華濤，馮磊，張雪花，唐波，常晨，劉國(guó)陽(yáng)，吳培培，陳麗，張道華*，侯繼波*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014;2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009)

PK-15細(xì)胞在微載體懸浮放大培養(yǎng)及PCV2增殖工藝研究

華濤1，2，馮磊1，2，張雪花1，2，唐波1，2，常晨1，2，劉國(guó)陽(yáng)1，2，吳培培1，2，陳麗1，2，張道華1，2*，侯繼波1，2*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210014;2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009)

為建立在生物反應(yīng)器內(nèi)微載體逐級(jí)放大培養(yǎng)PK-15細(xì)胞和增殖PCV2技術(shù)。采用分批式培養(yǎng)方法，研究了PK-15細(xì)胞在微載體胰酶消化放大懸浮培養(yǎng)及豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)增殖工藝。結(jié)果表明，5 g/L的微載體和高糖DMEM下，采用4.0×105cells/mL的初始接種密度及培養(yǎng)至第2天進(jìn)行換液操作工藝可以獲得最佳的PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)效能。胰酶消化轉(zhuǎn)移將PK-15細(xì)胞從1 L反應(yīng)器放大至3 L反應(yīng)器，微載體上細(xì)胞貼附均勻、生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)3 d細(xì)胞密度可達(dá)34.3×105cells/mL。采用感染復(fù)數(shù)為0.1的接毒比例，細(xì)胞接毒后在微載體上傳至第3代收獲毒液可獲得最高的PCV2增殖效價(jià)107.25TCID50/mL。為PCV2疫苗的生物反應(yīng)器規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

PK-15細(xì)胞;微載體;消化放大;豬圓環(huán)病毒2型;懸浮培養(yǎng)

豬圓環(huán)病毒(PCV)發(fā)現(xiàn)于1974年，作為PK-15細(xì)胞的污染被命名為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)，動(dòng)物試驗(yàn)證明其沒(méi)有致病性［1］。自20世紀(jì)90年代初，由豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，PCV2給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的損失，各國(guó)政府和養(yǎng)豬企業(yè)加大了對(duì)豬圓環(huán)相關(guān)疾病(PCVAD)防治的關(guān)注和投入［2］。疫苗免疫是預(yù)防PCVAD最有效的手段，國(guó)內(nèi)外PCVAD的商品化疫苗主要有3類(lèi):全病毒滅活疫苗、重組毒滅活疫苗和亞單位疫苗［3－4］。由于全病毒滅活疫苗生產(chǎn)成本相對(duì)較低，并具有優(yōu)良免疫效果，在我國(guó)市場(chǎng)上使用較廣，且國(guó)內(nèi)廠(chǎng)家主要生產(chǎn)滅活疫苗，但多數(shù)廠(chǎng)家PCV2的增殖滴度較低［5］。PCV感染宿主細(xì)胞后，病毒采用滾環(huán)復(fù)制模式進(jìn)行復(fù)制，在細(xì)胞生長(zhǎng)的S期復(fù)制效率較高，隨宿主細(xì)胞復(fù)制而復(fù)制，因此PCV2的復(fù)制周期比其他病毒長(zhǎng)，這為研制高效的PCV2疫苗帶來(lái)了障礙［6－7］。PCV2滅活疫苗生產(chǎn)方式依然延用了傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室大方瓶或滾瓶連續(xù)傳代培養(yǎng)方式，占地面積大，工序操作繁瑣，瓶與瓶之間病毒增殖滴度的不穩(wěn)定。在生物反應(yīng)器中以持續(xù)攪拌的方式進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)，微載體提供了更大的細(xì)胞貼壁表面積，而且反應(yīng)器能自動(dòng)監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)或病毒繁殖時(shí)的最適生化條件，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氣體及熱量的傳遞更加充分均勻，為細(xì)胞生長(zhǎng)及病毒增殖提供相對(duì)優(yōu)質(zhì)、恒定的培養(yǎng)環(huán)境，整個(gè)生物過(guò)程控制精確，易于重復(fù)，保證了疫苗產(chǎn)品批次間質(zhì)量的一致性，并具備規(guī)模放大的可能性［8－9］。國(guó)內(nèi)眾多疫苗廠(chǎng)家進(jìn)行了微載體擴(kuò)增PCV2研究，主要集中在多聚糖球形和紙片微載體培養(yǎng)，培養(yǎng)工藝均采用滾瓶或方瓶到反應(yīng)器的一次性放大工藝［10－11］。雖獲得了較高的病毒滴度，但前期所需滾瓶量非常大，才能在反應(yīng)器上進(jìn)行一次性高密度放大，且沒(méi)有進(jìn)行微載體傳代培養(yǎng)的報(bào)道，無(wú)法在反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行無(wú)毒細(xì)胞－接毒－多次傳代－收毒的工業(yè)放大，使其在密閉的反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行。由于PK-15細(xì)胞耗能比較大，如何選用營(yíng)養(yǎng)成分較高的培養(yǎng)基，以及如何換液補(bǔ)料成為制約PK-15細(xì)胞高效增殖的主要障礙;另外由于PCV2復(fù)制效率較低，需要PK-15細(xì)胞帶毒傳代，而細(xì)胞帶毒后易產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象，較高的接毒強(qiáng)度反而不利于細(xì)胞的有效復(fù)制，無(wú)法達(dá)到較高的病毒滴度。因此如何為PK-15細(xì)胞提供適宜生長(zhǎng)條件，以及多大的接毒劑量，成為無(wú)毒細(xì)胞擴(kuò)增－接毒－多次傳代－收毒的工業(yè)放大過(guò)程中的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究建立了微載體逐級(jí)放大培養(yǎng)工藝培養(yǎng)PCV2，為在反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行無(wú)毒細(xì)胞擴(kuò)增－接毒－傳代－收毒的工業(yè)放大提供試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒

PCV2-DBN-SX07(Genbank No.:FJ660968)由國(guó)家獸用生物制品工程中心保存［12］;PK-15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 材料

Cytodex 1購(gòu)自GE公司。首先稱(chēng)取一定量的Cytodex 1置于二甲基二氯硅烷硅化的瓶子內(nèi)，加入PBS(pH 7.2)水化，比例約為80～150 mL/g Cytodex 1，約3 h后將PBS傾去，加入新的PBS，高壓滅菌121℃，30 min，冷卻后傾去PBS，用培養(yǎng)基洗漆1次后傾去，重新加入新鮮培養(yǎng)基置4℃?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞培養(yǎng)液MEM、高塘DMEM和新生牛血清購(gòu)自GIBICO公司。配制含有10%新生牛血清的MEM和DMEM培養(yǎng)液，含100 IU/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素，經(jīng)無(wú)菌0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，置4℃?zhèn)溆?。胰蛋白酶?gòu)自GIBICO公司，用無(wú)Ca2+、Mg2+離子磷酸鹽緩沖液配制成0.25%濃度胰蛋白酶溶液，調(diào)整pH至7.5～8.0，經(jīng)無(wú)菌0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 設(shè)備

滾瓶設(shè)備購(gòu)自瑞士IBS公司，培養(yǎng)體積為250 mL。1和3 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器購(gòu)自荷蘭Applicon，121℃高壓滅菌30 min用于PK-15細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)，反應(yīng)器培養(yǎng)體積0.8和2.4 L，具有溶氧、pH、溫度、轉(zhuǎn)速及四氣(N2、O2、CO2及空氣)控制系統(tǒng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響微載體濃度在3 mg/mL條件下，PK-15細(xì)胞接種密度為2.0×105cells/mL接種1 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器，轉(zhuǎn)速均為40 r/ min，溶氧飽和度為50%，溫度37℃，pH 7.0，觀察含10%血清高糖DMEM和MEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

1.4.2 細(xì)胞接種量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不同初始細(xì)胞密度2.0×105、4.0× 105和6.0×105cells/mL的PK-15細(xì)胞分別接種于1 L動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器中，微載體用量分別為3 g/L，觀察不同初始密度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，確定最佳接種細(xì)胞密度。

1.4.3 微載體濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響在優(yōu)化細(xì)胞接種密度的基礎(chǔ)上，在含10%血清高糖DMEM，接種細(xì)胞密度4.0×105cells/mL條件下，觀察3、5、7 mg/mL微載體濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1.4.4 微載體消化狀態(tài)條件的確定PK-15細(xì)胞增殖3 d后，Cytodex 1微載體上細(xì)胞生長(zhǎng)成單層時(shí)，進(jìn)行在位消化轉(zhuǎn)移放大，首先停止攪拌，待微載體完全沉降將培養(yǎng)基排出，37℃溫浴的PBS以約100 mL/g微載體清洗3次，去除殘留的培養(yǎng)基。加入37℃溫浴的胰酶，50 mL/g微載體，在37℃消化，在5、10、15 min取樣0.2 mL，加入0.2 mL培養(yǎng)基進(jìn)行中止，在顯微鏡下觀察消化情況。消化完全后，接種細(xì)胞密度4.0×105cells/mL到下一級(jí)生物反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，補(bǔ)加微載體至5 mg/mL，補(bǔ)加原有培養(yǎng)基體積后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d換掉培養(yǎng)基一半，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.4.5 不同接毒量在微載體上消化放大培養(yǎng)根據(jù)摸索的培養(yǎng)工藝，PK-15細(xì)胞在反應(yīng)器中驗(yàn)證其放大培養(yǎng)PCV2工藝的可行性。細(xì)胞培養(yǎng)罐安裝完畢后，微載體為4 g/L，初始細(xì)胞密度4.0×105cells/mL，轉(zhuǎn)速為40 r/min。第一級(jí)生物反應(yīng)器中培養(yǎng)24 h后，PCV2以不同感染復(fù)數(shù)(MOI)接入含有相同PK-15細(xì)胞密度微載體培養(yǎng)物中，MOI為0.5、0.1和0.05。接毒后2 d，進(jìn)行帶毒細(xì)胞傳代，每代取樣測(cè)定PCV2效價(jià)，確定最佳接毒MOI和最佳收貨時(shí)間。微載體上的細(xì)胞傳代培養(yǎng)方式:用胰酶消化完全后，接種細(xì)胞密度4.0×105cells/mL到下一級(jí)生物反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，補(bǔ)加微載體至5 mg/mL，加入培養(yǎng)基進(jìn)入下一級(jí)生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，工作體積為0.8 L，在培養(yǎng)第2天換掉一半培養(yǎng)基。以上生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)均為:pH 7.0，溶氧飽和度為50 %，溫度37℃，攪拌速度40 r/min。

1.5 細(xì)胞技術(shù)和計(jì)算方法

細(xì)胞密度測(cè)定:均勻吸取微載體培養(yǎng)樣品，離心去除上清，用PBS洗3遍，0.25%胰酶溶液于37℃消化10 min獲得游離細(xì)胞。進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，血球計(jì)數(shù)板計(jì)算活、死細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率和細(xì)胞密度。每天取樣測(cè)定，繪制PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.6 葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨測(cè)定

葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和氨的濃度測(cè)定均采用Nova 400全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。方法為:收取微載體培養(yǎng)樣品，10 000 r/min離心取上清，在Nova 400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定以上細(xì)胞基本代謝情況。

1.7 PCV2滴度測(cè)定

含10%血清正常培養(yǎng)的PK-15細(xì)胞在96孔板上長(zhǎng)至單層時(shí)，接入連續(xù)10倍稀釋的病毒樣品，每個(gè)稀釋度接入8個(gè)孔，每孔200μl，接毒后4 d進(jìn)行間接免疫熒光。PK-15細(xì)胞無(wú)水乙醇固定1 h，0.5‰Tween-20的PBS(PBST)洗滌后加入PCV2陽(yáng)性豬血清(1∶200)，37℃孵育1 h，PBST洗滌5次，每次5 min。加入FITC-SPA熒光二抗(1∶200)，37℃孵育l h，PBST洗滌5次，每次5 min，于熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞孔數(shù)。按Karber方法計(jì)算病毒滴度，結(jié)果以1 mL中半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50/mL)表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s多重分析，比較各組差異，以不同字母表示差異顯著(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

在3 g/L微載體濃度條件下，初始細(xì)胞接種密度為2.0×105cells/mL，采用高糖DMEM和MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的PK-15細(xì)胞，如圖1所示。高糖DMEM培養(yǎng)基所獲得細(xì)胞密度為18.2×105個(gè)/ mL，是MEM培養(yǎng)基的1.42倍，高糖DMEM培養(yǎng)效果優(yōu)于MEM培養(yǎng)基。且在細(xì)胞生長(zhǎng)后期MEM培養(yǎng)基所獲得的細(xì)胞存活率顯著低于高糖DMEM。

2.2 不同PK-15細(xì)胞接種密度對(duì)其在微載體上生長(zhǎng)影響

微載體濃度為3 g/L時(shí)，初始細(xì)胞接種密度為2.0×105、4.0×105和6.0×105cells/mL，使PK-15細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈現(xiàn)差異性變化(圖2)。低初始細(xì)胞密度2.0×105cells/mL使PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)延遲，細(xì)胞生長(zhǎng)缺乏初始密度，造成微載體上細(xì)胞分布較少，同時(shí)還存在很多空的微載體(圖3A)。6.0×105cells/mL的高初始細(xì)胞密度可使PK-15細(xì)胞快速進(jìn)入生長(zhǎng)期，但細(xì)胞存活率相對(duì)較低，這可能是細(xì)胞密度較大導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)，或單個(gè)微載體分配細(xì)胞較多導(dǎo)致游離細(xì)胞不粘附的現(xiàn)象，不能提供有效生長(zhǎng)表面(圖3C)。4.0×105cells/mL相對(duì)適中的初始細(xì)胞密度接種與微載體上培養(yǎng)時(shí)，PK-15細(xì)胞既能均勻的貼附于微載體表面，使細(xì)胞快速生長(zhǎng)，同時(shí)為后續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞預(yù)留充裕的生長(zhǎng)表面積，獲得較高的細(xì)胞密度(22.3×105cells/mL)和細(xì)胞存活率(圖3B)。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)PK-15細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和細(xì)胞存活率比較Fig.1 Comparison of growth curve and viability of PK-15 cells with differentmedia

圖2 不同PK-15細(xì)胞初始密度的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和細(xì)胞存活率比較Fig.2 Comparison of growth curve and viability of PK-15 cells with different initial densities of cells

圖3 不同初始密度的PK-15細(xì)胞培養(yǎng)3 d時(shí)的增殖形態(tài)Fig.3 Morphology of PK-15 cells with different initial densities of cells for 3-d suspension culture

2.3 不同微載體濃度對(duì)PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，在含10%血清高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，PK-15細(xì)胞的接種密度4.0×105個(gè)/mL條件下，隨著微載體濃度提高，細(xì)胞密度也相應(yīng)提高。用相同的細(xì)胞密度接種3、5、7 mg/mL微載體濃度所能達(dá)到的最高細(xì)胞密度分別為22.2× 105、26.1×105、26.4×105個(gè)/mL。其中5和7 mg/ mL微載體中培養(yǎng)效果相似，其細(xì)胞濃度較高，5 mg/ mL微載體濃度經(jīng)濟(jì)較好，各組細(xì)胞存活率均相似。2.4 PK-15細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的基本代謝

圖4 不同微載體濃度的PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)和細(xì)胞存活率比較Fig.4 Comparison of growth curve and viability of PK-15 cells with differentmicrocarrier concentration

圖5 PK-15細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)過(guò)程中葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺及氨的濃度Fig.5 Glucose，lactate，glutamine and ammonia concentrations in microcarrier suspension culture system for PK-15 cells

接種細(xì)胞密度4.0×105cells/mL條件下，微載體濃度提高5 mg/mL以上細(xì)胞培養(yǎng)密度不再提高，推測(cè)為10%血清高糖DMEM培養(yǎng)基無(wú)法支持細(xì)胞高密度生長(zhǎng)。在接種細(xì)胞密度4.0×105個(gè)/mL、微載體濃度5 mg/mL條件下，在1 L反應(yīng)器對(duì)葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸及氨基本代謝進(jìn)行檢測(cè)，如圖5所示。在培養(yǎng)至第1天葡萄糖和谷氨酰胺濃度變?yōu)?4.8和2.4 mmol/L，為原濃度的64%和62%。培養(yǎng)至第2天葡萄糖和谷氨酰胺濃度下降至4.8和1.2 mmol/L，僅為原濃度的21%和35%，乳酸和氨代謝副產(chǎn)物濃度的累積達(dá)到23.7和2.1 mmol/L。第3天葡萄糖為0.6 mmol/L，幾乎消耗完全，谷氨酰胺為0.4 mmol/L，僅為原濃度的11%，乳酸和氨代謝副產(chǎn)物濃度進(jìn)一步提高。細(xì)胞培養(yǎng)至第2天后，培養(yǎng)基已無(wú)法支持細(xì)胞迅速生長(zhǎng)。

2.5 不同補(bǔ)料方式對(duì)PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

根據(jù)微載體懸培養(yǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分及代謝產(chǎn)物濃度的變化，在第2天時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料或?qū)⑵渑囵B(yǎng)基換掉一半的培養(yǎng)方式進(jìn)行比較。如圖6所示，通過(guò)換液或補(bǔ)料均可提高細(xì)胞的密度，均好于普通培養(yǎng)。補(bǔ)料式操作在培養(yǎng)的第2天補(bǔ)加葡萄糖和谷氨酰胺使其濃度分別為12和2 mmol/L，為細(xì)胞增加了充足的營(yíng)養(yǎng)，但代謝產(chǎn)物的積累同樣更高，培養(yǎng)至第3天氨和乳酸的濃度分別為4.6和35.3 mmol/L，高于普通培養(yǎng)測(cè)定的結(jié)果，影響細(xì)胞的增殖，最大細(xì)胞密度30.8×105cells/mL。在第2天進(jìn)行換液操作，停止攪拌發(fā)酵罐，附著細(xì)胞的微載體自動(dòng)沉降后去除一半原培養(yǎng)液，更換為新鮮培養(yǎng)液。去除了一半前2 d積累的代謝副產(chǎn)物，同時(shí)補(bǔ)充了充足的營(yíng)養(yǎng)更有利于細(xì)胞增殖，最大細(xì)胞密度達(dá)到34.7×105個(gè)/mL，顯示最好的生長(zhǎng)性能。

圖6 不同培養(yǎng)方式對(duì)PK-15細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different culture modes on growth curve of PK-15 cells onmicrocarriers

圖7 PK-15細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)微載體上消化轉(zhuǎn)移放大Fig.7 Scale-up of PK-15 cells cultured on Ctytodex 1 by transfer of tripsin digest in bioreator

圖8 PK-15細(xì)胞感染PCV2(MOI=0.01)傳至第3代病毒滴度為107.5TCID50/m LFig.8 Virus titer being107.5TCID50/mL at the 3rdpassage of PK-15 cells infected with PCV2(MOI=0.01)

2.6 PK-15細(xì)胞在微載體上消化轉(zhuǎn)移放大培養(yǎng)

PK-15細(xì)胞在微載體上培養(yǎng)3 d，待細(xì)胞生長(zhǎng)成單層時(shí)，進(jìn)行在位消化轉(zhuǎn)移放大，首先停止攪拌，靜置20 min左右待微載體完全沉降，將培養(yǎng)基排出，37℃溫浴的PBS以約100 mL PBS/g微載體清洗3次，去除殘留的培養(yǎng)基。向微載體內(nèi)加入37℃預(yù)熱的胰酶，攪拌混勻。在5、10、15min取樣0.2mL，加入0.2 mL培養(yǎng)基進(jìn)行中止，當(dāng)胰酶消化10 min后細(xì)胞全部脫落(圖7)。接種細(xì)胞密度4.0×105個(gè)/ mL到下一級(jí)生物反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，補(bǔ)加微載體至5 mg/mL，補(bǔ)加原有培養(yǎng)基體積后進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d換掉培養(yǎng)基一半，3 d后細(xì)胞貼附于微載體上生長(zhǎng)良好(圖7)，細(xì)胞密度為34.3×105個(gè)/mL。采用此方法PK-15細(xì)胞能在微載體上進(jìn)行多次傳代，且細(xì)胞密度為30×105個(gè)/mL以上。

表1 不同感染復(fù)數(shù)(MOI)對(duì)PCV2增殖效價(jià)的影響Table 1 Effects of differentmultiples of infection(MOI)on PCV2 propagation titers

圖9 反應(yīng)器微載體上PK-15細(xì)胞感染PCV2(MOI=0.01)細(xì)胞形態(tài)變化Fig.9 Pathological changes of PK-15cells infected with PCV2(MOI=0.01)

2.7 PCV2不同接毒量對(duì)病毒收獲得影響

過(guò)高或過(guò)低的感染復(fù)數(shù)(MOI=0.5或0.05)均導(dǎo)致較低的PCV2增殖效價(jià)(表1)，說(shuō)明接毒劑量直接影響病毒的增殖效率。MOI=0.1時(shí)可以收獲最高的PCV2增殖效價(jià)，第3代時(shí)達(dá)到最高107.25TCID50/mL(圖8)，第4代時(shí)細(xì)胞無(wú)法貼附于微載體生長(zhǎng)(圖9)。MOI=0.05接毒劑量，PK-15細(xì)胞第3代病毒滴度達(dá)到最高的106.75TCID50/mL，第4代時(shí)細(xì)胞開(kāi)始脫落;MOI=0.5時(shí)病毒滴度在第2代為106.65TCID50/mL，細(xì)胞第3代時(shí)就無(wú)法貼附于微載體生長(zhǎng)。以上各組試驗(yàn)結(jié)果顯示，PCV2接毒劑量為MOI=0.1時(shí)，PK-15細(xì)胞感染后第3代為最佳收毒時(shí)間。

3 討論

本研究比較了MEM和高糖DMEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PK-15細(xì)胞所能達(dá)到最終細(xì)胞密度為18.2×105個(gè)/ mL，是MEM培養(yǎng)基的1.42倍。在反應(yīng)器內(nèi)，高通氧條件下高糖DMEM培養(yǎng)基含有葡萄糖4500 mg/ L，更適合于生長(zhǎng)較快腫瘤細(xì)胞。高糖培養(yǎng)環(huán)境中代謝過(guò)程中所多余的葡萄糖生成乳酸是其他培養(yǎng)液的5倍，因此在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)采用間歇換液的方式，以消除代謝產(chǎn)物給細(xì)胞生長(zhǎng)帶來(lái)的不利影響［13］。本研究在進(jìn)行細(xì)胞代謝檢測(cè)時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)乳酸蓄積量較高，培養(yǎng)第2天以后細(xì)胞增殖明顯降低，在培養(yǎng)第2天時(shí)進(jìn)行換液可以更進(jìn)步提供細(xì)胞密度。

在反應(yīng)器中微載體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞初期，微載體與細(xì)胞的黏附完全是一種物理性碰撞的過(guò)程，符合泊松分布規(guī)則，選擇合適的細(xì)胞初始密度和微載體用量比例可以達(dá)到較好的培養(yǎng)效果［14］。本研究中，PK-15細(xì)胞初始密度4×105個(gè)/mL在5 g/L的Cytodex 1微載體上獲得較為均勻的細(xì)胞分布效果，細(xì)胞黏附充分，細(xì)胞增殖密度和細(xì)胞存活率均獲得最好的水平。計(jì)算其細(xì)胞與微載體的比例為5 mg微載體4×105個(gè)細(xì)胞，根據(jù)說(shuō)明書(shū)1g Cytodex 1粉末在PBS中的溶脹后可形成4.3×106微載體，可近似確定每個(gè)微載體上獲得17個(gè)左右初始細(xì)胞為最佳接種比例。細(xì)胞比例過(guò)高時(shí)，高濃度微載體的表面積未能充分被利用，且培養(yǎng)基無(wú)法支撐更高密度的細(xì)胞生長(zhǎng)。但該比例應(yīng)用于不同動(dòng)物細(xì)胞時(shí)應(yīng)有所改變，可能與不同細(xì)胞在微載體展開(kāi)生長(zhǎng)的速率及生長(zhǎng)形態(tài)大小不同有關(guān)［15］。

PK-15細(xì)胞在微載體上充分黏附、展開(kāi)生長(zhǎng)后，為其提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧及低副產(chǎn)物積累的生長(zhǎng)環(huán)境是獲得高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵。適時(shí)的換液可以提供充足的營(yíng)養(yǎng)并去除代謝副產(chǎn)物的積累，是最佳的培養(yǎng)方式。生物反應(yīng)器的換液操作相對(duì)方便，微載體自然沉降即可有效分離培養(yǎng)上清與培養(yǎng)物，在較短時(shí)間內(nèi)完成換液全過(guò)程。本研究顯示，PK-15生長(zhǎng)速率較快，培養(yǎng)第2天葡萄糖即下降為原濃度的21 %，換液操作操作可顯著改善細(xì)胞第3天的生長(zhǎng)性能，效果優(yōu)于不換液和補(bǔ)料。

PCV2整個(gè)基因組僅有1700多個(gè)堿基，編碼5種蛋白:Cap、Rep、Rep`、ORF3和ORF4蛋白，僅有Rep、Rep`參與基因組的復(fù)制，需要細(xì)胞內(nèi)各種復(fù)制蛋白酶等因素作用下將病毒基因組環(huán)狀單股DNA轉(zhuǎn)換成雙股環(huán)狀DNA，并啟動(dòng)病毒的復(fù)制，病毒的復(fù)制模式為滾環(huán)復(fù)制［6］。普遍觀點(diǎn)是PCV復(fù)制是隨宿主細(xì)胞復(fù)制而復(fù)制，在細(xì)胞生長(zhǎng)的S期復(fù)制效率較高，因此PCV2的復(fù)制周期比其他病毒長(zhǎng)，這為研制高效的PCV2疫苗帶來(lái)了障礙［7］。PCV2效價(jià)最高峰的出現(xiàn)時(shí)間因各毒株的增殖速率的不同而異，疫苗生產(chǎn)采用滾瓶傳代的方式進(jìn)行生長(zhǎng)。根據(jù)PCV2感染及增殖特點(diǎn)，本研究中0.1的感染復(fù)數(shù)最為匹配PCV2感染及增殖過(guò)程的要求，病毒在微載體上傳至第3代可獲得較高滴度。試驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)高或過(guò)低的接毒量均不利于的增殖，過(guò)高時(shí)細(xì)胞在接毒第3代時(shí)就無(wú)法有效貼附于微載體生長(zhǎng)，過(guò)低病毒生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，病毒所獲得的最高滴度也較低。

4 結(jié)論

微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)是目前細(xì)胞培養(yǎng)中日趨成熟的一種技術(shù)，已應(yīng)用于多種疫苗的生產(chǎn)過(guò)程中，如流感疫苗、黃熱病毒疫苗和狂犬病疫苗等［16－18］。國(guó)外疫苗生產(chǎn)企業(yè)的微載體培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)能夠達(dá)到連續(xù)放大至6頓反應(yīng)器，且生產(chǎn)過(guò)程全程在密閉管道中自動(dòng)化控制。國(guó)內(nèi)微載體培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于人用或獸用疫苗的生產(chǎn)才剛剛起步，培養(yǎng)工藝、培養(yǎng)規(guī)模均遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于國(guó)外。本試驗(yàn)對(duì)PK-15細(xì)胞的微載體懸浮消化放大培養(yǎng)、PCV2增殖等工藝進(jìn)行了初步探索，在動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器中PK-15細(xì)胞接毒后能夠連續(xù)3代傳毒。本試驗(yàn)為建立工藝放大至實(shí)驗(yàn)室中試水平，以及在反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行無(wú)毒細(xì)胞擴(kuò)增－接毒－傳代－收毒的工業(yè)放大提供試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

［1］Allan GM，McNeilly F，Kennedy S，etal.Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe［J］.JVet Diagn Invest，1998，10(1):3－10.

［2］Opriessnig T，Meng X J，Halbur PG.Porcine circovirus type 2 associated disease:update on current terminology，clinicalmanifestations，pathogenesis，diagnosis，and intervention strategies［J］.JVet Diagn Invest，2007，19(6):591－615.

［3］Kerkarainen T，Mccullough K，F(xiàn)ort M，et al.Immune responses and vaccine-induced immunity against porcine circovirus type2［J］.Vaccine，2010，136(3－4):185－193.

［4］Beach N M，Meng X J.Efficacy and future prospects of commercially available and experimental vaccinesagainst porcine type2［J］.Virus Res，2012，164(1－2):33－42.

［5］王一平，郭龍軍，唐青海，等.豬圓環(huán)病毒2型疫苗的研究進(jìn)展［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43(9):1337－1345.

［6］Cheung A K.Detection of template strand switching during initiation and termination of DNA replication of porcine circovirus［J］.Journal of Virology，2004，78(8):4268－4277.

［7］Tischer I，Peters D，Rasch，et al.Replication of porcine circovirus: induction by glucosamine and cell cycle dependence［J］.ArchVirol，1987，96:39－57.

［8］Paillet C，F(xiàn)orno G，Kratje R，et al.Suspension-Vero cell cultures as a platform for viral vaccine production［J］.Vaccine，2009，27(46): 6464－6467.

［9］Soons Z I，Vanden IJ，Van Der Pol L A，et al.Scaling-up vaccine production:implementation aspects of a biomass growthobserver and controller［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2009，32(3):289－299.

［10］張?jiān)S科，孫進(jìn)忠，喬榮岑，等.一種豬圓環(huán)并怒II型疫苗制備:中國(guó)，CN101773667A［P］.2013－09－25.

［11］徐宏軍，丁光星，任麗，等.豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)方法:中國(guó)，CN102690790B［P］.2013－09－25.

［12］王貴華，陳義鋒，湯波，等.豬圓環(huán)病毒2型毒株分離鑒定和體外增殖特性研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39(1):17－22.

［13］Ray N G，Karkare S B，Runstadler PW.Cultivation of hybri-doma cell in continuous:kinetics of growth and product formation［J］.Biotechnol Bioeng，1989，33(6):724－730.

［14］Bock A，Sann H，Schulze-Horsel J，et al.Growth behavior of number distributed adherentMDCK cells for optimization inmicrocarrier cultures［J］.Biotechnol Prog，2009，25(6):1717－1731.

［15］Chun B H，Chung S I.Attachment characteristics of normal human cells and virus-infected cells on microcarriers［J］.Cyto-technology，2001，37(1):1－12.

［16］Rourous S，Van Derark A，Majoul S，et al.A novel animal-component-freemedium for rabies virus production in Vero cells grownon Cytodex 1 microcarriers in a stirred bioreactor［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，85(1):53－63.

［17］Bock A，Schulze-Horsel J，Schwarzer J，et al.High-densitymicrocarrier cell cultures for influenza virus production［J］.Biotechnol Prog，2011，27(1):241－250.

［18］Souza M C，F(xiàn)reire M S，Schulze E A，et al.Production ofyellow fever virus in microcarrier-basedVero cell cultures［J］.Vaccine，2009，27 (46):6420－6423.

(責(zé)任編輯 李山云)

Scale-up Process of M icrocarrier Suspension Culture of PK-15 Cells and Propagation of PCV2

HUA Tao1，2，F(xiàn)ENG Lei1，2，ZHANG Xue-hua1，2，TANG Bo1，2，CHANG Chen1，2，LIU Guo-yang1，2，WU Pei-pei1，2，CHEN Li1，2，ZHANG Dao-hua1，2*，HOU Ji-bo1，2*
(1.National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biologicals;Key Laboratory of Engineering and Technology for Veterinary Blologicals，Ministry of Agriculture，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Jiangsu Nanjing 210014，China;2.Jiangsu Coinnovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Jiangsu Yangzhou 225009，China)

In order to develop a technique for scale-up ofmicrocarrier suspension culture of PK-15 cells and propagation of PCV2 in bioreactor，batch-wise suspension culture of PK-15 cells onmicrocarriers(cytodex 1)using scale-up of tripsin digestand propagation of porcine circovirus type 2(PCV2)were investigated.The results showed that the optimal growth efficiency could be achieved by 4.0×105cells per 1 mL inoculation on 5 g/L microcarriers concentration，DMEM medium with high glucose and media replacement after 2-day culture.The highest PCV2 titerwas achieved 107.25TCID50/mL at the3rdpassage of PK-15 cells infected with 0.1multiple of infection(MOI)of PCV2.The optimal processes achieved in this study laid the experimental foundation formass production of PCV2 vaccines in bioreactor scale.

PK-15 cells;Microcarrie;Scale-up of digest;PCV2;Suspension culture

S52.651

A

1001－4829(2017)2－0474－07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.039

2016－04－01

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新項(xiàng)目［CX(14)5044］;農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201303046);江蘇省農(nóng)業(yè)支撐計(jì)劃(BE2012370)

華濤(1981－)，男，江蘇連云港人，博士，從事獸用生物制品工程技術(shù)和疫苗研究，E-mail:huatao541121@163.com，Tel:15951948013，*為通訊作者:張道華，E-mail:zhangdh2005@163.com，侯繼波，E-mail:houjibo@jaas.ac.cn。