吳 斌

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站/福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002)

“新吉富”羅非魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備及其在免疫效果評價上的應(yīng)用

吳 斌

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站/福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002)

制備了“新吉富”羅非魚血清免疫球蛋白IgM單克隆抗體(McAb)并進行了特性分析，以血清IgM McAb為基礎(chǔ)，建立了IgM捕獲ELISA檢測方法.采用親和層析法純化健康“新吉富”羅非魚IgM，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測，重鏈、輕鏈的相對分子質(zhì)量分別為75～78、23～25 ku；以純化的IgM為抗原制備IgM McAb，制備McAb雜交瘤細胞株系3株，分別命名為2H5、2D4、2B11，抗體亞型均為IgM，小鼠腹水效價分別為1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-5，對IgM敏感度測定表明，2H5、2D4、2B11檢測靈敏度分別為31.25、125.00、62.50 ng.以抗羅非魚IgM McAb包被酶標板，建立IgM捕獲ELISA檢測方法.以無乳鏈球菌滅活疫苗免疫羅非魚，受免血清按建立的IgM捕獲ELISA方法檢測特異性抗體，結(jié)果表明，建立的IgM捕獲ELISA檢測方法可應(yīng)用于免疫應(yīng)答抗體水平分析.

“新吉富”羅非魚; 免疫球蛋白IgM; 單克隆抗體; ELISA檢測方法

羅非魚作為我國主要的淡水魚養(yǎng)殖品種之一，2006年以來，鏈球菌病給羅非魚產(chǎn)業(yè)帶來嚴重危機，免疫防治將成為控制該疾病的主要方向.在魚類的體液免疫應(yīng)答過程中，免疫球蛋白是重要的免疫效應(yīng)分子.目前從硬骨魚類中已經(jīng)分離到的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ、IgT、IgG等[1].IgM是一類存在于所有有頜類脊椎動物中的抗體[2]，其單體由兩條輕鏈(L鏈)、兩條重鏈(H鏈)組成，通過連接鏈將5個單體連接成一個五聚體，相對分子質(zhì)量為700～850 ku.

為了研究羅非魚的免疫機制，吳鐵軍等[3]克隆獲得了羅非魚IgM重鏈的cDNA，其序列全長1 885 bp，有一個長1 770 bp的完整閱讀框，編碼588個氨基酸，相對分子質(zhì)量為41 453.94 u，為羅非魚IgM重鏈基因功能的鑒定工作提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù).黃婷等[4]采用rProtein A Sepharose親和層析一步法純化羅非魚IgM，并制備其兔抗血清，結(jié)果表明，血清IgM重鏈、輕鏈的相對分子質(zhì)量分別為88.0、21.0 ku，由血清IgM制備的兔多抗效價為1∶32 000.由于羅非魚IgM兔多抗成分復(fù)雜，IgM多克隆抗體應(yīng)用于免疫血清特異性抗體檢測存在靈敏度不足、特異性差的問題.因此，制備特異性強的羅非魚免疫球蛋白IgM單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)顯得尤為重要.目前，尚未見以羅非魚免疫球蛋白IgM McAb為制劑，建立IgM捕獲ELISA檢測方法的報道.本試驗通過制備羅非魚IgM McAb，建立血清特異性IgM抗體捕獲ELISA檢測方法，為羅非魚疫苗免疫效果評價、免疫應(yīng)答水平監(jiān)測以及IgM的結(jié)構(gòu)與功能分析、免疫應(yīng)答模式研究等建立物質(zhì)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 “新吉富”羅非魚由福建省淡水水產(chǎn)研究所榕橋中試基地提供；Balb/c雌性小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司.

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 RPMI-1640培養(yǎng)液、HAT培養(yǎng)液、8-氮雜鳥嘌呤、HRP標記的羊抗兔IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG抗體、Ig亞類鑒定試劑盒購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司；Hitrap IgM Purification抗體純化試劑盒購自Pierce公司；TMB顯色液、牛血清白蛋白購自Sigma公司；PEG(MW4000)購自Merck公司；BHI、LB等細菌培養(yǎng)基購自北京陸橋公司.

1.1.3 菌株、抗體與細胞株 無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)070717LL、SIP-pET32a重組原核表達工程菌及SIP重組表達蛋白、SIP抗兔多克隆抗體、羅非魚IgM兔多克隆抗體均由福建省淡水水產(chǎn)研究所水產(chǎn)動物病害防治研究室制備與保存；骨髓瘤細胞SP2/0由第四軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室提供.

1.2 羅非魚IgM的分離與純化

1.2.1 血清的制備 羅非魚心臟采血，血清置冰箱(4 ℃)過夜，于5 000 r·min-1離心10 min，取上清備用.

1.2.2 IgM的分離純化 血清經(jīng)20% PEG6000沉淀后，用HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR凝膠過濾層析，收集第一個峰的組分，用Hitrap IgM Purification精細純化，SDS-PAGE電泳分析純化樣品.

1.3 羅非魚IgM免疫小鼠

取8周齡的Balb/c雌性小鼠5只，將純化的羅非魚IgM與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，以0.2 mL·只-1腹腔注射免疫小鼠[5]，一免后于第14、28、35天分別用羅非魚IgM與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后加強免疫,4免后尾部采血，應(yīng)用間接ELISA檢測方法檢測鼠血清效價.

1.4 羅非魚IgM雜交瘤細胞株的建立與McAb的制備

當免疫Balb/c小鼠血清的效價達到1.0×10-5后，按照文獻[5]的方法，應(yīng)用McAb制備技術(shù)，取脾細胞與SP2/0細胞融合，采用間接ELISA檢測方法篩選陽性細胞孔，有限稀釋法進行單細胞克隆，建立、保存McAb雜交瘤細胞株，并制備McAb細胞株小鼠腹水.

1.5 羅非魚IgM McAb小鼠腹水效價的測定

McAb小鼠腹水的效價采用間接ELISA檢測方法測定.酶標板包被羅非魚IgM(20 μg·mL-1)；5% BSA封閉；加入以10倍梯度稀釋的IgM McAb小鼠腹水，分別設(shè)置陽性對照(受免的Balb/c小鼠多抗血清)、陰性對照(未免疫的Balb/c小鼠血清)，于37 ℃溫育1 h；加HRP標記的羊抗鼠二抗，于37 ℃溫育1 h；加TMB顯色液，室溫避光顯色10～20 min；加終止液，靜置10 min；將空白對照調(diào)零，用酶標儀檢測450、630 nm雙波長的光密度(D)；若待測孔的D大于或等于陰性對照孔的2.1倍時為陽性.

1.6 羅非魚IgM McAb細胞株亞類的鑒定

羅非魚IgM McAb細胞株Ig亞類鑒定按Ig亞類鑒定試劑盒步驟進行.

1.7 羅非魚IgM McAb靈敏度的測定

將羅非魚IgM兔多克隆抗體包被酶標板，IgM按一定倍數(shù)梯度稀釋，以1 000 ng至1 ng的系列質(zhì)量作抗原，IgM McAb(15 μg·mL-1)作抗體，采用雙抗夾心ELISA檢測方法測定McAb對IgM的靈敏度.

1.8 受免羅非魚血清特異性IgM抗體捕獲ELISA檢測方法的建立

用抗原SIP蛋白免疫羅非魚，收集血清用于建立特異性IgM抗體捕獲ELISA檢測方法.具體步驟如下：將羅非魚IgM McAb 2H5純化，以20 μg·mL-1的含量包被酶標板；用5%牛血清白蛋白封閉；加入待測的受免羅非魚血清(按一定倍數(shù)梯度稀釋)100 μL,同時設(shè)置陰性對照(按一定倍數(shù)梯度稀釋的正常羅非魚血清)、空白對照(PBS液)，于37 ℃溫育；洗滌后加入SIP蛋白(10 μg·mL-1)，于37 ℃溫育；洗滌后加入抗SIP蛋白的兔多克隆抗體(按1∶100稀釋)，于37 ℃溫育；洗滌后加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗；最后用TMB顯色；終止反應(yīng)后用酶標儀測定450、630 nm雙波長的D；測定待測樣品的D(P)、同倍稀釋的陰性對照樣品的D(N)，當P/N≥2.1時判為陽性.

1.9 IgM捕獲ELISA檢測方法應(yīng)用于抗體效價的檢測

1.9.1 無乳鏈球菌滅活疫苗的制備 無乳鏈球菌菌株070717LL在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期時收集菌體，調(diào)整菌液濃度至1×108CFU·mL-1，用0.5%甲醛滅活24 h，于5 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)3次，用超聲波破碎菌體，備用.

1.9.2 無乳鏈球菌滅活疫苗免疫羅非魚 取質(zhì)量約80 g的健康“新吉富”羅非魚，暫養(yǎng)1周后，分為3組，每組50只.第1組為陰性對照組，腹腔注射0.5 mL生理鹽水；第2組腹腔注射全菌滅活疫苗，免疫0.5 mL·只-1(菌濃度1.0×108CFU·mL-1)，一免后第21天用全菌滅活疫苗浸泡加強免疫(浸泡菌濃度1.0×107CFU·mL-1)；第3組腹腔注射全菌滅活疫苗，免疫0.5 mL·只-1(菌濃度1.0×108CFU·mL-1).

1.9.3 受免羅非魚血清特異性抗體效價的檢測 一免后，于第7、14、21、28、35、42天各組均隨機取5尾“新吉富”羅非魚，分離血清，按“1.8”建立的IgM捕獲ELISA檢測方法進行檢測，分析羅非魚血清中特異性抗體的效價.

2 結(jié)果與分析

1:蛋白Marker;2:20% PEG6000;3:HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR洗脫液;4:Hitrap IgM Purification洗脫液.

表1 3株羅非魚McAb的亞型及其效價

2.1 羅非魚血清IgM的分離純化

羅非魚血清用20% PEG6000沉淀去除了大量雜蛋白，凝膠過濾層析得到進一步純化，親和層析得到較純的IgM，經(jīng)SDS-PAGE檢測，可見75～78、23～25 ku的條帶(圖1).

2.2 羅非魚IgM McAb雜交瘤細胞株系的建立

在羅非魚IgM McAb雜交瘤細胞株系的建立過程中共進行5次細胞融合，融合率均達55.8%以上.檢測到陽性雜交瘤細胞孔后，對細胞孔中的細胞進行3次以上的單克隆化，獲得3株能穩(wěn)定分泌McAb的陽性細胞株，分別命名為2H5、2D4、2B11.

2.3 羅非魚IgM McAb的特性

3株羅非魚McAb的效價測定、Ig亞類鑒定結(jié)果(表1)顯示，3株McAb效價均較高.

2.4 羅非魚IgM McAb的敏感度

根據(jù)雙抗夾心ELISA方法，應(yīng)用3株羅非魚IgM McAb檢測IgM，結(jié)果(表2)顯示，2H5、2D4、2B11檢測IgM的靈敏度分別為31.25、125.00、62.50 ng.

2.5 無乳鏈球菌滅活疫苗免疫的羅非魚血清特異性抗體效價

應(yīng)用羅非魚IgM捕獲ELISA檢測方法分別檢測3組羅非魚血清的特異性抗體效價，結(jié)果(圖2)顯示：第1組(陰性對照組)血清的效價均小于1∶50；第2組血清首免后第7天的效價為1∶200，第21、28天的效價最高(1∶800)，第42天的效價為1∶200；第3組血清首免后第7天的效價為1∶200，第21天的效價最高(1∶800)，從第28天到第42天，血清效價從1∶400降低到1∶100.

表2 應(yīng)用3株羅非魚IgM McAb ELISA檢測IgM的靈敏度1)

1)+表示陽性；-表示陰性.

圖2 全菌滅活疫苗免疫的羅非魚血清特異性抗體效價

3 討論

當前，針對水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類已建立了斑點叉尾鮰、草魚、歐洲鰻、牙鲆、銀鯽、大黃魚、黃鰭棘鯛、黃鱔、鱸血、美洲黑石斑魚、烏鱧IgM的分離與純化方法[4,6-16]，通過蛋白電泳、蛋白質(zhì)印跡、液相色譜分析等方法明確了這些魚種IgM重鏈的相對分子質(zhì)量為52～79 ku，輕鏈的相對分子質(zhì)量為25～29 ku.本試驗采用PEG6000沉淀粗提、凝膠過濾層析、親和層析等步驟獲得較高純度的“新吉富”羅非魚IgM，重鏈的相對分子質(zhì)量為75～78 ku，輕鏈的相對分子質(zhì)量為23～25 ku.張小萍等[17]研究表明，尼羅羅非魚IgM重鏈、輕鏈的相對分子質(zhì)量分別為77、27 ku，與本試驗的結(jié)果基本相符.

目前，羅非魚和斑點叉尾鮰[4]，以及草魚、大黃魚、黃鰭棘鯛、黃鱔、鱸血、美洲黑石斑魚、烏鱧IgM的多克隆抗體已經(jīng)制備[7,11-16]，并應(yīng)用于魚類IgM的結(jié)構(gòu)分析.但由于魚類Ig分子中的糖基具有強免疫原性，能刺激受免疫動物產(chǎn)生大量抗糖基抗體，導(dǎo)致多克隆抗體產(chǎn)生非特異反應(yīng)；另外制備高度純化的免疫原技術(shù)難度大，殘留的雜質(zhì)也將影響二抗的特異性[8].而魚類IgM McAb具有抗原決定簇單一、對抗原純度要求不高、抗原與抗體結(jié)合力強、可體外大量制備的優(yōu)點.因此，制備魚類IgM McAb并應(yīng)用于魚類免疫細胞的鑒定、抗體結(jié)構(gòu)分析、血清流行病學(xué)調(diào)查、免疫應(yīng)答水平監(jiān)測、免疫效果評價等方面，為魚類免疫學(xué)、血清學(xué)研究提供了重要工具.目前，草魚[6]、歐洲鰻[8]、牙鲆[9]、銀鯽[10]、尼羅羅非魚[17]、紫紅笛鯛[18]、奧尼羅非魚[19]等魚體的IgM McAb已被制備，并廣泛應(yīng)用于魚類免疫學(xué)研究.本試驗制備出“新吉富”羅非魚IgM McAb，并初步應(yīng)用于羅非魚免疫血清的特異性抗體檢測與疫苗免疫效果分析，在后期的工作中，有必要應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡、B細胞定位等方法，明確所制備的McAb針對的羅非魚IgM抗原決定簇和表位結(jié)構(gòu)，以進一步應(yīng)用于羅非魚IgM結(jié)構(gòu)和功能的分析，以及羅非魚病原診斷、免疫機理研究.

應(yīng)用本試驗制備的羅非魚IgM McAb檢測IgM的靈敏度，可以用IgM直接包被酶標板的間接ELISA方法檢測，也可以用IgM多克隆抗體捕獲IgM，再進行間接ELISA檢測.本試驗使用的方法可以避免在IgM直接包被的過程中，抗原包被不完全而造成檢測數(shù)據(jù)誤差的狀況；同時在羅非魚血清樣品的特異性抗體檢測中，由于待測血清未經(jīng)過純化，成分中除了IgM，還有其他復(fù)雜的細胞因子成分，使用捕獲ELISA檢測方法可有效地排除血清中的非特異性成分對檢測過程的干擾.

為了尋找合適的免疫途徑，本試驗應(yīng)用捕獲ELISA檢測方法對用不同方式免疫的受免疫羅非魚的抗體水平進行了評估.結(jié)果表明，采用注射、浸泡2種免疫方式的羅非魚在浸泡加強免疫后，血清特異性抗體的效價不僅在高水平上維持的時間長，且第28～42天的特異性抗體表達水平均比單獨采用注射免疫的高，能讓受免羅非魚魚體保持更持久的抗體水平，有利于延長疫苗免疫的保護期并提高保護率.

致謝：感謝福建省淡水水產(chǎn)研究所張新艷高級工程師、鄭磊工程師在本研究中給予的幫助和支持.

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(責任編輯:施曉棠)

Preparation of McAbs against immunoglobulinin fromOreochromisniloticusand its application in immune effect analysis

WU Bin

(Fujian Provincial Fishery Technical Extention Center/Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To prepare effective monoclonal antibody (McAb) against serum immunoglobulin (Ig) of tilapia, antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was conducted, and Ig of healthyOreochromisniloticuswas purified by protein A affinity chromatography to characterize its immunological feature. Then purified IgM was used as antigen to immunize Balb/c mice. SDS-PAGE analysis showed that molecular weight of tilapia Ig heavy chain and light chain was 75-78 and 23-25 ku, respectively. Three hybridomas strains secreting monoclonal antibodies (McAb) were obtained and named 2H5, 2D4, and 2B11, with the common isotype being IgM. And titers in the ascites of Balb/c mice were 1.0×10-5, 1.0×10-4, 1.0×10-5, respectively. Sensitivities of McAb against tilapia IgM was high, with detection limits being 31.25, 125.00, and 62.50 ng, respectively. Furthermore, MAC-ELISA showed that specific antibody was detected within tilapia immuned byStreptococcusagalaciateinactivated vaccine.

Oreochromisniloticus; immunoglobulin; monoclonal antibody; ELISA

2016-06-22

2017-01-16

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-49)；福建省公益類科研院所專項(2014R1002-3)；福建省海洋與漁業(yè)廳重點項目(閩海漁合同[2010]2-12號).

吳斌(1978-)，男，高級工程師，碩士.研究方向：水產(chǎn)動物病害分子免疫學(xué).Email：wubinfire@126.com.

S948

A

1671-5470(2017)02-0187-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.02.011