彭江濤, 候新坡, 蘭 濤, 毛大梅, 陳志偉, 潘潤(rùn)森, 官華忠

(福建農(nóng)林大學(xué)福建省作物設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350028)

水稻苗期耐鹽性基因SST分子標(biāo)記的篩選與應(yīng)用

彭江濤, 候新坡, 蘭 濤, 毛大梅, 陳志偉, 潘潤(rùn)森, 官華忠

(福建農(nóng)林大學(xué)福建省作物設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350028)

以水稻耐鹽突變體sst為對(duì)照，對(duì)67個(gè)水稻親本及突變體sst與水稻品種華占的F2群體進(jìn)行耐鹽性篩選，并結(jié)合分子標(biāo)記結(jié)果，分析水稻苗期耐鹽性基因SST分子標(biāo)記ID27093、ID27101、ID27118、INDEL1和INDEL2的特異性和準(zhǔn)確性.結(jié)果表明，分子標(biāo)記ID27093、ID27101、ID27118和INDEL1的擴(kuò)增多態(tài)性較低；而分子標(biāo)記INDEL2的擴(kuò)增多態(tài)性較高，為共顯性標(biāo)記，具有較高的特異性，能區(qū)分耐鹽供體sst與85.07%的供試親本，且篩選準(zhǔn)確率高.因此，分子標(biāo)記INDEL2標(biāo)記可以直接用于耐鹽性基因SST分子標(biāo)記輔助育種.

水稻; 耐鹽性基因SST; 分子標(biāo)記; 篩選

水稻(OryzasativaL.)是一種鹽堿中度敏感作物，土壤的鹽堿化制約著水稻產(chǎn)量的提高[1].目前，我國(guó)鹽堿化稻田面積約占水稻栽培總面積的1/5，且因工業(yè)污染、化肥過(guò)量使用及灌溉不合理等因素導(dǎo)致土壤鹽堿化日益嚴(yán)重，嚴(yán)重影響到水稻生產(chǎn)安全[2-4].為此，培育耐鹽堿的水稻品種對(duì)保障我國(guó)鹽堿地區(qū)的水稻產(chǎn)量有著至關(guān)重要的作用.

眾所周知，傳統(tǒng)耐鹽育種技術(shù)存在育種周期長(zhǎng)、選擇受環(huán)境影響大的缺點(diǎn).而分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)具有選擇效率高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、受環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于水稻主要性狀的改良，成為一種常用的育種手段[5].官華忠等[6]成功利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)選擇培育出了優(yōu)質(zhì)抗稻瘟病三系不育系金抗1A.桑茂鵬等[7]通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇聚合廣譜高抗白葉枯病基因Xa21和香味基因fgr，獲得雙基因純合且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的優(yōu)質(zhì)香型水稻三系不育系株系.

大量的耐鹽種質(zhì)資源的挖掘及相關(guān)基因的定位克隆為耐鹽性狀的分子育種奠定了基礎(chǔ).目前，通過(guò)原有種質(zhì)資源的鑒定和誘變已篩選出許多具有耐鹽性的種質(zhì)資源[8].如來(lái)自斯里蘭卡地方品種Pokkali，含有4個(gè)耐鹽QTLs，表現(xiàn)出強(qiáng)耐鹽性[9].利用系統(tǒng)選育方法培育的耐鹽堿品種遼鹽2號(hào)，已獲大面積推廣[10].顧紅艷等[11]對(duì)津原101的組培后代進(jìn)行耐鹽篩選，獲得了早熟耐鹽新品種津原85.并已檢測(cè)到70多個(gè)水稻苗期耐鹽的主效基因或QTL[12]，其中4個(gè)主效基因(DST[13]、OsIPK2[14]、RSS3[15]和SST[16])和1個(gè)QTL[17]已被克隆.本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)了具有苗期高度耐鹽的水稻突變體sst，并克隆了控制該耐鹽性狀基因SST.該基因位于水稻第6號(hào)染色體，是SBP-box基因，因其功能缺失(ORF的第232個(gè)堿基缺失，造成移碼突變)，從而產(chǎn)生耐鹽性[16,18].因此，進(jìn)一步設(shè)計(jì)了與水稻苗期耐鹽性基因SST緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過(guò)各品種耐鹽性評(píng)價(jià)、多態(tài)性引物篩選并利用F2分離群體中的耐鹽單株對(duì)多態(tài)性引物進(jìn)行驗(yàn)證，研究這些標(biāo)記的特異性和準(zhǔn)確性，為建立耐鹽性分子標(biāo)記輔助育種體系提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

以從水稻恢復(fù)系R401輻射誘變發(fā)現(xiàn)的耐鹽突變體sst為耐鹽對(duì)照，粳稻品種日本晴為不耐鹽對(duì)照，對(duì)66個(gè)供試水稻親本進(jìn)行耐鹽性鑒定和分子標(biāo)記檢測(cè)(表1).

表1 引物序列

將耐鹽突變體sst與水稻恢復(fù)系華占雜交，構(gòu)建F2分離群體，用于驗(yàn)證分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性.

1.2 方法

用于耐鹽鑒定的供試親本經(jīng)浸種催芽，播種于塑料托盤(pán)中，在12 h光照，27 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng).從播種第3 d開(kāi)始，每天澆150 mmol·L-1的NaCl溶液200 mL，進(jìn)行鹽脅迫，直至不耐鹽品種全部死亡.從鹽脅迫第15 d開(kāi)始統(tǒng)計(jì)死亡率，每隔4 d統(tǒng)計(jì)1次.

1.3 分子標(biāo)記分析

1.3.1 標(biāo)記開(kāi)發(fā) 采用3對(duì)引物(ID27093、ID27101和ID27118)為分子標(biāo)記[16].并依據(jù)其定位結(jié)果，比對(duì)日本晴和9311的SST基因附近的序列，尋找InDel位點(diǎn).利用Primer 3.0設(shè)計(jì)引物，開(kāi)發(fā)出分子標(biāo)記引物INDEL1和INDEL2(表1).

1.3.2 DNA的提取 所有親本各取10株葉片混合，利用SDS大量法提取DNA；F2群體取單株葉片，用SDS小量法提取DNA.具體方法參考段遠(yuǎn)霖等[19].

1.3.3 PCR擴(kuò)增和電泳分析 用PCR和聚丙烯酰胺凝膠方法檢測(cè)該標(biāo)記在親本間的多態(tài)性.PCR反應(yīng)體系為15 μL，含2.0 μL 10×Buffer(20 mmol·L-1)，0.2 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，1.5 μL引物(5 mmol·L-1)，0.1 μLTaq酶(5 U·μL-1)，2.0 μL模板DNA(20 ng·μL-1)，8.7 μL ddH2O.PCR反應(yīng)程序94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃(INDEL2為60 ℃)30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，硝酸銀脫色，然后拍照并記錄結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 親本耐鹽性鑒定

將耐鹽對(duì)照突變體sst、不耐鹽對(duì)照日本晴和66個(gè)親本置于150 mmol·L-1NaCl溶液中處理，第15、20、25 d調(diào)查這些親本對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)情況.結(jié)果表明，第15 d， 33個(gè)親本和日本晴表現(xiàn)一致，均100%死亡，其余33個(gè)親本則出現(xiàn)不同程度的鹽傷害(死亡率為71.80%～94.70%)；第20 d，剩余的33個(gè)親本鹽傷害加重，其中10個(gè)親本全部死亡；第25 d，耐鹽親本仍表現(xiàn)正常，其它供試親本均已死亡(表2).說(shuō)明，耐鹽親本sst表現(xiàn)出強(qiáng)的耐鹽性，而其余供試品種均不耐鹽.

2.2 苗期耐鹽基因SST的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

2.2.1 多態(tài)性標(biāo)記的篩選 利用5對(duì)分子標(biāo)記引物(INDEL1、INDEL2、ID27093、ID27101和ID27118)檢測(cè)水稻突變體sst、日本晴、華占、廣占63-4s、Loment和天豐B的多態(tài)性.如圖1所示，INDEL1和ID27093在親本間的條帶不清晰，特異性不高；標(biāo)記ID27118僅日本晴和突變體sst具有多態(tài)性；標(biāo)記ID27101能區(qū)分突變體sst、日本晴和Loment；INDEL2表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，并且能區(qū)分突變體sst與其它5個(gè)親本(圖1).因此，選擇標(biāo)記ID27101和INDEL2對(duì)所有供試親本進(jìn)行多態(tài)性分析.

表2 68個(gè)親本耐鹽表現(xiàn)情況

2.2.2 分子標(biāo)記ID27101和INDEL2在親本間的多態(tài)性 利用分子標(biāo)記ID27101和INDEL2分別對(duì)耐鹽供體sst和67個(gè)親本進(jìn)行PCR檢測(cè).結(jié)果表明，標(biāo)記ID27101可擴(kuò)增出3種帶型，多態(tài)性較低，有9個(gè)親本(日本晴、佳輻占、GD-7s、Loment、Dular、沈2B、沈3B、沈4B和秀水13)的帶型與耐鹽供體sst不一致(圖2A,B)，僅能把13.43%的供試親本與耐鹽供體sst區(qū)分開(kāi).標(biāo)記INDEL2可擴(kuò)增出2種帶型，除了10個(gè)親本(Y58s、M20B、金泰B、吉田B、瀘香618B、粵豐B、R402、早恢89、龍恢158和宜香B)的帶型與耐鹽供體sst一致，其他57個(gè)親本的帶型與耐鹽供體sst均不一致，能把85.07%的供試親本與耐鹽供體sst區(qū)分開(kāi)(圖2C,D).

上述分析表明，ID27101對(duì)耐鹽基因sst的區(qū)分能力較弱，無(wú)法區(qū)分雜交稻主干親本與耐鹽供體，予以淘汰.而INDEL2具有較高的多態(tài)性，能區(qū)分多數(shù)親本與耐鹽供體，推薦應(yīng)用于耐鹽基因sst的分子標(biāo)記輔助選擇.

1-6依次是：突變體sst、日本晴、華占、廣占63-4s、天豐B和Loment.

A，B為ID27101的擴(kuò)增產(chǎn)物；C，D為INDEL2的擴(kuò)增產(chǎn)物；1-68依次為表2中親本順序.

2.2.3 分子標(biāo)記INDEL2的準(zhǔn)確性驗(yàn)證 建立耐鹽突變體sst和恢復(fù)系華占的F2群體，播種后利用150 mmol·L-1NaCl溶液篩選獲得耐鹽單株327株.將這些單株移植于海南三亞，抽穗時(shí)，選擇分蘗力強(qiáng)、株高適中、穗粒數(shù)較多的優(yōu)良單株73株用于PCR檢測(cè).結(jié)果表明，分子標(biāo)記 INDEL2為共顯性標(biāo)記，恢復(fù)系華占和耐鹽突變體sst的帶型具有明顯差異，而雜種F1帶型則為雜合帶型(同時(shí)具有雙親的帶型)；所檢測(cè)73個(gè)單株的帶型均與耐鹽突變體sst一致，與恢復(fù)系華占有明顯區(qū)別(圖3).為進(jìn)一步驗(yàn)證標(biāo)記選擇的準(zhǔn)確性，對(duì)這73個(gè)單株的自交種子(即F3株系)進(jìn)行耐鹽性鑒定，結(jié)果表明所有株系均表現(xiàn)出耐鹽性.這說(shuō)明分子標(biāo)記 INDEL2為共顯性標(biāo)記，且對(duì)耐鹽基因sst的選擇率達(dá)到100%，能夠應(yīng)用于該基因的分子標(biāo)記輔助選擇.

10為華占，11為耐鹽供體sst，12為華占/sst雜交F1，1-9，13-20為華占/sst雜交F2單株.

3 討論

水稻耐鹽性分子標(biāo)記輔助育種的研究將會(huì)有很大發(fā)展空間.利用該技術(shù)可以加快耐鹽品種的培育，以滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)耐鹽堿品種的需求.水稻耐鹽能力鑒定的方法目前主要有發(fā)芽指標(biāo)法、形態(tài)傷害評(píng)價(jià)法和生長(zhǎng)量比較法等[20].其中，形態(tài)傷害評(píng)價(jià)法易于操作，故較常被采用.本研究采用的耐鹽突變體sst苗期能在150 mmol·L-1NaCl溶液中正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)出強(qiáng)的耐鹽性；而其他67個(gè)供試親本均全部死亡.相較于前人的篩選方法，本方法更簡(jiǎn)單直接，能滿(mǎn)足育種需求.如汪斌等[18]對(duì)耐鹽突變體sst在播種后14 d進(jìn)行2次鹽脅迫處理，大約需31 d，在育種實(shí)踐中會(huì)產(chǎn)生秧齡過(guò)長(zhǎng)的缺點(diǎn).而本研究在播種后第3 d即進(jìn)行鹽脅迫，處理25 d后不耐鹽品種全部死亡，故能在適宜的秧齡期(<30 d)篩選到耐鹽單株.另外，該耐鹽種質(zhì)來(lái)源于早熟恢復(fù)系R401，具有較好的農(nóng)藝性狀.因此，該種質(zhì)可以作為珍貴的耐鹽供體在育種中進(jìn)一步利用.

水稻耐鹽性的鑒定受品種的生育階段和環(huán)境影響大[21-22].謝留杰等[23]研究表明，不同品系間耐鹽性表現(xiàn)各異，不同時(shí)期品系的耐鹽性差異明顯.郭望模等[24]進(jìn)一步證實(shí)同一水稻品種在種子萌發(fā)期相對(duì)耐鹽，而幼苗期對(duì)鹽較敏感.陳志德等[25]對(duì)108個(gè)水稻品種連續(xù)2年的耐鹽鑒定表明，同一品種苗期耐鹽性在不同年份間差異較大，說(shuō)明水稻資源耐鹽性鑒定易受環(huán)境影響.為方便苗期耐鹽性基因SST的育種應(yīng)用，利用定位群體的分子標(biāo)記(ID27093、ID27101和ID27118)和本實(shí)驗(yàn)新開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記INDEL1與INDEL2對(duì)突變體sst和供試親本進(jìn)行多態(tài)性篩選.結(jié)果表明定位群體的分子標(biāo)記在育種親本中的擴(kuò)增多態(tài)性低，無(wú)法滿(mǎn)足分子標(biāo)記輔助育種的要求.而INDEL2為共顯性標(biāo)記，且具有較好的多態(tài)性，還能將耐鹽供體與85.07%的供試親本區(qū)分開(kāi)來(lái).同時(shí)，分子標(biāo)記INDEL2對(duì)sst/華占的F2群體耐鹽單株的選擇準(zhǔn)確率極高，達(dá)100%.因此，分子標(biāo)記INDEL2可以應(yīng)用于耐鹽基因sst的分子標(biāo)記輔助育種，特別在該基因分子標(biāo)記輔助回交育種中，INDEL2能快速鑒定目標(biāo)單株，進(jìn)而加快育種進(jìn)程.

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(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

Screening and application of molecular marker for salt tolerance geneSSTat rice seedling stage

PENG Jiangtao, HOU Xinpo, LAN Tao, MAO Damei, CHEN Zhiwei, PAN Runsen, GUAN Huazhong

(Fujian Provincial Key Laboratory of Crop Breeding by Design; Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350028, China)

Molecular markers, INDEL1 and INDEL2, which are linked to salt tolerance geneSSTof rice seedling, were designed. The specificity and reliability of 5 markers, including ID27093, ID27101, ID27118, INDEL1, and INDEL2, were analyzed through screening 67 rice varieties and a F2population from a cross between mutantsstand a rice restorer line Huazhan for salt tolerance, and mutantsstwas used as a salt tolerance control. The results showed that all markers except INDEL2 demonstrated low polymorphism. INDEL2 turned out to be a co-dominant marker with high specificity, and it was able to distinguish from 85.07% of the tested parents and mutantsstwith high screening accuracy. Therefore, marker INDEL2 could be directly used as a molecular marker in breeding for rice seedling salt tolerance geneSST.

OryzasativaL.; salt tolerance geneSST; molecular maker; screening

2016-05-19

2016-07-15

福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2013NZ0002-2)；福建省自然科學(xué)基金(2012J01091)；福建省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(JA12095).

彭江濤(1991-)，女，碩士研究生.研究方向：水稻遺傳育種.Email:1210294180@qq.com.通訊作者官華忠(1977-)，男，副教授.研究方向：水稻遺傳育種.Email:bangzhu8@126.com.

S511

A

1671-5470(2017)02-0166-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.02.008