高桂鳳，霍 勤，于加平，徐亞維，王俊玲，劉 波

（1吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林132101；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林132101）

阿特拉津降解菌株的篩選、分離及純化探究

高桂鳳1，霍 勤2，于加平1，徐亞維1，王俊玲1，劉 波1

（1吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林132101；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林132101）

本試驗以長期使用阿特拉津除草劑的土壤為材料，通過設(shè)計特定的培養(yǎng)基來馴化長期使用阿特拉津的土壤微生物，并用涂布平板法分離純化得到一株菌株，初步判斷為阿特拉津降解菌；該菌株通過革蘭氏染色，基因組DNA凝膠電泳、PCR分析得知：該菌為桿狀，革蘭氏染色為陽性，基因組長度為19000bp，16SrDNA長度為1700bp的菌株。

阿特拉津降解菌；篩選；特性分析

目前，在世界上銷售的除草劑中，以三氮苯類、酰胺類、脲類、二硝基苯胺類等出售量最大，其中三氮苯類中以玉米用的阿特拉津使用量最多。阿特拉津（atrazine）的化學(xué)名稱為2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-三嗪。它自從作為除草劑投入到商業(yè)化生產(chǎn)以來，因其生產(chǎn)成本低且除草效果好，而得到世界各國的普遍認(rèn)可和使用，已成為世界上除草劑行業(yè)中銷售量最大的重要除草劑。由于阿特拉津在世界范圍內(nèi)的廣泛使用，由此而導(dǎo)致的環(huán)境污染問題已不容忽視。據(jù)資料報道，世界上具有多年阿特拉津使用歷史的國家的地表水和地下水均受到了不同程度的污染。如加拿大[1]、德國[2-3]等國檢測者對其飲用水、河流或?qū)Φ叵滤驅(qū)ν寥肋M(jìn)行阿特拉津的殘留及其衍生物的檢測，發(fā)現(xiàn)其殘留量均超出規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。我國的長江、黃河、遼河均檢測到阿特拉津，北京官廳水庫[4]、黃埔江源水[5]中等多地阿特拉津的含量均很高。阿特拉津的生理生態(tài)毒理學(xué)研究表明，阿特拉津可能對人體具有致癌性，長期接觸阿特拉津會導(dǎo)致乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生[6-7]。另外，研究表明阿特拉津?qū)τ谏钤谒械膭又参锒竞π砸矘O大[8-9]。

綜上所述，關(guān)于環(huán)境中阿特拉津污染的治理引起各國普遍的關(guān)注，目前，對于污染的治理有許多種。其中，最為引人關(guān)注的是生物治理。本實驗是從長期使用阿特拉津除草劑的土壤中通過訓(xùn)化、篩選、分離到一株能降解阿特拉津的菌株，并對其進(jìn)行純化，為下一步更加深入研究提供菌株資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要材料和試劑 長期施用阿特拉津除草劑的玉米地土壤（采集于吉林省東豐縣），阿特拉津（浙江中山化工集團(tuán)有限公司），NaCl，K2HPO4，KH2PO4，MgSO4·7H2O，瓊脂，結(jié)晶紫，碘液，石炭酸，復(fù)紅，酒精等。

1.1.2 試驗儀器 AL204-1C電子分析天平，MLS-3750高壓滅菌器（日本三洋公司生產(chǎn)），SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化有限公司生產(chǎn)），XZQX100A恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)），WD800B微波爐（格蘭仕公司生產(chǎn)），海爾電冰箱（廣州海爾公司生產(chǎn)），光學(xué)顯微鏡，可見光分光光度計，培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機(jī)，移液器，水平電泳槽，紫外/熒光觀測儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 土樣的加工 土樣采自于長期使用阿特拉津除草劑的玉米地土壤，將采集到的土壤剔除沙粒、雜草，將塊狀土樣碾細(xì)陰干后備用。

1.2.2 液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基的制備 將0.4% 的NaCl，1.79%的K2HPO4，0.45%的KH2PO4，0.2% 的MgSO4，配制成pH7.0基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，通過高壓蒸汽滅菌后使用；同時，取一定量上述液體培養(yǎng)基加入適量瓊脂經(jīng)滅菌后倒入平板，在倒平板之前，根據(jù)實驗要求加入適量阿特拉津藥品備用。

1.2.3 阿特拉津降解菌株的馴化、篩選 在超凈工作臺內(nèi)，首先取一定量的土樣加入到上述配好的液體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基內(nèi)混合均勻后在30℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。然后每隔7d從培養(yǎng)液中取一定量添加到新鮮的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，同時新鮮培養(yǎng)基中阿特拉津的含量比前一次每100mL培養(yǎng)基中多10mg，直到每100mL培養(yǎng)基中阿特拉津的含量達(dá)到100mg為止，如此循環(huán)進(jìn)行一段時間馴化后得到馴化菌種。

1.2.4 降解菌株的分離與純化 將上述菌懸液結(jié)合吸光度值進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后，選擇合適稀釋度，用涂布平板法在30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，直到菌落長出；然后，將其中的單個菌落重新轉(zhuǎn)接到新鮮并且含有一定量阿特拉津的固體培養(yǎng)基上，就獲得了純培養(yǎng)物。

1.2.5 分離菌株基因組的提取及其基因組長度的推測 細(xì)菌基因組提取步驟：材料準(zhǔn)備→破碎細(xì)胞或胞膜—內(nèi)容物釋放→核酸分離、純化→沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)→核酸溶解在適量緩沖液或水中，用瓊脂糖凝膠電泳成像觀察結(jié)果，并推測基因組長度。

1.2.6 用PCR法對分離菌株16SrDNA長度進(jìn)行估測 進(jìn)行PCR試驗時，按添加的程序準(zhǔn)備原料。首先通過查閱資料設(shè)計了分離菌株特異性的引物。引物的堿基順序：A1、A2和A3的上游引物都是5’-cag agt ttg atc ctg gct cag-3’，下游引物分別是5’-cta cgg cta cct tgt tac g-3’，5’-agg agg tga tcc agc cgc a-3’，5’-ggt tac ctt gtt acg act t-3’；用1.2.4方法獲得的基因組進(jìn)行PCR。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后用凝膠成像觀察進(jìn)行估測。

1.2.7 DNA序列的測定 將1.2.6獲得PCR產(chǎn)物用回收試劑盒進(jìn)行回收，然后將回收產(chǎn)物送到上海生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果分析

為了能分離到阿特拉津降解菌，本試驗設(shè)計一種特殊的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中碳源和氮源都是阿特拉津，因此，只有能降解阿特拉津的菌才能生長。初步判斷分離到的菌株為阿特拉津降解菌，然后，選擇一個單菌落在一個新鮮的固體培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行劃線培養(yǎng)，如此重復(fù)幾次，就獲得了純培養(yǎng)物。

2.1 菌落特征觀察見圖1。

圖1 固體培養(yǎng)基上阿特拉津降解菌的菌落

由圖1可知，該菌株在含有阿特拉津的基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基表面菌落小，為圓形，表面光滑、濕潤、粘稠、菌落為乳白色。在含有甘露醇和少量酵母膏的瓊脂培養(yǎng)基表面，菌落稍大而厚。

2.2 降解菌的形態(tài)觀察

用革蘭氏染色法對分離到的菌株進(jìn)行染色，經(jīng)過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌株的形態(tài)呈桿狀，革蘭氏染色為陽性菌。

2.3 分離菌株基因組的提取及其基因組長度的推測

為了進(jìn)一步研究該菌株，從分離菌中提取到了基因組，并通過凝膠電泳成像進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2，與marker比較，分離菌株基因組長度在19000bp左右。

圖2 分離菌株基因組凝膠電泳成像圖

2.4 用PCR法對分離菌株16SrDNA長度的分析

為了研究該菌株的16SrDNA，設(shè)計了三對引物用PCR去處理，然后，用凝膠電泳成像去分析。結(jié)果見圖3，與marker比較，這三對引物的PCR產(chǎn)物A1、A2、A3差異不大，長度大約在1700bp左右。

圖3 PCR產(chǎn)物凝膠電泳成像圖

2.5 序列鑒定結(jié)果

為了進(jìn)一步研究該菌株的16SrDNA的序列，對該菌株進(jìn)行了DNA序列的測定，測定結(jié)果見圖4。序列分析發(fā)現(xiàn)它與根瘤菌和農(nóng)桿菌的相似度最高，達(dá)98%。

圖4 降解菌株16SrDNA的序列

3 結(jié)論

本實驗分離得到的菌株能在碳源和氮源只有阿特拉津存在的培養(yǎng)基中生長，初步判斷分離到的菌株為阿特拉津降解菌。該菌株的基因組長度為19000bp左右、16SrDNA長度為1700bp左右，與根瘤菌和農(nóng)桿菌的相似度高達(dá)98%的，桿狀的、革蘭氏陽性菌。

[1]maguire R J.Occurrence of pesticides in the Yamaska River Quebec Arch[J].Environ Contam Toxicol，1993，25（2）：220-226.

[2]Mandelbaum R T，L P Weckelt and D L.Rapid hydrolysis of Atrazine to hydroxyatrazine by soil bacteria[J].Environ Sci＆Technol，1993（27）：1 943-1 946.

[3]Khan S U.Supercritical fluid extraction of bound pesticide residues from soiland food commodities[J].JournalAgriculture Food Chemistry，1995（43）：1 718-1 721.

[4]任 晉，蔣 可，周懷東，等.官廳水庫中阿特拉津殘留的分析及污染來源[J].環(huán)境科學(xué)，2002，23（1）：126-128.

[5]馬曉雁，高乃云，李青松，等.固相萃取-高效液相色譜檢測原水中微量內(nèi)分泌干擾物[J].給水排水，2006，32（1）：6-10.

[6]Susanne Wust.A sensitive enzyme immunoassay for the detection of Atrazine based upon sheep，anbtibodies analytical letters[J]. Toronto：Academic Press Inc.1992（5）：1 317-1 408.

[7]Thomas B，Moorman.National soil tilth laboratory[M].USDAAgriciultural Reseach sevrvice，Ames.，Iowa，1999.

[8]Pimentel D.Effects of Pesticides on Non-target Species[M]. Washington，U.S.Gov.Print，1971.

[9]El-sheekh，M.M.，H.M.Kotkat and O.H.F.Hammouda. Atrazine herbicide on growth，photosynthesis，protein synthesis，and fatty acid composition in the uniceller green algae Chlorella kessleri [J].Ectoxicol.Environ.Safty，1994（29）：319-358.

責(zé)任編輯：建德鋒

Study on the Screening,Isolation and Purification of Atrazine Degrading Acteria

GAO Guifeng1，HUO Qin2，YU Jiaping1，XU Yawei1，WANG Junling1，LIU Bo1
（1.Jilin Agricultural Science and Technology University School of Bioengineering,Jilin 132101;2.Jilin Agricultural Science and Technology University School of Animal Science and Technology，Jilin 132101）

This experiment is to long-term use of herbicide atrazine in the soil for the material.With the specific design of medium to tame the long-term use of atrazine in the soil microorganiss,and separated by spread plate method to a strain,preliminaries judge for atrazine degrading bacteria.Analysised by gram staining,genomic DNA gel electrophoresis and PCR that the bacteria is rods,gram positive strain.The genome length is about 19000bp,the16SrDNA length is about 1700bp.

atrazine degrading microbe;screening;characteristic analysis

Q93

A

2016-11-11

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目（吉教科合字[2014]第391號）

高桂鳳（1971-），女，吉林省吉林市人，講師，研究方向：微生物。