高倩倩

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院文理學(xué)院，吉林 132101）

鯉魚骨明膠提取工藝優(yōu)化及性質(zhì)研究

高倩倩

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院文理學(xué)院，吉林 132101）

以鯉魚骨作為原料,對其進(jìn)行明膠提取工藝研究，通過采用不同的單因素設(shè)計(jì)及正交試驗(yàn)，確定其提取最佳工藝條件。結(jié)果得出：對鯉魚骨明膠得率產(chǎn)生影響的單因素分別為酸處理用時(shí)、提取溫度、提取用時(shí)、料液比；同時(shí)表明：用硫酸浸泡鯉魚骨的時(shí)間為7 h，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為7 h，料液比為1：6（g/mL)，此工藝條件下，明膠得率為87.1%。鯉魚骨明膠SDS-PAGE電泳可見兩條清晰條帶，蛋白相對分子質(zhì)量為12.9 KDa和11.8 KDa，即構(gòu)成骨明膠組分為α1和α2，紫外光譜分析明膠純度較高。

鯉魚骨；明膠；得率；研究

明膠廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域的原因是因它具有特有的理化性質(zhì)及生物相容性[1-2]。哺乳動物（如牛、豬、羊等等）的骨頭和皮是制備明膠的主要原材料。隨著環(huán)境的變化，明膠原料易受細(xì)菌的侵害，制備明膠的傳統(tǒng)原料地位受到了動搖[3-4]。從而使水產(chǎn)品原料應(yīng)運(yùn)而生，由于其更具安全性，對水產(chǎn)品副產(chǎn)物的利用率更具高值化[5]（如魚骨等），因此市場前景更為廣闊。

鯉魚骨作為魚類產(chǎn)品的下腳料最普遍的處理方法是廢棄，僅有一小部分用于生產(chǎn)小食品或低值魚粉[6-7]，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。有效合理地利用鯉魚下腳料，可以降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是鯉魚加工行業(yè)有待解決的問題[8]。本試驗(yàn)的目的是以鯉魚骨為原料提取明膠，可以增加產(chǎn)品的附加值，減少資源的浪費(fèi)。通過凝膠電泳成像驗(yàn)證蛋白[9]，確定鯉魚骨中明膠存在，從而得到明膠的最大得率，紫外光譜分析判斷明膠的純度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料試劑 鯉魚骨；石油醚、EDTA、四甲基乙二胺、過硫酸銨、甘油、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、SDS、三羥甲基氨基甲烷、Tris-Hcl、TEMED、考馬斯亮藍(lán)R-250。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 電泳儀、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、勻漿機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水浴鍋、離心機(jī)、冷凍干燥機(jī)、紫外分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基本成分測定 水分、灰分、脂肪、蛋白質(zhì)、羥脯氨酸含量均按國標(biāo)方法測定。

1.2.2 鯉魚骨明膠的提取 （1）工藝流程：新鮮鯉魚骨→清洗、去除雜質(zhì)→脫脂（石油醚回流脫脂）→硫酸浸泡→稱量→加水→勻漿提膠→離心→濃縮→冷凍干燥→稱量→明膠樣品。（2）操作步驟：將鯉魚骨洗凈，清除骨頭上的魚肉等雜質(zhì)，100℃干燥，研缽研成粉末。用托盤天平準(zhǔn)確稱取鯉魚骨粉20 g，以石油醚作溶劑，索氏提取1.5 h，在經(jīng)過蒸餾濃縮、進(jìn)一步升華脫脂[10]，再浸入到H2SO4溶液中，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為3.5～4.5，浸泡時(shí)間4～8h最好。當(dāng)鯉魚骨浸泡至發(fā)軟時(shí)撈出洗凈，稱量。向稱重后的鯉魚骨中加水，勻漿（T= 55℃，t=5.5 h）后按照試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，離心（4000轉(zhuǎn)，10 min)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（T=60℃，旋轉(zhuǎn)12 min)，得到濃縮液，冷凍干燥（-70℃，3-4d），得到明膠樣品，稱重。（3）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：①配制溶液：A液-丙烯酰胺儲存液；B液-分離膠緩沖液；C液-堆積膠緩沖溶液；10%過硫酸銨；電泳緩沖液；TEMED；考馬斯亮藍(lán)染液；考馬斯亮藍(lán)脫色液；上樣緩沖液。②樣品處理：分別取魚骨提膠樣品1，2，3，4，5號20 uL，加入離心管中，分別加入上樣緩沖液5 uL，充分混合均勻，水浴加熱（T=100℃，t=5 min），取出并放于室溫。③上樣：將上述樣品通過微量注射器導(dǎo)入樣品孔中，上樣時(shí)間1.5 h，逐漸升高注射器針頭，避免帶入氣泡。④考馬斯亮藍(lán)染色：將上樣液用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，放到搖床上染色0.5 h。⑤脫色∶用考馬斯亮藍(lán)脫色液脫色3～4 h，每2 h換一次脫色液。⑥照相，確定蛋白分子量。（4）明膠得率計(jì)算：D/%=A/B×100%；式中：D為明膠得率；A為明膠質(zhì)量（g)；B為原料魚骨質(zhì)量（g)。（5）單因素試驗(yàn)：通過預(yù)試驗(yàn)可以得到，酸處理時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間、提膠料液比是鯉魚骨明膠得率的最大影響因素。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，各因素梯度分別為：酸處理時(shí)間為4、5、6、7、8 h；提取溫度10、20、30、40、50℃；提取時(shí)間4、5、6、7、8 h；提膠料液比1：2、1：4、1：6、1：8、1：10（g/mL)，重復(fù)試驗(yàn)3次。（6）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：分析單因素試驗(yàn)中4個(gè)因素的影響。確定水平取值范圍，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。（7）紫外光譜分析：將提取得到的明膠樣品置于燒杯中，加入0.8 mol/L冰乙酸溶液，使其溶解，配制成1 mg/mL的明膠溶液，在200～400 nm處使用UV-2102PC紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果與分析

表1 鯉魚骨基本組成成分

2.2 鯉魚骨明膠提取單因素試驗(yàn)

圖1 硫酸處理時(shí)間對明膠得率的影響

2.2.1 硫酸處理時(shí)間對明膠得率的影響 見圖1。由圖1可知，當(dāng)酸處理時(shí)間小于7 h時(shí)，明膠得率上升顯著，酸處理時(shí)間在7 h時(shí)，明膠得率最高，還可降低時(shí)間上的成本；當(dāng)酸處理時(shí)間進(jìn)一步提高時(shí)，得率變化不明顯。

2.2.2 提取溫度對明膠得率的影響 見圖2。

圖2 提取溫度對明膠得率的影響

由圖2可知，明膠得率與溫度相關(guān)，溫度低于40℃時(shí)，提膠樣品溶液較稀薄，膠少，溫度達(dá)到40℃時(shí)明膠得率最高，如果超過40℃，高溫下明膠會發(fā)生水解，明膠得率下降。

2.2.3 提取時(shí)間對明膠得率的影響 見圖3。

圖3 提取時(shí)間對明膠得率的影響

2.1 基本成分測定見表1。

由圖3可知，明膠得率隨時(shí)間增加而增加，時(shí)間達(dá)到7 h時(shí)有著較高的明膠得率。當(dāng)t增加時(shí)，明膠得率變化不明顯。由于熱水抽提時(shí)間過短，導(dǎo)致明膠無法充分提取出來，得率太低；如果用時(shí)過長，明膠會過度水解。所以提取時(shí)間為7 h最好。

2.2.4 提膠料液比對明膠得率的影響 見圖4。

圖4 料液比對明膠得率的影響

由圖4可知，提膠料液比1：6 g/mL時(shí)明膠得率最高，如提膠料液比低于1：6 g/mL時(shí)，明膠得率趨于平穩(wěn)，基本上沒有太大變化。而不斷增加料液比會增加上述操作工作量，所以，提膠料液比選為1：6 g/mL比較適宜。

2.3 鯉魚骨明膠提取的正交優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選用L9（34)正交試驗(yàn)因素水平表（見表2），確定鯉魚骨明膠提取的最佳工藝條件。

表2 正交試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 見表3。

由表3中R值可以看出，各因素對明膠得率的影響由大到小的順序?yàn)樗崽幚頃r(shí)間、料液比、提取時(shí)間、提取溫度。因此，酸處理時(shí)間影響明膠得率的程度最為顯著。通過分析明膠得率最佳組合為A2B1C3D3，可以得出，提取鯉魚骨明膠時(shí)用硫酸處理時(shí)間為7 h，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為7 h，料液比為1：6（g/mL)，在此工藝條件下，明膠得率為87.1%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4 鯉魚骨膠原SDS-PAGE凝膠電泳---電泳成像

鯉魚骨明膠相對分子質(zhì)量如圖5。由圖5可見，明膠有明顯的兩條電泳條帶在130 000和97 400之間，相對分子質(zhì)量分別為12.9KDa和11.8KDa。膠原α中分別顯示α1與α2，就是蛋白電泳形成的。而接近97 000這個(gè)量，它是膠原相對分子質(zhì)量，是由標(biāo)準(zhǔn)蛋白構(gòu)成的。從電泳中可以看到，下圖顯示的相對分子質(zhì)量要比標(biāo)準(zhǔn)蛋白膠原的α鏈大很多，鯉魚骨明膠結(jié)構(gòu)是有分支的，它構(gòu)成膠原α組分完全是由完整的構(gòu)成膠原α鏈上的共價(jià)交聯(lián)一些小肽片段構(gòu)成。骨膠原轉(zhuǎn)化為明膠的過程中，之所以導(dǎo)致明膠分子非均一性，主要是因?yàn)閿嗔训墓矁r(jià)交聯(lián)鍵、肽鍵、次級鍵之間無規(guī)則排列造成的。

圖5 鯉魚骨明膠的電泳圖

2.5 明膠的紫外光譜分析 見圖6。

圖6 鯉魚骨明膠的紫外光譜吸收

蛋白質(zhì)分子中含有能在紫外波長光范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的基團(tuán)，一般稱為生色團(tuán)或發(fā)色團(tuán)貨色基。各種紫外生色基團(tuán)的加和會促使蛋白質(zhì)溶液在紫外區(qū)存在吸收。由圖6可見，鯉魚骨明膠最大吸收波長在約235 nm處，明膠的特征吸收峰與之對應(yīng)，主要是由有機(jī)化合物明膠的n→π*和n→σ*價(jià)電子能級躍遷所產(chǎn)生。在280 nm處吸收較少，說明樣品只含有少量芳香族氨基酸，所提取的明膠純度較高。

3 結(jié)論

明膠作為重要的食品添加劑的原因是它具有較好的膠黏、高度分散、特低粘度、分散穩(wěn)定、持水、韌性、被覆性及可逆性等物理性質(zhì)。

本試驗(yàn)主要是以鯉魚骨作為試驗(yàn)原料提取明膠。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用正交試驗(yàn)確定鯉魚骨提取明膠最佳條件，酸處理用時(shí)對明膠得率的影響最為顯著。通過正交試驗(yàn)結(jié)果中的極差R可以得出明膠得率最佳組合為A2B1C3D3，即鯉魚骨明膠提取時(shí)用硫酸處理7 h，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為7 h，料液比為1：6（g/mL)，在此優(yōu)化條件下，明膠得率為87.1%。各因素對明膠得率的影響順序?yàn)樗崽幚頃r(shí)間、料液比、提取時(shí)間、提取溫度。

鯉魚骨明膠SDS-PAGE電泳可見兩條清晰條帶，蛋白相對分子質(zhì)量為12.9 KD和11.8KD，即構(gòu)成骨明膠組分為α1和α2，有明膠存在。紫外吸收光譜測定結(jié)果表明，明膠在235 nm處有最大吸收，在280 nm處吸收較少，其純度較高。因此，可應(yīng)用于食品藥品的開發(fā)與利用上，為人類提供更好的資源。而且鯉魚骨作為加工之后的下腳料并未充分利用，多用于當(dāng)飼料或肥料，現(xiàn)在將其進(jìn)行高效綜合利用，可提高鯉魚加工的附加值，獲得良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。

[1]許永安，位紹紅.明膠提取工藝及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].福建水產(chǎn)，2007（2)：29-32.

[2]吳菲菲，曹敏杰.羅非魚魚鱗明膠蛋白膜的制備及特性[J].食品工業(yè)科技，2013（11)：53-56.

[3]蔣挺大.膠原與膠原蛋白[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：23-24.

[4]宋金紅.巴沙魚皮明膠生產(chǎn)工藝研究及工廠設(shè)計(jì)[D].中國海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文，2012.

[5]劉 慧.多組分定量分析的迭代優(yōu)化—紫外分光光度法的研究[D].中國海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

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責(zé)任編輯：建德鋒

Study on the Extraction and Property of Gelatin from Carp Bone

GAO Qianqian
（Jilin Agricultural Science and Technology Unversity School of Arts and Sciences,Jilin 132101）

In the study,took carp bone as the material and tried to generalize its gelatin extraction technology.Single factor experiment was adopted,through orthogonal experiment to determine the best technical condition.The effect of sulfuric acid treatment time,extraction temperature,extraction time,gelatin liquid ratio was studied on the yielding rate of carp bone gelatin.the results showed that the optimal extraction technology for carp bone gelatin was 1.2%sulfuric acid for 7 h,extracting material liquid proportion being 1∶6 (g/ml),extraction temperature 40℃.In this process conditions,the yield was 87.1%.Carp bone gelatin SDSPAGE electrophoresis showed two clear bands,the relative molecular weight of the protein was 12.9 KDa and 11.8 KDa,that was,the composition of the bone gelatin group was divided into alpha 1 and alpha 2.

carp bone;gelatin;yield;study

TS254.9

A

2016-12-23

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院青年基金項(xiàng)目（119012014022）

高倩倩（1982-），女，吉林省農(nóng)安縣人，實(shí)驗(yàn)師，從事食品化學(xué)研究。