盧冰霞，何穎，趙武，梁家幸，段群棚，蔣冬福，盧敬專，閉炳芬，周英寧，秦毅斌，李斌，蘇乾蓮，陳忠偉

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001)

應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)化豬細(xì)小病毒N株在IBRS-2細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)

盧冰霞，何穎，趙武，梁家幸，段群棚，蔣冬福，盧敬專，閉炳芬，周英寧，秦毅斌，李斌，蘇乾蓮，陳忠偉*

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001)

利用正交試驗(yàn)對豬細(xì)小病毒(PPV)N株在IBRS-2細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)中的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為PPV N株弱毒疫苗的大量培養(yǎng)工藝提供參考。設(shè)細(xì)胞培養(yǎng)液pH值(7.0、7.2和7.4)、接毒時(shí)間(0、24和48 h)、接毒劑量(0.10%、1.00%和10.00%)、收毒時(shí)間(48、72和96 h)等因子和水平。結(jié)果表明，PPV N株轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件組合為細(xì)胞培養(yǎng)液pH值7.2，采用同步接毒，接毒劑量為0.10%，收毒時(shí)間為接毒后96 h。其中收毒時(shí)間是影響PPV N株毒價(jià)的最主要因素。

豬細(xì)小病毒;轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng);優(yōu)化;正交試驗(yàn)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的成員，屬于自主復(fù)制型病毒，是引起母豬繁殖障礙性疾病的最重要病原之一［1］。PPV直接導(dǎo)致感染母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、早期胚胎死亡、不育以及新生仔豬的大量死亡、仔豬的皮炎和腹瀉［2］。1967年P(guān)PV感染首發(fā)于英國，隨后世界各個(gè)國家均有流行和報(bào)道。目前，我國PPV感染十分嚴(yán)重，抗體陽性率高達(dá)90%以上。PPV主要通過消化道、呼吸道和生殖道傳播感染，豬是本病唯一的易感動物［3］。由于PPV分布非常廣泛，且對熱穩(wěn)定，因此對大部分消毒劑不敏感，污染的圈舍至少在4個(gè)月內(nèi)仍具感染性，難于根除［4］。PPV一旦傳入陰性豬場，幾乎3個(gè)月內(nèi)100%的豬只均會受到感染，且發(fā)生該病后豬場可能連續(xù)幾年都會不斷地出現(xiàn)母豬繁殖失敗［5－6］。近年來，該病的發(fā)病率呈上升趨勢，不僅造成養(yǎng)殖戶的巨大經(jīng)濟(jì)損失，甚至嚴(yán)重影響?zhàn)B豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展。PPV N株是廣西獸醫(yī)研究所從廣西初產(chǎn)母豬所產(chǎn)死胎臟器中分離到自然弱毒株并研發(fā)成免疫疫苗毒株，用該毒株免疫懷孕母豬，不產(chǎn)生病毒血癥，并能抵抗強(qiáng)毒的攻擊［7］。有關(guān)研究結(jié)果表明，該疫苗株能使豬產(chǎn)生良好的抗體反應(yīng)，且對母豬安全無害［8］。PPV N株是PPV弱毒疫苗理想的候選毒株之一。本研究從細(xì)胞培養(yǎng)液pH值、接毒時(shí)間、接毒劑量、收毒時(shí)間入手，研究四個(gè)因素對于PPV N株毒價(jià)影響的主次關(guān)系，進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝、提高PPV N株毒價(jià)，以期篩選到最佳工藝組合，為PPV N弱毒疫苗的大量培養(yǎng)工藝提供參考性數(shù)據(jù)。

表1 PPV N株培養(yǎng)工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Optimization of orthogonal experiment design for cultivation of PPV N strain

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試IBRS-2細(xì)胞，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，已在廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行擴(kuò)增凍存。PPV N株由廣西獸醫(yī)研究所病毒室保存，毒價(jià)為104.4TCID50/mL。MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，選取對PPV N株毒價(jià)影響較大的4個(gè)因素:培養(yǎng)液pH值(A)、接毒時(shí)間(B)、接毒劑量(C)、收毒時(shí)間(D)進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。具體方法如下:選取IBRS-2細(xì)胞長至較密單層的10 000 mL轉(zhuǎn)瓶6個(gè)，按照1∶3的比例均勻傳至18個(gè)10 000 mL轉(zhuǎn)瓶中。將18個(gè)轉(zhuǎn)瓶IBRS-2細(xì)胞隨機(jī)分組，按照正交試驗(yàn)表分組接毒，共分為9組，每組2個(gè)重復(fù)。接毒后逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)情況，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案分別收毒，凍融2次，取樣，用于毒價(jià)的測定。

1.3 病毒毒價(jià)的測定

優(yōu)化PPV N株在IBRS-2細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)條件，并收獲PPV N株病毒液進(jìn)行2次毒價(jià)測定，最后取毒價(jià)指數(shù)的平均值，作為該樣品的毒價(jià)。

毒價(jià)測定方法如下:按照常規(guī)方法培養(yǎng)IBRS-2細(xì)胞，將消化后的細(xì)胞鋪于5塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，長滿單層后棄去培養(yǎng)液，稀釋至10－3～10－8倍后，取經(jīng)維持液稀釋好的病毒樣品，加入上述96孔板，每個(gè)稀釋度8個(gè)重復(fù)，每孔100μl，置于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，逐日觀察CPE，計(jì)算TCID50。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用極差分析方法，對培養(yǎng)液不同pH值、不同接毒時(shí)間、不同接毒劑量和不同收毒時(shí)間等組合的累加毒價(jià)、平均毒價(jià)進(jìn)行計(jì)算，從而計(jì)算各組內(nèi)平均毒價(jià)的最大差距，即極差數(shù)值(R)，根據(jù)各組間極差的大小，判斷出各因素對毒價(jià)的影響程度。利用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，了解四因素對試驗(yàn)結(jié)果有無顯著性影響，從而得出PPV N株在IBRS-2細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)最佳條件組合。

1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

以正交試驗(yàn)確定的最佳培養(yǎng)條件組合，對PPV N株在IBRS-2細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，收獲病毒液進(jìn)行毒價(jià)測定，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析

從正交試驗(yàn)結(jié)果(表2)分析可知，4種因素的影響程度分別為收毒時(shí)間(R值=0.62)＞接毒時(shí)間(R值=0.11)＞接毒劑量(R值=0.07)=培養(yǎng)液pH值(R值=0.07)。因此，對毒價(jià)影響的主次因素依次為收毒時(shí)間、接毒劑量、接毒時(shí)間和培養(yǎng)液pH值。

另外通過對比各因素下各水平下的PPV N株毒價(jià)均值可知，直觀最佳組合條件為A2B1C1D3，即培養(yǎng)液pH值為7.2，接毒時(shí)間為0 h(也稱為同步接毒)，接毒劑量為0.10%，收毒時(shí)間為96 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

2.2 方差分析

從方差分析結(jié)果(表3)可知上述四因素P值均大于0.05，對試驗(yàn)結(jié)果均無顯著性影響，因此確定直觀最佳條件組合A2B1C1D3即培養(yǎng)液pH值為7.2，接毒時(shí)間為0 h(也稱為同步接毒)，接毒劑量為0.10%，收毒時(shí)間為96 h為理論最佳條件組合。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)理論最佳條件組合A2B1C1D3即培養(yǎng)液pH值為7.2，接毒時(shí)間為0 h(也稱為同步接毒)，接毒劑量為0.10%，收毒時(shí)間為96 h進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果(表4)可知，3次試驗(yàn)的病毒滴度分別為5.08、5.10、5.03 lgTICID50/mL，滴度平均值為5.07 lgTICID50/mL，變異系數(shù)為0.71%，說明優(yōu)化的試驗(yàn)條件具有較好的重復(fù)性。

3 討論

有關(guān)研究表明，PPV的復(fù)制須依靠細(xì)胞有絲分裂時(shí)期的一些酶的輔助，所以接種PPV要求在細(xì)胞進(jìn)行傳代的同時(shí)，或者細(xì)胞長到1/3的時(shí)候接種，但最遲不能晚于生長到2/3時(shí)進(jìn)行接種［9］。多數(shù)研究者采取同步接毒的方法進(jìn)行PPV培養(yǎng)，均得到較好的增殖效果。但倪嬌等用同步接種和待細(xì)胞約長至1/3時(shí)的分步接種法比較PPV(長春株)在PK15細(xì)胞中的增殖時(shí)，發(fā)現(xiàn)分步接種法比同步接種法獲得的病毒血凝效價(jià)和TCID50均稍微偏高［10］。本研究將PPV N株以同步接種、傳代后24 h接毒和傳代后48 h接毒3種接毒條件進(jìn)行對比，結(jié)果表明同步接種方式收獲病毒液的病毒含量高于其他兩種，與其他多數(shù)研究者的研究結(jié)果相符。分析這可能與PPV增殖時(shí)需要利用細(xì)胞S期DNA聚合酶有關(guān)［11］。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

表4 重復(fù)性試驗(yàn)Table 4 Reproducibility test

本研究對比分析3種不同的接毒劑量對PPV N株增殖的影響，結(jié)果表明以0.10%的接毒劑量接毒時(shí)，收獲病毒液中的病毒含量最高。分析可能是由于接毒劑量高時(shí)，病毒液中含有較多的細(xì)胞的代謝產(chǎn)物、揮發(fā)性產(chǎn)物，反而不利于細(xì)胞生長和病毒增殖。

PPV病毒培養(yǎng)中，獲得高含量病毒液的關(guān)鍵因素之一是病毒收獲時(shí)間的確定。收毒時(shí)間過早，病毒增殖不夠充分;收毒過晚而使部分病毒衰滅，從而導(dǎo)致收獲病毒的含量降低。本研究比較了病毒接毒后48、72和96 h3種不同的收毒時(shí)間條件下，收獲的病毒液中病毒含量的高低。結(jié)果表明，接毒后96 h收獲的病毒液中病毒含量明顯高于其他兩個(gè)收毒時(shí)間。

本研究應(yīng)用正交試驗(yàn)獲得了PPV N株在IBRS-2細(xì)胞上的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的最佳條件組合，將病毒毒價(jià)從104.4TCID50/mL提高到105.07TCID50/mL左右，提高了病毒的增值效率，且具有較好的重復(fù)性，為PPV弱毒疫苗的開發(fā)提供了可參考性數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，PPV N株在IBRS-2細(xì)胞上轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的最佳條件組合為:細(xì)胞培養(yǎng)液pH值為7.2，采用同步接毒，接毒劑量為0.10%，收毒時(shí)間為接毒后96 h。其中收毒時(shí)間是影響PPV毒價(jià)的最主要因素。

［1］Ellis JA，Bratanich A，Clark E，etal.Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigswith naturally acquired postweaningmultisystemic wasting syndrome［J］.JVet Diag Invest，2000，12 (1):21－27.

［2］Opriessnig T，F(xiàn)enaux M，Yu S，etal.Effectof porcine parvovirus vaccination on the developmentof PMWS in segregated earlyweaned pigs coinfected with type2 porcine circovirusand porcine parvovirus［J］.Vet Microbiol，2004，98(3－4):209－220.

［3］阮景軍.重新評估豬細(xì)小病毒的危害性［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2007，26(4):54－56.

［4］張超范，崔尚金，戚亭，等.豬細(xì)小病毒細(xì)胞適應(yīng)株的培育及鑒定［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30(5):362－366.

［5］Bican J，Svoboda S，Drabek J.Porcine parvovirus infection in boars in the czech republic［J］.Acta Veterinaria Brno，2002，71(1):45－49.

［6］Shackelton L A，Hoelzer K，Parrish C R，et al.Comparative analysis reveals frequent recombination in the parvoviruses［J］.The Journal of General Virology，2007，88(Pt12):3294－330.

［7］蔣玉雯，黃安國，鄭儒標(biāo)，等.豬細(xì)小病毒N株的生物學(xué)和免疫學(xué)特性研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1992，23(1):73－79.

［8］白安斌，杜堅(jiān)，姚瑞英，等.豬細(xì)小病毒N株弱毒苗田間試驗(yàn)［J］.廣西畜牧獸醫(yī)，2006，22(6):248－250.

［9］殷華平，郭萬柱，徐志文，等.豬細(xì)小病毒(PPV)SC1株的分離鑒定［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006(7):63－65.

［10］倪嬌，趙建增，劉長輝，等.豬細(xì)小病毒在PK15細(xì)胞中增殖規(guī)律的研究［J］.中國獸藥雜志，2009，43(1):21－24.

［11］姚龍濤.豬病毒?。跰］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2000:216－217.

(責(zé)任編輯 汪羽寧)

Optim ization of IBRS-2 Cells Culturing Condition for Cultivation of Porcine Parvovirus N Strain Using Roller Bottle

LU Bing-xia，HE Ying，ZHAOWu，LIANG Jia-xing，DUAN Qun-peng，JIANG Dong-fu，LU Jing-zhuan，BIBing-fen，ZHOU Ying-ning，QIN Yi-bin，LIBin，SU Qian-lian，CHEN Zhong-wei*
(Guangxi Veterinary Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Guangxi Nanning 530001，China)

The orthogonal design was used to optimize the culture conditions，of PPV N strain in IBRS-2 cell cultivated in roller bottles to provide reference for themass culture of PPV N attenuated vaccine.Affected factorswere as follows:the pH value(7.0，7.2，7.4)，the time of inoculation(0，24，48h)，the dose of toxin(0.10%，1.00%，10.00%)and the time of harvesting(48，72，96 h).Results showed that the best culture conditions of PPV N strain IBRS-2 cells cultivated in roller bottleswere as follows:pH=7.2，synchronization inoculation，0.10%inoculation dose，harvesting the virus solution 96 h after inoculation.Virus solution harvest time is themost important factor affecting the virus titer of PPV N strain.

Porcine parvovirus;Cells culture using roller bottle;Optimize;Orthogonal experiment

S855.3

A

1001－4829(2017)2－0470－04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.038

2016－12－05

廣西公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)項(xiàng)目(桂科專項(xiàng)15-2，桂科專項(xiàng)16-2);廣西水產(chǎn)畜牧科技項(xiàng)目(桂漁牧科201528030，201633034)

盧冰霞(1986－)，女，廣西桂平人，碩士，助理研究員，主要從事動物病毒學(xué)研究工作，E-mail:lubingxia13@163.com，*為通訊作者，E-mail:chen zhong-wei@163.com。