成 偉, 程光遠, 彭 磊, 徐 倩, 董 萌, WAQAR Ahmad, 許莉萍, 徐景升

(福建農林大學/農業(yè)部福建甘蔗生物學與遺傳改良重點實驗室，福建 福州 350002)

甘蔗脅迫誘導表達基因ScCBF1的功能分析

成 偉, 程光遠, 彭 磊, 徐 倩, 董 萌, WAQAR Ahmad, 許莉萍, 徐景升

(福建農林大學/農業(yè)部福建甘蔗生物學與遺傳改良重點實驗室，福建 福州 350002)

以甘蔗苗為材料研究了甘蔗CBF1轉錄激活因子ScCBF1在水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)以及重金屬鎘(CdCl2)和銅(CuCl2)脅迫下的表達情況；將ScCBF1的原核表達載體pGEX-6P-1-ScCBF1轉化大腸桿菌(Escherichiacoli) Rosetta (DE3)，檢測其在NaCl、PEG8000脅迫下的生長情況.結果表明:ScCBF1在MeJA、SA、CdCl2以及CuCl2逆境脅迫下表達下調；在500 mmol·L-1NaCl脅迫下，含有重組質粒的細胞生長速度顯著減緩，不同濃度NaCl脅迫下的平板脅迫結果進一步說明了ScCBF1基因不具耐鹽性；在15% PEG8000脅迫下，含有重組質粒細胞的生長速度明顯高于對照，不同濃度PEG8000脅迫下的平板脅迫結果說明了ScCBF1基因在應答干旱脅迫中具有抗逆性.構建了ScCBF1的植物表達載體pCAMBIA1301-ScCBF1并通過農桿菌侵染在本氏煙葉片中瞬時表達，在4 ℃低溫脅迫下，T0代煙草植株長勢顯著優(yōu)于對照.

甘蔗; 轉錄因子; 熒光定量PCR; 脅迫; 瞬時表達

低溫、干旱及高鹽等非生物逆境是影響植物生長發(fā)育的主要限制因素，植物受到逆境脅迫時會產生一系列適應性調節(jié)反應以應對外界不良環(huán)境，高等植物在長期進化過程中對這些逆境形成了許多復雜的防御應答機制[1].植物應答非生物逆境脅迫的逆境脅迫調控網絡非常復雜，相對下游單一功能基因，轉錄調控因子在應答逆境脅迫過程中往往發(fā)揮了更為重要的作用[2].通過表達轉錄因子基因調控下游脅迫相關基因的表達，可以提高植物的抗逆性[3-5].研究植物對非生物逆境的應答機制，提高植物的抗逆性，對于作物抗逆育種具有重要意義.

轉錄調控因子在植物生長發(fā)育、信號轉導和功能基因的表達調控中起重要作用.CBF (C-repeat/dehydration-responsive element binding factor)是一類植物中特有的轉錄因子[6]，能特異性識別并與順式元件DRE/CRT (dehydration responsive element/C-repeat)相結合，調控下游一系列干旱、高鹽和低溫等逆境應答基因的表達，降低或消除逆境脅迫帶給植物的危害[7].研究表明，CBF在植物響應逆境脅迫調控網絡中發(fā)揮著重要作用，該基因與非生物逆境脅迫(干旱、低溫、高鹽、ABA等)的信號傳導密切相關.目前已經從擬南芥(Arabidopsisthaliana)[8]、小麥(Triticumaestivum)[9]、大豆(Glycinemax)[10]、棉花(Gossypiumhirsutum)[11]、辣椒(Capsicumannuum)[12]、玉米(Zeamays)[13]和甘蔗(Saccharumofficinarum)[14]等植物中分離和鑒定出CBF基因，研究表明CBF基因受高鹽、低溫、干旱、ABA等非生物脅迫誘導.

甘蔗(Saccharumspp.)是世界上最主要的糖料作物和能源作物，也是重要的輕工業(yè)原料.我國甘蔗生產立地條件差，低溫、干旱是限制我國甘蔗生產的主要因素.因此，挖掘甘蔗抗逆基因，解析甘蔗抗逆的分子機制，對甘蔗抗逆育種具有重要意義[15].本課題組克隆了甘蔗的CBF1基因ScCBF1 (GenBank Acc. No. KT898944)，構建了原核表達載體pGEX-6P-1-ScCBF1，在大腸桿菌中IPTG誘導GST-ScCBF1融合蛋白質的表達，并發(fā)現低溫、干旱、脫落酸(ABA)脅迫可以誘導該基因的表達，高鹽抑制其表達[14](已發(fā)表).本研究在此基礎上，進一步分析了ScCBF1在不同逆境脅迫下的表達特性，并通過煙草瞬時表達驗證了該基因對低溫的抗性.

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗品種FN40和本氏煙(Nicotianabenthamiana)由本實驗室提供.以甘蔗栽培品種FN40的組培苗為試驗材料，促根后移至穴盤中水培，每天換水1次.待組培苗長到5片完全展開葉時，選取長勢一致的幼苗在平底試管中進行外源脅迫處理.以本氏煙為受體材料進行瞬時表達試驗.本氏煙種植于培養(yǎng)室內(溫度21 ℃，光照14 h/黑暗8 h)，選取6～8周的生育期且長勢一致的煙草植株進行瞬時表達試驗.大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株用于生長曲線測定和平板脅迫試驗；農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105菌株和植物過表達載體pCAMBIA-1301由本實驗室提供.PrimeScript RT-PCR Kit反轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix Kit (Roche)，購買自TaKaRa公司(中國，大連).限制性內切酶和T4連接酶購買自Thermo Fisher Scientific公司.

1.2 脅迫處理

對甘蔗幼苗進行激素和重金屬脅迫處理，在50 mL平底試管中進行.激素處理包括水楊酸(5 mmol·L-1SA水溶液)和茉莉酸甲酯(100 μmol·L-1MeJA水溶液)，將甘蔗幼苗置于分別含有上述激素溶液的平底試管中，于0、3、12和24 h取葉片.重金屬脅迫采用含有氯化鎘(50 μmol·L-1CdCl2)和氯化銅(100 μmol·L-1CuCl2)的1/10 Hongland營養(yǎng)液脅迫處理，將甘蔗幼苗置于分別含有上述重金屬溶液的平底試管中，于0、12、24和48 h取葉片[16].實驗設置3個生物學重復，每個重復3株，取樣后樣品用液氮速凍，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.3 總RNA提取及其cDNA第一鏈合成

采用TRIzol法提取甘蔗幼苗葉片總RNA.使用Nanodrop (Thermo Scientific, USA)測定RNA的濃度，按照反轉錄試劑盒Prime Script RT-PCR Kit使用說明書，將mRNA反轉錄成cDNA，作為后續(xù)實時熒光定量PCR的模板.

1.4 定量PCR檢測ScCBF1在不同外源脅迫下的表達

根據克隆獲得的ScCBF1基因的ORF序列，利用Primer Primer 5.0軟件，設計特異性實時熒光定量PCR引物，以GAPDH基因作為內參基因[17-19](表1).按照 SYBR Green PCR Master Mix Kit (Roche)說明書確定定量反應體系.在7500型實時熒光定量PCR儀(ABI, USA)上完成定量PCR擴增.每個樣品設置3次技術重復.擴增程序為50 ℃ 2 min；40個循環(huán)擴增(95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min).增加熔解曲線.反應結束后，采用2-ΔΔCt算法分析獲得的數據[20].

表1 ScCBF1基因定量表達和瞬時表達所用引物1)

1)下劃部分序列表示酶切位點.

1.5 攜帶ScCBF1基因的大腸桿菌細胞在不同非生物脅迫下的研究

1.5.1 生長曲線測定 進一步研究了脅迫因子NaCl、PEG對攜帶重組質粒(pGEX-6P-1-ScCBF1)和空載(pGEX-6P-1)的大腸桿菌Rosetta (DE3)細胞生長的影響.將活化后的菌液稀釋至D600 nm=0.6，吸取2 mL的菌液加到100 mL的LB液體培養(yǎng)液中(分別含500 mmol·L-1NaCl，50 μg·mL-1Amp+；15% PEG8000，50 μg·mL-1Amp+)，設置3個重復，置于37 ℃，200 r·min-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 h取1次樣，直至取到24 h，并測定菌液D600 nm值，繪制生長曲線圖.

1.5.2 斑點試驗 斑點試驗是將重組質粒(pGEX-6P-1-ScCBF1)和空載(pGEX-6P-1)轉化到大腸桿菌Rosetta (DE3)細胞中，當其在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600 nm=0.6時，將其稀釋×10-3、×10-4倍，取10 μL在含有不同濃度的NaCl和PEG8000脅迫因子的LB固體培養(yǎng)基上(含50 μg·mL-1Amp+)點樣[21-23].

1.6 ScCBF1基因表達載體的構建及農桿菌介導的煙草瞬時表達

1.6.1 pCAMBIA1301-ScCBF1重組載體的構建 以pMD19-T-ScCBF1克隆載體為模板，利用帶有SalⅠ和SpeⅠ內切酶的特異性酶切位點的引物進行PCR擴增，引物序列見表1.反應體系為25 μL，含ExTaq0.125 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上下引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 17.375 μL.反應條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min.利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的片段，然后利用限制性內切酶SalⅠ和SpeⅠ酶切回收產物和植物表達載體pCAMBIA1301，回收的酶切產物利用T4連接酶，16 ℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經過藍白斑篩選以及利用SalⅠ和SpeⅠ內切酶雙酶切鑒定以及質粒PCR鑒定，并委托上海生物工程技術有限公司測序，最終將測序成功的重組載體命名為pCAMBIA1301-ScCBF1.

1.6.2 農桿菌介導法侵染本氏煙瞬時表達 采用液氮凍融法，將pCAMBIA1301-ScCBF1轉化到根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105感受態(tài)細胞中，將活化菌液涂在LB固體培養(yǎng)基(含有50 mg·mL-1Kan，35 mg·mL-1Rif)上，28 ℃培養(yǎng)過夜.挑取EHA105單菌落于20 mL LB液體培養(yǎng)基中， 28 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)過夜，使其D600 nm≈0.8；活化菌液在常溫下4 000×g離心10 min后收集菌體，棄上清液，加入1 mL MS (pH 7.0)液體培養(yǎng)基重懸菌體；重復重懸，洗去培養(yǎng)基中多余的抗生素，用MS液體培養(yǎng)基(pH 7.0)(含200 μmol·L-1乙酰丁香酮)重懸菌體，使其D600 nm≈0.8；選擇長勢基本一致的本氏煙植株，光照處理1 h后，從煙草葉片背面注射(每株煙草注射3片葉片)，對照組為空載pCAMBIA-1300和未注射的煙草；注射完畢后，28 ℃下光照16 h/黑暗8 h培養(yǎng).2 d后，將其放置4 ℃培養(yǎng)柜里，光照16 h/黑暗8 h，觀察煙草表型.

2 結果與分析

2.1 ScCBF1基因在不同外源脅迫下的表達

以GAPDH為內參基因，采用熒光定量PCR方法對ScCBF1在不同外源脅迫下的表達水平進行檢測.結果顯示，外源SA、MeJA脅迫處理在3個時間點(3、12和24 h)抑制了甘蔗ScCBF1基因的表達，呈顯著下調表達趨勢，表現為SA在處理3 h的表達量達到最低，約為對照的0.7倍；MeJA在處理12和24 h的表達量達到最低，約為對照的0.3倍(圖1-A).表明ScCBF1在逆境脅迫應答過程中，不通過MeJA和JA途徑來介導.在CdCl2、CuCl2脅迫處理的3個時間點(12、24和48 h)，ScCBF1基因下調表達， CuCl2處理48 h的表達量達到最低，約為對照的0.3倍；CdCl2處理12 h的表達量達到最低，約為對照的0.2倍(圖1-B).表明ScCBF1不具有抗重金屬脅迫的能力，揭示在甘蔗的生長發(fā)育過程中，該基因在應答調控重金屬脅迫過程中沒有發(fā)揮作用.

A:不同外源激素脅迫下的基因表達量;B:不同重金屬脅迫下的基因表達量.

2.2 生長曲線測定分析

根據取樣后測定的菌液D600 nm值，繪制重組質粒pGEX-6P-1-ScCBF1與空載pGEX-6P-1在含有500 mmol·L-1NaCl和15% PEG8000的LB液體培養(yǎng)基中(含50 μg·mL-1Amp+)的生長曲線.結果顯示(圖2-A)，重組質粒的細胞生長速度在14～18 h生長最快，而空載的細胞生長速度在8～14 h最快.但隨著脅迫時間的增長，重組質粒細胞生長D600 nm值要低于空載細胞生長.這個試驗結果說明相對于空載，在含有NaCl脅迫介質中，抑制了重組質粒的細胞生長，進而說明ScCBF1基因在NaCl脅迫下，不具有耐鹽性.此外，結果表明(圖2-B)，重組質粒的細胞生長和空載的細胞生長速度都在6～8 h達到最快.但隨著脅迫時間的增長，重組質粒細胞生長D600 nm值要高于空載細胞生長.這個實驗結果說明相對于空載，在含有PEG8000脅迫介質中，重組質粒細胞能夠對PEG脅迫有一定的抗逆性，進而揭示ScCBF1基因具有一定程度的抗旱性.

A:含有不同濃度NaCl的LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線；B:含有不同濃度PEG8000的LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線.

2.3 斑點試驗分析

ScCBF1融合表達細胞(Rosetta+pGEX-6P-1-ScCBF1)和對照表達細胞(Rosetta+pGEX-6P-1)在含有250、500 mmol·L-1NaCl和15% PEG8000、30% PEG8000脅迫因子的LB固體培養(yǎng)基中(含50 μg·mL-1Amp+)點樣，37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察LB平板上斑點的生長狀態(tài).結果表明，在不同濃度的NaCl脅迫下，重組載體的斑點生長狀態(tài)劣于對照，說明ScCBF1對NaCl脅迫沒有抗逆性(圖3).另外，與對照相比，重組蛋白在不同濃度的PEG8000逆境下，斑點生長狀態(tài)優(yōu)于對照，表明ScCBF1對PEG脅迫因子有一定的抗逆性(圖4).

A:空載對照(CK-pGEX-6P-1);B:融合載體對照(CK-pGEX-6P-1-ScCBF1);C:空載在250 mmol·L-1 NaCl脅迫下的表達(pGEX-6P-1);D:融合表達細胞在250 mmol·L-1 NaCl脅迫下的表達(pGEX-6P-1-ScCBF1);E:空載在500 mmol·L-1 NaCl脅迫下的表達(pGEX-6P-1);F:融合表達細胞在500 mmol·L-1 NaCl脅迫下的表達(pGEX-6P-1-ScCBF1).

A:空載對照(CK-pGEX-6P-1);B:融合載體對照(CK-pGEX-6P-1-ScCBF1);C:空載在15% PEG8000脅迫下的表達(pGEX-6P-1);D:融合表達細胞在15% PEG8000脅迫下的表達(pGEX-6P-1-ScCBF1);E:空載在30% PEG8000脅迫下的表達(pGEX-6P-1);F:融合表達細胞在30% PEG8000脅迫下的表達(pGEX-6P-1-ScCBF1).

2.4 ScCBF1基因瞬時表達分析

M1：15 000+2 000 bp marker；M2：100 bp marker；1-2:重組質粒雙酶切；3-4：質粒PCR.

2.4.1ScCBF1表達載體的構建與鑒定 對構建的重組質粒用SalⅠ和SpeⅠ內切酶進行雙酶切鑒定和質粒PCR驗證，電泳檢測后發(fā)現，酶切產物呈現清晰的兩條條帶，分別在600 bp(目的基因片段)和約11 000 bp(載體片段)；質粒PCR結果顯示只有1條目的基因條帶(600 bp).此外，重組質粒測序結果正確，表明植物表達載體構建成功(圖5).

2.4.2 瞬時表達ScCBF1誘發(fā)本氏煙的防御反應 利用農桿菌介導的瞬時表達方法鑒定ScCBF1在T0代本氏煙葉片中的表達情況[24](圖6).將注射過pCAMBIA-1301-ScCBF1侵染液的本氏煙放置于4 ℃恒溫培養(yǎng)柜中觀察其表型，脅迫8 h后，觀察到注射pCAMBIA-1301-ScCBF1侵染液的本氏煙的葉片相比較對照組，幾乎沒有萎蔫；但隨著本氏煙在逆境脅迫下的時間逐漸增加，在脅迫5 d后，注射pCAMBIA-1301-ScCBF1侵染液后的本氏煙和對照組萎蔫程度有所不同，但瞬時表達ScCBF1基因的煙草在長勢上明顯優(yōu)于對照組；在脅迫15 d后，相對對照，注射pCAMBIA-1301-ScCBF1侵染液后的本氏煙頂部葉片還是較挺拔.直至葉片全部萎蔫，植株死亡.

從左至右依次是：pCAMBIA-1301-ScCBF1；pCAMBIA-1301；未注射正常植株; A：低溫脅迫時間8 h；B：低溫脅迫時間5 d；C：低溫脅迫時間15 d.

3 討論

低溫、干旱和高鹽等逆境是甘蔗生產的重要限制因素，可以造成甘蔗產量與蔗糖糖分的嚴重損失.近年來，細胞工程和基因工程技術開始應用于甘蔗品種的定向遺傳改良，但目前仍處于研究初期階段[25].文獻表明，CBF類基因功能存在物種特異性，可以響應某種或多種脅迫[8,9,13,14].與甘蔗直系同源的玉米、高粱、水稻等作物中均已克隆到多個CBFs基因，并做了一系列的功能驗證工作，這為探究該基因的功能提供了依據[13,26,27].

在逆境脅迫信號調控網絡中，轉錄調控因子作為分子開關通過與順式作用元件結合來調控脅迫相關基因的表達.在長期的進化過程中，植物會激發(fā)不同的防御機制來應答生物脅迫和非生物脅迫，在不同的脅迫條件下植物自身的生存能力依賴于對外界刺激的識別、產生和信號傳導以及對逆境作出響應的下游抗逆功能基因的表達調控，并提高植物體內脯氨酸、甜菜堿和蔗糖等小分子有機質含量，進而維持植物細胞結構的完整性和細胞的穩(wěn)定性，最終提高植物的抗逆性和適應逆境的能力[2,28,29].

前期的研究發(fā)現ScCBF1基因在轉錄水平上受干旱和低溫非生物逆境脅迫和植物激素ABA誘導，而在NaCl脅迫下下調表達[14].本研究對ScCBF1在重金屬脅迫和外源激素脅迫下的表達特性以及對攜帶ScCBF1基因的大腸桿菌細胞在不同非生物脅迫下的表達進行進一步探討，結果表明，ScCBF1基因在MeJA、SA脅迫下下調表達.由此推測，甘蔗ScCBF1基因是通過依賴ABA逆境脅迫信號轉導途徑來參與脅迫應答過程，以確保信號分子迅速高效的傳遞.另外，ScCBF1基因在CdCl2和CuCl2脅迫下亦下調表達，推測該基因在應答調控重金屬脅迫過程中沒有發(fā)揮作用，但ScCBF1的分子機理和調控機制還有待進一步研究.生長曲線結果表明，ScCBF1不具有耐鹽性，但對干旱脅迫有一定的抗逆性.進一步將重組質粒pGEX-6P-1-ScCBF1和空載pGEX-6P-1轉化到大腸桿菌細胞中進行NaCl和PEG8000平板脅迫，顯示在NaCl脅迫逆境下，沒有表現出抗逆性，而在PEG8000逆境下，ScCBF1對PEG8000逆境有一定的抗逆性.先前的報道表明，在大腸桿菌細胞中過表達植物脅迫誘導基因會使突變細胞系在逆境下生長得更好[18,21,23,30].Gupta et al[21]研究了鹽生植物鹽角草DREB轉錄因子，結果表明該基因過表達在大腸桿菌中會對高鹽、干旱和甘露醇有一定程度上的抗逆性；Guo et al[18]研究表明，甘蔗ScDir在大腸桿菌過表達對高鹽和干旱顯示不一樣的抗逆性；Chaurasia et al[30]研究揭示魚腥藻植物絡合素合酶基因pcs在大腸桿菌過表達系統中，對高溫、高鹽、呋喃丹、鎘、銅和紫外線等逆境脅迫有一定的抗逆作用；Su et al[23]研究表明，甘蔗過氧化氫酶基因ScCAT1過表達在大腸桿菌系統中，對高鹽、CdCl2和CuCl2等逆境脅迫顯示不一樣的抗逆性.本研究結果與之前研究的甘蔗ScCBF1在不同非生物逆境脅迫下的表達特性是一致的[14].將構建成功植物過表達載體pCAMBIA-1301-ScCBF1，通過農桿菌介導法注射侵染煙草，在低溫逆境下觀察其表型.結果表明，在模式植物煙草中，低溫逆境條件下，瞬時表達ScCBF1基因使轉基因煙草表現出良好的抗性，為利用該基因進行遺傳轉化培育抗寒甘蔗品種或材料提供了生物學證據.本研究結果進一步揭示了ScCBF1在甘蔗生長發(fā)育中逆境脅迫應答中作用，為利用基因工程技術進在甘蔗抗逆育種提供了分子靶點.

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(責任編輯:吳顯達)

Functional analysis ofScCBF1 in the response to stress in sugarcane

CHENG Wei, CHENG Guangyuan, PENG Lei, XU Qian, DONG Meng, WAQAR Ahmad, XU Liping, XU Jingsheng

(Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To investigate the functions ofScCBF1 in alleviating salicylic acid (SA), methyl jasmonate (MeJA), heavy metal cadmium (Cd) and copper (Cu) stress, prokaryotic expression vector pGEX-6P-1-ScCBF1 was transformed into Rosetta (DE3) strain (Escherichiacoli) in sugarcane seedlings, then the growth rate of transformed cell lines was investigated under NaCl and PEG8000 stress. The results showed thatScCBF1 was significantly down-regulated under the treatments of SA, MeJA, CdCl2or CuCl2, respectively. With 500 mmol·L-1NaCl, growth rates of cells containing the recombinant plasmid significantly slowed down. Further spot assay under different concentrations of NaCl confirmed thatScCBF1 was susceptible to NaCl. The growth of Rosetta/pGEX-6P-1-ScCBF1 cells was faster in LB liquid medium containing 15% PEG8000 compared to that of the control. Spot assay also revealed thatScCBF1 was resistant to drought stress. Moreover, the over expression vector of pCAMBIA-1301-ScCBF1 was constructed successfully and then was transformed into the leaves ofNicotianabenthamianabyAgrobacterium-mediated method. Transient expression ofScCBF1 in the tobacco plants confirmed that T0generation plants with expressedScCBF1 was more resistant to cold than the control under 4 ℃.

sugarcane; transcription factor; quantitative real-time PCR; stress; transient expression

2016-07-10

2016-09-29

國家高技術研究發(fā)展計劃863計劃(2013AA102604)；國家自然科學基金(31371688,31571732)；國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系(CARS-20-1-1).

成偉(1989-)，男，博士研究生.研究方向：植物分子生物學，作物高優(yōu)工程與技術.Email:qpchengwei@163.com.通訊作者徐景升(1973-)，男，副研究員.研究方向：植物分子生物學，病毒致病分子基礎.Email:xujingsheng@126.com.

Q812

A

1671-5470(2017)02-0172-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.02.009