王 霞，王馮娟，謝曉丹

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 132101）

“紅顏”草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)研究

王 霞，王馮娟，謝曉丹

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 132101）

以“紅顏”草莓嫩葉為外植體，研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、pH、蔗糖濃度和光照強(qiáng)度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，“紅顏”草莓葉片愈傷組織很容易褐化，經(jīng)20%維生素C（Vc）溶液浸泡20 min可顯著降低褐化率，提高出愈率，愈傷組織誘導(dǎo)的最適植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，培養(yǎng)基最佳pH 6.0，蔗糖濃度3.0%，光照強(qiáng)度2 000Lx，此時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)旺盛、呈淡黃色、質(zhì)地疏松，出愈率為95.0%。

“紅顏”草莓；葉片；愈傷組織；誘導(dǎo)

“紅顏”草莓（Benihoppe Strawberry）又稱(chēng)日本99、紅頰，是日本靜岡縣用章姬與幸香雜交培育成的早熟草莓新品種，其生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，果實(shí)大，顏色鮮艷，香味濃郁，甜度高，硬度大，耐儲(chǔ)運(yùn)，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，現(xiàn)已成為我國(guó)主要的日系草莓栽培品種[1]。

目前，草莓主要采用匍匐莖分株法進(jìn)行繁殖，該法繁殖周期長(zhǎng)，極易因感染病毒而使品種退化[2]。利用組培技術(shù)繁育草莓苗周期短、繁殖系數(shù)高、成本低，同時(shí)不受季節(jié)、氣候等外界因素的影響，具有實(shí)現(xiàn)工廠(chǎng)化生產(chǎn)的巨大潛力。愈傷組織的成功誘導(dǎo)是組培快繁技術(shù)的關(guān)鍵步驟，目前報(bào)道的“紅顏”草莓葉片愈傷組織的誘導(dǎo)均是用噻重氮苯基脲（TDZ）作為細(xì)胞分裂素[3]，但TDZ價(jià)格昂貴，并不利于工業(yè)化生產(chǎn)。試驗(yàn)首次采用性?xún)r(jià)比較高的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA，研究其不同水平的組合以及pH、蔗糖濃度、光照強(qiáng)度對(duì)草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響，為“紅顏”草莓的快速繁殖和品種推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及預(yù)處理

“紅顏”草莓，采自于吉林省吉林市孤店子鎮(zhèn)大荒地村神農(nóng)莊園。

取未展開(kāi)草莓幼葉先后用75%酒精和0.1%升汞按照常規(guī)滅菌方法進(jìn)行處理，并切成約0.5 cm×0.5 cm小塊，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同6-BA和NAA濃度組合的篩選 將葉片接種于含有不同6-BA和NAA濃度組合的MS培養(yǎng)基中（見(jiàn)表1），每瓶接種1個(gè)外植體，50d后統(tǒng)計(jì)出愈率；為防止褐化，將葉片用20%Vc溶液浸泡20 min，然后按照上述方法重新接種。培養(yǎng)基蔗糖濃度30 g/L，瓊脂濃度7 g/L，pH 5.8，培養(yǎng)條件：溫度25℃，光照周期16 h/d，光照強(qiáng)度2 500

Lx，設(shè)置重復(fù)30次。

1.2.2 pH的篩選 葉片用20%Vc溶液浸泡20 min，接種于含有最佳6-BA和NAA濃度組合的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH設(shè)5.4、5.6、5.8、6.0和6.2 5個(gè)梯度，蔗糖與瓊脂濃度、培養(yǎng)條件、重復(fù)次數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間同1.2.1，篩選最佳培養(yǎng)基pH。

1.2.3 蔗糖濃度的篩選 葉片用20%Vc溶液浸泡20 min，接種于MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基蔗糖濃度設(shè)1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%5個(gè)梯度，6-BA和NAA濃度組合、pH分別為上述篩選的最佳值，其余操作、瓊脂濃度、培養(yǎng)條件、重復(fù)次數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間同1.2.1，篩選最佳培養(yǎng)基蔗糖濃度。

1.2.4 光照強(qiáng)度的篩選 葉片用20%Vc溶液浸泡20 min，接種于MS培養(yǎng)基中，6-BA和NAA濃度組合、pH、蔗糖濃度分別為上述篩選的最佳值，光照強(qiáng)度設(shè)1 000、1 500、2 000、2 500、3 000Lx 6個(gè)梯度，其余操作、瓊脂濃度、培養(yǎng)溫度、光照周期、重復(fù)次數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間同1.2.1，篩選最佳光照強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

出愈率（%）=誘導(dǎo)愈傷組織的葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100.0%；

褐化率（%）=褐化的外植體數(shù)/接種的葉片數(shù)×100.0%[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同6-BA和NAA濃度組合對(duì)草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

“紅顏”草莓幼葉在含有不同6-BA和NAA濃度組合的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)50 d，出愈率均比較低，最高只有70%，而且所有處理均出現(xiàn)了不同程度地褐化現(xiàn)象，褐化率最高可達(dá)90%。為避免或降低褐化率，實(shí)驗(yàn)采用20%Vc溶液浸泡葉片20min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)處理的褐化率都明顯降低，出愈率都顯著升高。處理1在未經(jīng)Vc溶液處理時(shí)幾乎不能誘導(dǎo)愈傷組織，外植體褐化嚴(yán)重（圖1a），經(jīng)Vc溶液處理后，出愈率是處理前的2.20倍，褐化率降為處理前的70%；處理5出愈率最高，未經(jīng)Vc溶液處理的愈傷組織有一小部分褐化（圖1b），Vc溶液處理后褐化率明顯下降，培養(yǎng)25d左右可見(jiàn)多個(gè)較大的乳白色愈傷組織球（圖1c），50d左右愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，覆蓋所有葉片，呈淡黃色（圖1d）。綜上得出，草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合是6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1mg/ L。

圖1 部分草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)圖

2.2 pH對(duì)草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響 見(jiàn)圖2。

圖2 pH對(duì)草莓葉片出愈率的影響

由圖2可知草莓葉片出愈率隨pH升高呈先增后降趨勢(shì)，當(dāng)pH為5.4時(shí)，培養(yǎng)基不能完全凝固，出愈率較低；pH為6.0時(shí)，出愈率最高可達(dá)93.0%，且愈傷組織生長(zhǎng)良好；當(dāng)pH為6.2時(shí)，葉片出愈率較低[5]。綜上得出，草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基最佳pH6.0。

2.3 蔗糖濃度對(duì)草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 蔗糖濃度對(duì)草莓葉片出愈率的影響到

由圖3可知草莓葉片出愈率隨蔗糖濃度升高呈先增后降趨勢(shì)，蔗糖濃度為1.0%時(shí)，葉片出愈率較低為20%，隨著蔗糖濃度增加，出愈率逐漸增加，當(dāng)蔗糖濃度為3.0%時(shí)，出愈率達(dá)最高值93%，之后出愈率開(kāi)始降低，因此草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳蔗糖濃度為3.0%。

2.4 光照強(qiáng)度對(duì)草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響見(jiàn)圖4。

圖4 光照強(qiáng)度對(duì)草莓葉片出愈率的影響

由圖4可知草莓葉片出愈率隨光照強(qiáng)度增加呈先增后降趨勢(shì)，光照強(qiáng)度為1 000Lx時(shí)，葉片出愈率最低為30%，光照強(qiáng)度增加到2 000Lx時(shí)，葉片出愈率最高為95%，之后隨光照強(qiáng)度增加，葉片外緣開(kāi)始變黃變褐，出愈率逐漸降低，因此，草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳光照強(qiáng)度為2 000Lx。

3 討論

“紅顏”草莓葉片在含有最佳6-BA和NAA濃度組合的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)16d左右長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的愈傷組織，此時(shí)褐化率很低，但隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化逐漸嚴(yán)重，結(jié)果與付崇毅等[6]研究的草莓莖尖褐化程度一致。Vc作為防褐化最常用的抗氧化劑之一，多配制成溶液添加到培養(yǎng)基中[7]。但由于Vc遇熱易分解，因此需要過(guò)濾除菌后再添加到滅菌培養(yǎng)基中，使操作過(guò)程繁瑣，同時(shí)增加了污染的幾率，故實(shí)驗(yàn)采用較高濃度Vc溶液浸泡草莓葉片來(lái)抑制褐化，取得了較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不僅降低了褐化率，還提高了出愈率。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響外植體出愈率的關(guān)鍵因素，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)“紅顏”草莓葉片愈傷組織的最佳濃度組合是6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1mg/L，與“甜查理”草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳濃度組合6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L相似[8]。

pH大小、蔗糖濃度和光照強(qiáng)度也是影響外植體愈傷組織誘導(dǎo)的重要因素。一定范圍內(nèi)，pH大小與培養(yǎng)基的凝固性成正比，因此pH過(guò)大過(guò)小，都不利于外植體對(duì)培養(yǎng)基本成分的吸收和利用[5]，而蔗糖作為外植體生長(zhǎng)的的碳源和能源，其濃度大小不僅影響出愈率，還會(huì)影響愈傷組織的質(zhì)地和結(jié)構(gòu)。光照是外植體愈傷組織誘導(dǎo)所必需的，光照強(qiáng)度直接影響愈傷組織的生長(zhǎng)情況，光照強(qiáng)度過(guò)小，會(huì)降低外植體生理活力，光照強(qiáng)度過(guò)大，容易使酚類(lèi)等物質(zhì)氧化，增加褐化率[9]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，“紅顏”草莓葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基最佳pH6.0，高于珂字棉312愈傷組織誘導(dǎo)的最佳pH5.8[10]；最佳蔗糖濃度為3.0%，與油茶愈傷組織誘導(dǎo)最佳蔗糖濃度一致[11]；最佳光照強(qiáng)度為2000Lx，高于對(duì)高山紅景天愈傷組織誘導(dǎo)的光照強(qiáng)度1000Lx[12]。

[1]晁慧娟，劉 敏，姬謙龍，等.“紅顏”草莓莖尖培養(yǎng)與快速繁殖[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，24（4）：14-16.

[2]孫艷平，龐興城，韓金偉.脫病毒草莓高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2011（6）：20.

[3]董 莉，晁慧娟，董清華，等.“紅顏”草莓葉片再生體系的建立[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（10）：246-249.

[4]韋 瑩，黃寶優(yōu)，繆劍華，等.劍葉龍血樹(shù)疏松愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)研究[J].種子，2016，35（8）：80-82.

[5]王 泉，孫珮石，王樹(shù)坤，等.酸性固體培養(yǎng)基中瓊脂凝固性影響因素的初探[J].環(huán)?？萍?，2008（2）：8-9.

[6]付崇毅，姜 偉，王建國(guó)，等.草莓莖尖組織培養(yǎng)防褐化及玻璃化研究[J].北方農(nóng)業(yè)報(bào)，2016，44（1）：46-51.

[7]張 智，邵菊芳，滕婷婷，等.抗氧化劑對(duì)銀杏愈傷組織褐變的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（30）：13051-13052.

[8]晁慧娟，董 莉，姬謙龍，等.“查理”草莓葉片再生體系的建立[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，24（4）：11-13.

[9]谷延澤，高瑞彥.植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及防治措施[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，12（6）：56-58.

[10]鄒 甜，鄭順利，匡 琛，等.珂字棉312組織培養(yǎng)體系的建立[J].棉花科學(xué)，2016，38（4）：3-7.

[11]王 瑞，陳永忠，王湘南，等.碳源及蔗糖濃度對(duì)油茶愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（1）：223-225.

[12]李金鳳，崔 苗，劉憲虎，等.光溫條件對(duì)高山紅景天愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響[J].北方園藝，2012（11）：185-187.

責(zé)任編輯：建德鋒

Study on the Callus Induction Technology of Benihoppe Strawberry Leaves

WANG Xia,WANG Fengjuan,XIE Xiaodan
（Jilin Agricultural Science and Technology University School of Bioengineering,Jilin 132101）

The effects of plant growth regulators,pH,sucrose concentration and light intensity on the induction of the callus were studied by using leaves of Benihoppe strawberry as explants.The results showed that the inducing callus was easy to brown,and the browning rate was decrease and the callus induction rate was increase when the explant was soaked in the 20%Vc solution for 20 minutes.6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L, pH6.0,sucrose concentration 3.0%were the best medium condictions,and the optimal light intensity was 2 000 Lx.The callus was loose,pale yellow and grew vigorously while the induction rate was 95.0%in the best condictions.

Benihoppe Strawberry；leaf；callus；induction

S668.4

A

2016-11-12

王 霞（1978-），女，江蘇省連云港市人，講師，研究方向：植物分子生物學(xué)。