楊國曦， 朱慶生， 楊重飛

(第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院骨一科， 陜西 西安 710032)

Mac-1在破骨細(xì)胞分化中的作用*

楊國曦， 朱慶生△， 楊重飛△

(第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院骨一科， 陜西 西安 710032)

目的： 探究巨噬細(xì)胞分化抗原1(Mac-1)分子在核因子κB受體活化因子配體(RANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中作用的分子機(jī)制。方法: 取4周齡C57BL/6J小鼠脾細(xì)胞，用RANKL及巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)誘導(dǎo)，同時(shí)用抗CD11b及抗CD18的特異性抗體進(jìn)行處理，1周后對細(xì)胞核和細(xì)胞骨架進(jìn)行染色；用抗CD11b抗體、干擾CD11b基因的慢病毒及其對照空載病毒處理RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞，1周后對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色；取4周齡C57BL/6J小鼠脾細(xì)胞用RANKL及M-CSF誘導(dǎo)，同時(shí)用抗CD11b抗體、干擾CD11b的慢病毒及其對照空載病毒分別進(jìn)行處理，1周后提取總蛋白進(jìn)行Western blot檢測。結(jié)果: CD11b抗體組和雙抗體組的多核細(xì)胞形成率低于對照組和CD18抗體組，雙抗體組和CD11b抗體組之間多核細(xì)胞形成率的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示病毒組的CD11b、Syk及NFATc1表達(dá)強(qiáng)度均低于對照病毒組，CD11b抗體組的CD11b、Syk及NFATc1表達(dá)強(qiáng)度均低于對照組；Western blot結(jié)果顯示，CD11b抗體組的CD11b、Syk、NFATc1、c-Fos及 p-ERK/ERK水平均低于對照組，病毒組的CD11b、Syk、NFATc1、c-Fos及p-ERK/ERK水平均低于對照病毒組。結(jié)論: Mac-1分子中CD11b亞基對破骨細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用。該分子通過激活下游Syk通路，上調(diào)c-Fos，增加ERK活性，最終上調(diào)NFATc1而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化。

巨噬細(xì)胞分化抗原1； 破骨細(xì)胞； 慢病毒

破骨細(xì)胞由多個破骨前體細(xì)胞融合而成，是人體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞。破骨前體細(xì)胞分布于外周循環(huán)和骨髓內(nèi)[1-2]，因此，破骨前體細(xì)胞的遷徙對破骨細(xì)胞的融合和到達(dá)骨表面尤為重要。當(dāng)破骨前體細(xì)胞分化至抗酒石酸磷酸酶陽性時(shí)，破骨前體細(xì)胞開始融合并最終形成成熟破骨細(xì)胞[3]。

作為黏附分子家族中的重要成員之一，整合素對破骨前體細(xì)胞的遷徙和分化具有非常重要的作用。整合素由α、β亞基以非共價(jià)結(jié)合的方式形成，其中，白細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(leukocyte function-associated antigen-1，LFA-1/CD11a/CD18)和巨噬細(xì)胞分化抗原1(macrophage differentiation antigen-1，Mac-1/CD11b/CD18)主要表達(dá)在破骨前體細(xì)胞表面，并且在破骨細(xì)胞分化過程中扮演重要角色[4]。細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1/CD54)參與破骨細(xì)胞的遷徙和分化過程，且LFA-1和Mac-1均為ICAM-1的受體[5]， LFA-1與ICAM-1的相互作用在破骨細(xì)胞分化過程中是必需的[6]，而作為與LFA-1僅有一個亞基之差的Mac-1在破骨細(xì)胞分化中的作用研究尚少。

本研究將以原代破骨前體細(xì)胞為研究對象，通過抗體封閉和基因沉默等方式，研究Mac-1分子在核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中的作用和初步分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動物

C57BL/6J小鼠選自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；CD11b基因敲除小鼠(品系: B6.129S4-Itgamtm1Myd/J)購自JAX。于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)繁殖。

2 主要試劑和儀器

CD11b單克隆抗體和CD18單克隆抗體(Abcam)；RANKL和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)購自Sigma；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Cytoskeleton)；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自CST；沉默Itgam(編碼CD11b的基因)的慢病毒及其對照空載病毒(GeneCopoeia)。

熒光顯微鏡(Zeiss)；電子顯微鏡(Olympus)。

3 主要方法

3.1 肌動蛋白染色實(shí)驗(yàn) 取4周齡C57BL/6J雌性小鼠，取脾，研磨后利用70 μm細(xì)胞濾器過濾，取細(xì)胞濾液用α-MEM培養(yǎng)基及RANKL(100 μg/L)、M-CSF(10 μg/L)培育，同時(shí)于培養(yǎng)基中加入CD11b抗體和CD18抗體。對照組不加入抗體；CD11b抗體組加入5 μg/L CD11b抗體；CD18抗體組加入5 μg/L CD18抗體；雙抗體組同時(shí)加入CD11b及CD18抗體。隔天換液并重新加入抗體，1周后，用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染細(xì)胞肌動蛋白，DAPI染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3.2 免疫熒光染色 在48孔板中利用RANKL和M-CSF誘導(dǎo)破骨細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染系數(shù)為10(每個細(xì)胞轉(zhuǎn)染10個病毒顆粒)在病毒組加入沉默CD11b基因的慢病毒，對照病毒組加入對照空載病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，CD11b抗體組加入CD11b抗體(5 μg/L)，對照組除加入RANKL(100 μg/L)和M-CSF(10 μg/L)外不做其他處理。培養(yǎng)1周后，吸出培養(yǎng)基，用Triton做透化處理，并分別孵育Ⅰ抗和Ⅱ抗，并用熒光顯微鏡拍照。

3.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取各組破骨細(xì)胞細(xì)胞總蛋白。定量、電泳、轉(zhuǎn)膜并封閉，分別孵育兔抗小鼠Ⅰ抗(1∶1 000)及羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)后，ECL 發(fā)光液化學(xué)發(fā)光，顯影。采用Quantity One 軟件進(jìn)行掃描定量，計(jì)算各條帶灰度值，并分別除以內(nèi)參照β-actin灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 14.0 軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肌動蛋白染色結(jié)果

CD11b抗體組和雙抗體組可見許多較小細(xì)胞團(tuán)塊，肌動蛋白呈綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞分化不良，呈小圓球形，細(xì)胞核分散，未見多核融合現(xiàn)象；CD18抗體組和對照組可見較多大細(xì)胞，細(xì)胞分化良好，有較多圓盤狀細(xì)胞團(tuán)落，細(xì)胞核集中，多核融合現(xiàn)象突出。

CD11b抗體組和雙抗體組多核細(xì)胞形成率低于對照組及CD18抗體組(P<0.05)；雙抗體組的多核細(xì)胞形成率與CD11b抗體組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

2 免疫熒光染色結(jié)果

CD11b(紅色)染色結(jié)果顯示：CD11b抗體組可見細(xì)胞表面附近零星分布紅色熒光，提示CD11b分子被抗體封閉；對照組可見較多紅色熒光分布于細(xì)胞表面附近；病毒感染組細(xì)胞表面附近基本未見紅色熒光；對照病毒組可見細(xì)胞表面附近有較多紅色熒光。

Figure 1.The fluorescence staining of osteoclast actin (×200) and the number of multinuclear cells. Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs control.

脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)染色結(jié)果顯示：CD11b抗體組可見綠色陽性熒光主要分布于細(xì)胞胞漿內(nèi)；對照組可見較多綠色熒光分布于包漿部位；病毒感染組可見胞內(nèi)分布較少綠色熒光；對照病毒組可見綠色熒光均勻分布于細(xì)胞內(nèi)。

活化T細(xì)胞核因子 1(nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1)染色結(jié)果顯示：CD11b抗體組可見細(xì)胞包漿部位少量綠色熒光；對照組可見較多綠色熒光分布于包漿內(nèi)部；病毒感染組胞漿部位基本未見綠色熒光；對照病毒組可見包漿內(nèi)較多綠色熒光，見圖2。

3 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CD11b抗體組及慢病毒轉(zhuǎn)染組CD11b、Syk、p-ERK/ERK、c-Fos及NFATc1灰度值均下調(diào)。各組條帶曝光結(jié)果見圖3，灰度值分析見表1。

討 論

黏附分子是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的膜表面糖蛋白，參與細(xì)胞的黏附和分化過程，其表達(dá)的高低與包括炎癥在內(nèi)的病理過程密切相關(guān)。整合素是黏附分子家族的重要成員之一，是α、β2種亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合構(gòu)成的異二聚體[7]，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答及細(xì)胞黏附遷徙，在先天性免疫中至關(guān)重要，其缺失或封閉會嚴(yán)重阻礙免疫細(xì)胞向感染區(qū)域的遷徙滲透并導(dǎo)致病原體的大量繁殖[8]。整合素Mac-1由CD11b(αM)和CD18(β2)兩個亞基組成，除上述功能外，該分子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]過程中同樣發(fā)揮重要作用[9-11]。

Figure 2.Immunofluorescence staining of the osteoclasts with different treatments (×200). Red: CD11b; green: Syk and NFATc1.

CD11b分子可以在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮促進(jìn)作用。本研究用Western blot 實(shí)驗(yàn)和免疫熒光染色結(jié)果表明，CD11b分子通過募集Syk分子，上調(diào)了其下游c-fos和ERK活性，最終上調(diào)起始破骨細(xì)胞分化的NFATc1轉(zhuǎn)錄因子，從而發(fā)揮促分化效應(yīng)。Hayashi等[12]發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的形成率與細(xì)胞密度，而非細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，這是由于破骨前體細(xì)胞間融合需要Mac-1分子和ICAMs相互識別，這種識別使破骨前體細(xì)胞“意識”到其他前體細(xì)胞的存在，從而促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和融合，細(xì)胞密度越大，遷移距離越短，細(xì)胞融合率越高，在該研究中，經(jīng)CD11b抗體處理后，RANKL誘導(dǎo)下的RAW264.7細(xì)胞系破骨細(xì)胞形成率較對照組顯著下降；通過RNA干擾技術(shù)阻止RAW264.7細(xì)胞系表達(dá)CD11b后，RANKL誘導(dǎo)下的破骨細(xì)胞形成率較對照組降低，該研究結(jié)果在蛋白質(zhì)和基因水平上說明了CD11b對破骨細(xì)胞的分化促進(jìn)作用。

CD18分子在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過程中不發(fā)揮促進(jìn)效應(yīng)。在肌動蛋白染色結(jié)果中，經(jīng)CD18抗體封閉，原代破骨細(xì)胞形成率與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明該分子在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中不具備促進(jìn)作用。CD11b的C-端凝集素結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合外源性受體，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附及信號的胞外至胞內(nèi)傳導(dǎo)，證明了在Mac-1介導(dǎo)的細(xì)胞黏附和信號傳導(dǎo)中，CD11b亞基起到主導(dǎo)作用，而不是CD18[13-14]。

表1 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果的半定量分析

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vscontrol virus group.

本實(shí)驗(yàn)以Mac-1分子為研究對象，證明了Mac-1的CD11b亞基可以通過激活Syk通路促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化，而另一亞基CD18不具備相同功能，該結(jié)論為臨床無菌性松動的治療提供了一定的理論依據(jù)。

[1] Kindle L, Rothe L, Kriss M, et al. Human microvascular endothelial cell activation by IL-1 and TNF-alpha stimulates the adhesion and transendothelial migration of circulating human CD14+monocytes that develop with RANKL into functional osteoclasts[J]. J Bone Miner Res, 2006, 21(4):193-206.

[2] Brandi ML, Collin-Osdoby P. Vascular biology and the skeleton[J]. J Bone Miner Res, 2006, 21(5):183-192.

[3] Takeshita S, Kaji K, Kudo A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts[J]. J Bone Miner Res, 2000, 15(1):1477-1488.

[4] Okada Y, Morimoto I, Ura K, et al. Cell-to-cell adhesion via intercellular adhesion molecule-1 and leukocyte function-associated antigen-1 pathway is involved in 1α, 25(OH)2D3, PTH and IL-1α-induced osteoclast differentiation and bone resorption[J]. Endocr J, 2002, 49(3):483-495.

[5] Tani-Ishii N, Penninger JM, Matsumoto G, et al. The role of LFA-1 in osteoclast development induced by co-cultures of mouse bone marrow cells and MC3T3-G2/PA6 cells[J]. J Periodontal Res, 2002, 37(7):184-191.

[6] Garcia-Palacios V, Chung HY, Choi SJ, et al. Eosinophil chemotactic factor-L (ECF-L) enhances osteoclast formation by increasing in osteoclast precursors expression of LFA-1 and ICAM-1[J]. Bone, 2007, 40(9):316-322.

[7] Lim K, Hyun YM, Lambert-Emo K, et al. Visualization of integrin Mac-1invivo[J]. J Immunol Methods, 2015, 426(1):120-127.

[8] Zhou Y, Wu J, Kucik DF, et al. Multiple lupus-associa-ted ITGAM variants alter Mac-1 functions on neutrophils[J]. Arthritis Rheum, 2013, 65(4):2907-2916.

[9] Li N, Mao D, Lu S, et al. Distinct binding affinities of Mac-1 and LFA-1 in neutrophil activation[J]. J Immunol, 2013, 190(8):4371-4381.

[10]Zhou H, Liao J, Aloor J, et al. CD11b/CD18 (Mac-1) is a novel surface receptor for extracellular double-stranded RNA to mediate cellular inflammatory responses[J]. J Immunol, 2013, 190(6):115-125.

[11]Silveira AA, Dominical VM, Lazarini M, et al. Simvastatin abrogates inflamed neutrophil adhesive properties, in association with the inhibition of Mac-1 integrin expression and modulation of Rho kinase activity[J]. Inflamm Res, 2013, 62(5):127-132.

[12]Hayashi H, Nakahama K, Sato T, et al. The role of Mac-1 (CD11b/CD18) in osteoclast differentiation induced by receptor activator of nuclear factor-κB ligand[J]. FEBS Lett, 2008, 582(10):3243-3248.

[13]Ross GD. Role of the lectin domain of Mac-1/CR3 (CD11b/CD18) in regulating intercellular adhesion[J]. Immunol Res, 2002, 25(2):219-227.

[14]滕曉英，王連唐. 破骨細(xì)胞功能調(diào)控與骨質(zhì)疏松癥[J]. 中國病理生理雜志， 2002, 18(8):1012-1015.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Role of Mac-1 in osteoclast differentiation

YANG Guo-xi, ZHU Qing-sheng, YANG Chong-fei

(TheFirstDepartmentofOrthopedics,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:y384537310@126.com)

AIM: To investigate the function of macrophage differentiation antigen-1 (Mac-1) in receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation and the mechanisms. METHODS: The spleen cells were isolated from 4-week-old C57BL/6J mice, and cultured with RANKL, macrophage colony-stimulating factor and CD11b and CD18 antibodies for 1 week. The actin bundles were stained with rhodamine-labeled phalloidin, and nuclei were stained with DAPI. CD11b and CD18 antibodies, lentivirus with interfering vector plasmid of target geneItgam(encoding CD11b) and empty virus (control virus) were used to treat osteoclasts for 1 week, and then immunofluorescence staining was performed. CD11b antibody, lentivirus and control virus were used to treat osteoclasts for 1 week, and total protein was taken for Western blot. RESULTS: Lower multinuclear positive rates in the groups treated with CD11b antibody were observed than that in the groups treated with CD18 antibody and control group. Lower immunofluorescence intensity of Syk, CD11b and NFATc1 was found in CD11b antibody group than that in control group. Lower Syk, CD11b and NFATc1 immunofluorescence intensity was also observed in lentivirus group than that in control virus group.The results of Western blot analysis showed that the protein levels of CD11b, Syk, NFATc1, c-Fos and p-ERK/ERK in CD11b antibody group were decreased as compared control group. Compared with control virus group, the protein levels of CD11b, Syk, NFATc1, c-Fos and p-ERK/ERK in lentivirus group were also decreased. CONCLUSION: CD11b subunit of Mac-1 promotes osteoclast differentiation by up-regulating c-Fos, ERK activity and NFATc1.

Macrophage differentiation antigen-1; Osteoclasts; Lentivirus

1000- 4718(2017)03- 0539- 05

2016- 09- 27

2016- 12- 09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81301541)

△通訊作者 Tel: 029-86126666； E-mail: y384537310@126.com

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A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.026