌接種量15%,酵母在2 d后接入,33 ℃發(fā)酵4 d,粗纖維素降解率達(dá)到23.53%。

綜上,以纖維素酶活為指標(biāo),選擇的最優(yōu)組合為綠色木霉、黑曲霉和假絲酵母組合,其正交優(yōu)化結(jié)果為:混菌接種量為5%,酵母與混菌同時接入,30 ℃發(fā)酵3 d。以粗纖維降解率為指標(biāo):選擇的最優(yōu)組合為長枝木霉、青霉和假絲酵母組合。

3 結(jié)論

本實驗采用產(chǎn)生纖維素分解酶的菌株(綠色木霉、黑曲霉、長枝木霉和青霉)與酵母菌(假絲酵母)混合固態(tài)發(fā)酵(混菌比例1∶1∶1),即同步糖化發(fā)酵。經(jīng)優(yōu)化分析得出:以纖維素酶活為指標(biāo),最優(yōu)組合為綠色木霉、黑曲霉和假絲酵母組合,其正交優(yōu)化結(jié)果為:混菌接種量為5%,酵母與混菌同時接入,30 ℃發(fā)酵3 d。以粗纖維降解率為指標(biāo):最優(yōu)組合為長枝木霉、青霉和假絲酵母組合,正交優(yōu)化結(jié)果為:接種量10%,酵母第1 d接入,30 ℃發(fā)酵4 d。

在混菌固態(tài)發(fā)酵過程中,霉菌能分泌多種纖維素酶,它們之間存在著協(xié)同作用。酵母可利用農(nóng)作物秸稈的降解產(chǎn)物單糖、多糖和氨基酸等,并將其轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)等其他物質(zhì),從而大大提高纖維素酶活性,這促進(jìn)了秸稈作為飼料在動物體內(nèi)的消化吸收,提高了秸稈的利用率及營養(yǎng)價值。

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Study on the solid state fermentation of straw with multiple strains

REN Xie-ke1,2,CHEN Li1,2,*,LU Hong-mei1,2,SHE Rong-hong3, JIA Qing-hui2,3,ZHANG Yu-mei1,2,BAI Cheng-song1,2

(1.College of Wine and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550003,China; 2.Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy of Guizhou Province Guizhou University,Guiyang 550003,China； 3.College of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

In this study,Trichodermaviride,Aspergillusniger,Candidautilis,PenicilliumandLongibrachiatumRifaiwere used as fungi,4 factors(fermentation temperature,time,inoculation amount of mixed bacteria and the time of yeast access)were selected on the basis of single factor experiment.The orthogonal experiments of solid state fermentation were carried out(the ratio of mixed bacteria was 1∶1∶1),the optimum fermentation conditions were determined by measuring the cellulase activity and the degradation rate of crude cellulose.The results showed that with cellulase activity as the index,the highest activity of the enzyme was the combination ofTrichodermaviride,AspergillusnigerandCandidautilis,the inoculation amount of mixed bacteria was 5%,fermentation time was 3 days,yeast and mixed bacteria were accessed at the same time,the fermentation temperature was 30 ℃ and the cellulase activity was 85.73 U/mL. Based on the degradation rate of crude cellulose,the highest degradation rate was the combination ofLongibrachiatumRifai,PenicilliumandCandidautilis,the inoculation amount of mixed bacteria was 10%,and the degradation rate of cellulose reached 38.89% when the yeast was inoculated on the first day and fermented at 30 ℃ for 4 days.After the solid-state fermentation of mixed bacteria,the nutritional value of crops were improved and can be used as a high-quality feed to feed livestock. This will play a positive role in making full use of renewable resources and improving rural environmental pollution.

straw;mixed fermentation;cellulose;solid state fermentation

2016-10-28

任勰珂(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：15985156558@163.com。

*通訊作者:陳莉(1981-)，女，碩士，副教授，研究方向：微生物，E-mail：chen_ccll@126.com。

貴州省科學(xué)技術(shù)基金([2009]2088)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0130-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.017