丁超瓊，李娟娟，李洋洋，俞繼華，王萬軍，廖海，周嘉裕

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都610031)

決明胰蛋白酶抑制劑2基因的克隆與不同脅迫條件下的表達(dá)模式

丁超瓊，李娟娟，李洋洋，俞繼華，王萬軍，廖海*，周嘉裕*

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都610031)

克隆決明胰蛋白酶抑制劑2(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor 2，COTI2)基因序列，并考察其在不同環(huán)境下的表達(dá)模式。利用RACE方法克隆了COTI2基因的部分序列，利用定量PCR考察其在鹽、低溫、干旱及ABA處理下的表達(dá)模式。從決明種子cDNA中克隆出了長度為565 bp的基因片段，該片段具有典型的Kunitz蛋白酶抑制劑基因家族的結(jié)構(gòu)域。將得到的序列提交Gen-Bank，序列號(hào)為ku745416。對(duì)獲得的COTI2的氨基酸序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)COTI2的P1位殘基為Ser38。COTI2與其它植物KTI的氨基酸序列的進(jìn)化分析表明，其與楊樹的同源性較近。定量PCR結(jié)果表明COTI2在不同環(huán)境下具有不同的表達(dá)模式。這為研究COTI2基因的功能及分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

決明;Kunitz蛋白酶抑制劑;克隆;表達(dá)模式

Kunitz胰蛋白酶抑制劑(Kunitz trypsin inhibitor，KTI)是一類主要存在于植物貯存器官中的天然多肽，能夠特異性地抑制(類)胰蛋白酶的活性。KTI屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族中的成員，由1條或2條肽鏈組成，分子量在20 000 Da左右，主要由β-折疊與Loop結(jié)構(gòu)組成其三維結(jié)構(gòu)(Wang et al.2013)［1］。

KTI與植物抗逆能力息息相關(guān)，是植物響應(yīng)生物與非生物脅迫的重要抗逆因子，其生理功能涉及保護(hù)儲(chǔ)存蛋白、調(diào)節(jié)內(nèi)源蛋白酶的活性、保護(hù)個(gè)體免受昆蟲和病原體的侵害、抑制癌細(xì)胞侵襲擴(kuò)散、抗炎、抗真菌等作用。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將外源KTI基因?qū)霟煵莸戎参?，不僅能夠明顯提高轉(zhuǎn)基因植物抗御微生物、病蟲害的能力，也能夠提高對(duì)干旱、鹽與低(高)溫的低抗能力［2］。近期還發(fā)現(xiàn)，KTI與植物組織器官的發(fā)育存在緊密聯(lián)系，含有KTI基因的轉(zhuǎn)基因植物發(fā)生了表型改變［3］。然而，由于KTI氨基酸序列同源性較低，通過設(shè)計(jì)簡并引物完成基因克隆較為困難，這極大限制了KTI的深入研究與應(yīng)用。

決明子為豆科植物決明(Cassia obtusifolia)的干燥成熟種子，為傳統(tǒng)中藥材，在我國有著悠久的藥食兩用歷史［4］。筆者在前期研究中已發(fā)現(xiàn)決明子中含有KTI［5］。近期，我們首次獲得了決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過功能注釋從中篩選出決明KTI的候選Unigene，并將其命名為決明胰蛋白酶抑制劑2(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor 2，COTI2)［6］。該Unigene長度為404個(gè)堿基，含有不完整的3'與5'-末端。本文從決明種子中提取總RNA，根據(jù)該Unigene的序列信息設(shè)計(jì)引物，通過3'-RACE獲得了COTI2完整的3'-末端，并利用定量PCR分析COKTI3基因在低溫、鹽、干旱等不同脅迫與ABA處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式，這為研究該基因的功能及生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物組織的準(zhǔn)備與不同處理

成熟種子購自四川省中醫(yī)藥公司，經(jīng)鑒定為豆科植物決明(Cassia obtusifolia)種子。決明種子經(jīng)70%乙醇消毒30 s后，浸泡于含0.1%氯化高汞的溶液中10 min，蒸餾水沖洗3遍，接種于MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為25℃恒溫，16 h光照和8 h黑暗交替。種子萌發(fā)一周后的決明幼苗即作為不同脅迫與激素處理實(shí)驗(yàn)的植物材料。低溫脅迫是以4℃培養(yǎng);干旱與鹽脅迫是將決明幼苗分別培養(yǎng)于含有PEG 6000(100 mg/mL)與NaCl(200 mM)的MS液體培養(yǎng)基;生長激素處理是將決明幼苗置于含有ABA(100μM)的液體培養(yǎng)液中。分別于處理前0、1、6、12、24和48 h收集決明葉片，液氮速凍，保存于－70℃低溫冰箱待用。

1.2 決明總RNA的提取與cDNA的制備

決明葉片總RNA的提取按照試劑盒說明進(jìn)行(OMEGA，USA)，并加入終濃度為1 U/μg的DNaseⅠ去除DNA污染。利用核酸定量儀與1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測RNA的濃度與完整性。cDNA的合成按照試劑盒說明進(jìn)行(Takara，Japan)，oligo (dT)18引物由上海生工合成。

1.3 COTI2基因克隆與序列分析

根據(jù)決明轉(zhuǎn)錄組中COTI2基因的部分序列，設(shè)計(jì)兩條正向引物3RW與3RN(引物序列請(qǐng)參見表1)，采用巢氏PCR。第1輪PCR的引物為Oligo dT (18)和3RW;第2輪引物為3RP和3RN，反應(yīng)體系為cDNA 1μl、dNTP 4μl、2個(gè)引物各0.5μl、10× Ex Taq Buffer2.5μl、MgCl22μl、Ex Taq 0.25μl、用雙蒸水補(bǔ)足25μl。PCR擴(kuò)增步聚為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸3 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10 min，4℃保存。第2輪PCR除退火溫度改為53℃以外，其余條件均不變。用1%瓊脂糖凝膠檢測及回收PCR產(chǎn)物，連接至PMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將獲得的3’Race結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接后，得到?jīng)Q明COTI2基因的部分cDNA序列。通過BLAST比對(duì)確認(rèn)結(jié)果的正確性。

1.4 定量PCR表達(dá)分析

按方法1.2分別提取各種脅迫及激素處理的葉片RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以延伸因子EFla為內(nèi)參基因(正向引物為EF1a F，反向引物為EF1a R)，設(shè)計(jì)一對(duì)定量PCR引物(正向引物為COTI2F，反向引物為COTI2R)，在RNA轉(zhuǎn)錄水平上比較COTI2基因的表達(dá)情況。所有定量PCR引物均確保溶解曲線為單峰。PCR擴(kuò)增體系包括5μl SYBRPremix Ex Taq TM II，1μl cDNA，引物(10μM)各0.4μl，總體積為15μl，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，采用LightCycler96軟件提供的ΔΔCt-法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(Liu et al 2015b)［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 COTI2基因序列的克隆

以決明轉(zhuǎn)錄組中COTI2基因的部分序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過3'-Race，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離出一條長約565 bp的片段，測序后，與轉(zhuǎn)錄組中的序列信息進(jìn)行比對(duì)、拼接，獲得COTI2基因序列，Gen-Bank登錄號(hào)(圖1)。

NCBI在線分析結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)表明，COTI2具有KTI基因家族的序列特征(圖2)，同時(shí)含有一個(gè)靠近N-末端的活性中心環(huán)，說明所獲得的基因序列屬于KTI基因家族。

表1 本文采用的引物Table 1 Primers used in the paper

圖1 COTI2的核酸序列與蛋白質(zhì)序列Fig.1 Nucleic acid and protein sequence of COTI2

2.2 COTI2與其它植物來源KTI的序列比對(duì)

同源性分析發(fā)現(xiàn)，COTI2與其它植物KTI氨基酸序列同源性較高，具有植物KTI的3個(gè)保守Cys殘基，分別為Cys64、Cys108與Cys156。COTI2編碼的氨基酸序列與楊樹trypsin protein inhibitor 3氨基酸序列同源性最高，為46%。將COTI2蛋白與其它物種中已報(bào)道胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行比對(duì)(圖3)并繪制系統(tǒng)發(fā)生樹，發(fā)現(xiàn)其與豆科植物花生AhTI的親緣關(guān)系較近(圖4)。

2.3 CoTI2的表達(dá)模式分析

為了驗(yàn)證定量PCR引物的有效性，首先利用瓊脂糖凝膠電泳檢測定量PCR產(chǎn)物。圖5所示，定量PCR產(chǎn)物的長度在180～200 bp左右，與實(shí)際定量PCR產(chǎn)物長度(188 bp)基本吻合。該定量PCR產(chǎn)物經(jīng)過序列測定，與目的片段的一致性為100%，表明引物設(shè)計(jì)正確、合理，能夠用于后續(xù)的定量PCR實(shí)驗(yàn)。對(duì)決明幼苗進(jìn)行低溫、鹽、干旱和ABA處理后，分析COTI2的表達(dá)情況。COTI2對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)隨時(shí)間的變化不同。在干旱脅迫下，隨著時(shí)間的延長，COTI2的表達(dá)明顯上升，表達(dá)量峰值出現(xiàn)在24 h。在低溫脅迫與ABA處理下，COTI2的表達(dá)變化相同，即表達(dá)量逐漸增加，在12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)峰值。COTI2對(duì)鹽脅迫不敏感，表達(dá)比較穩(wěn)定(圖6)。

圖2 COTI2基因的保守區(qū)分析Fig.2 Conserved domains of COTI2

圖3 COTI2基因的序列比對(duì)Fig.3 Sequence alignment of COTI2

圖4 COTI2基因的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4 Phylogenetic tree of COTI2

圖5 定量PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.5 Agarose gel of product of realtime-PCR

3 討論

植物來源的KTI通常形成多基因家族，比如在鷹嘴豆、三葉草、擬南芥及苜蓿等植物中分別含有2、4、6與13條Kunitz蛋白酶抑制劑基因［8－10］。對(duì)決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，已從中發(fā)現(xiàn)2條KTI基因，分別命名為COTI1與COTI2。目前，筆者已成功克隆了COTI1基因，其編碼蛋白能夠有效抑制棉鈴蟲等鱗翅目害蟲腸道內(nèi)消化酶的活性，該基因表達(dá)量在鹽脅迫、干旱條件下均呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢，在ABA條件下呈現(xiàn)上調(diào)－下降－再上調(diào)的趨勢，而在低溫脅迫下表達(dá)比較穩(wěn)定［11］。

圖6 決明葉片中COTI2在不同脅迫及激素處理后的表達(dá)Fig.6 COTI2 expression in leaves under various stress and hormone treatment

本文首次克隆了決明COTI2基因的部分序列，所獲序列包括了COTI2基因編碼蛋白的抑制中心，即Ala36-Arg37-Ser38-Gly29-Ala40，其中P1位點(diǎn)殘基為Ser38。P1位點(diǎn)氨基酸殘基在Kunitz蛋白酶抑制劑抑制靶酶的過程中，發(fā)揮了關(guān)鍵作用。該位點(diǎn)通常是堿性的Arg或Lys(如大豆STI的Arg87，銀合歡Kunitz蛋白酶抑制劑的Arg64，決明COTI1的Arg86)，能夠與(類)胰蛋白酶底物口袋中的Asp殘基形成氫鍵，從而發(fā)揮特異性抑制作用。然而P1位點(diǎn)殘基并非絕對(duì)保守，比如鳳凰木與甘薯Kunitz蛋白酶抑制劑P1位氨基酸殘基是Glu，該殘基可能與Ser形成一個(gè)口袋并與胰蛋白酶的Arg和(或)Lys結(jié)合［12－13］。而在鷹嘴豆Kunitz蛋白酶抑制劑的分子結(jié)構(gòu)中，Gly/Glu-Ileu-Ser基序取代Arg/Lys殘基，行使P1位點(diǎn)功能［14］。進(jìn)一步比對(duì)COTI1與COTI2的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它們的氨基酸序列一致性僅為47%，推測COTI家族屬于“快速”進(jìn)化蛋白，其序列的變異性賦予了該家族蛋白的功能多樣化。Islam(2015)等發(fā)現(xiàn)三葉草中存在4種KTI基因，同源性介于46%～64%，它們?cè)谌~草不同組織中的表達(dá)量存在明顯差異，賦予三葉草抗逆能力的多樣化。

比較COTI1與COTI2在不同環(huán)境下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)COTI1對(duì)低溫脅迫不敏感，而COTI2對(duì)鹽脅迫不敏感;在ABA處理后，COTI1基因的表達(dá)量在24 h時(shí)到達(dá)最高，而COTI2基因的表達(dá)量在12 h時(shí)到達(dá)最高。這種表達(dá)模式的差異也同樣表明COTI家族的不同成員可能具有不同的生理作用。因此，研究COTI1與COTI2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及它們?cè)跊Q明抗逆分子機(jī)制中的作用將成為下一步研究工作的重點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯 陳虹)

Cloning of Trypsin Inhibitor Gene from Cassia obtusifolia and Its Expression under Various Stresses

DING Chao-qiong，LIJuan-juan，LIYang-yang，YU Ji-hua，WANGWan-jun，LIAO Hai*，ZHOU Jia-yu*
(Southwest Jiaotong University，School of Life Science and Engineering，Sichuan Chengdu 610031，China)

The present paper is to clone a trypsin inhibitor gene from Cassia obtusifolia(COTI2)and study itsexpression under various stresses.The partial cDNA，including the complete3-terminal cDNA of the COTI2 genewas isolated by RACE technique.The expression under various stresseswas studied with real time-PCR.The result showed that COTI2 gene contained 565 bp and contained typical domain of Kunitz inhibitors.The P1 residue of COTI2 was composed of Ser38.Multiple alignment analysis based on amino acids of Kunitz inhibitor genes from various plants indicated that COTI2 had the highest similaritywith Populus trichocarpa.Therewere the expression patternsof COTI2 under various stresses.The research would provide a basis for further study on genetic function and regulatorymechanism of COTI2.

Cassia obtusifolia;Kunitz trypsin inhibitor;Clone;Expression patterns

Q943.2

A

1001－4829(2017)2－0251－05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.002

2016－03－10

國家自然科學(xué)基金(31371232，31500276);成都市科技技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目(2015-HM01-00051-SF);國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(201510613070)

丁超瓊(1995－)，女，陜西紫陽人，研究方向?yàn)樯镏扑幑こ?，Tel:18380135338，E-mail:1628772333@qq.com，*為通訊作者:廖海，Tel:(028)87600965，E-mail:ddliaohai@ home.swjtu.edu.cn，周嘉裕，Tel:(028)87600965，E-mail:spinezhou@home.swjtu.edu.cn。