劉 濤， 宋 敏 △， 鞏彥龍， 周靈通， 董萬濤， 劉建鴻

(1甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000； 2甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020)

活血定眩膠囊含藥血清減輕小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞bEnd.3缺氧損傷*

劉 濤1， 宋 敏1△， 鞏彥龍1， 周靈通1， 董萬濤2， 劉建鴻1

(1甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020)

目的： 研究活血定眩膠囊含藥血清對抗缺氧所致小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞bEnd.3損傷的作用。方法：將30只大鼠隨機分為空白對照組15只和活血定眩膠囊組15只，采集2組大鼠血清。將bEnd.3細胞分為正常組、缺氧模型組和活血定眩膠囊血清組，給藥后，bEnd.3細胞缺氧6 h。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，流式細胞術檢測細胞凋亡率及細胞周期，按試劑盒方法檢測細胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量。結果：活血定眩膠囊含藥血清可顯著對抗缺氧造成的損傷，明顯改善bEnd.3細胞的形態(tài)，使缺氧所致細胞凋亡數(shù)明顯減少，有效抑制缺氧誘導的bEnd.3細胞發(fā)生G1/S 期阻滯，抑制MDA生成，增強SOD活性。結論：活血定眩膠囊對缺氧所致bEnd.3細胞的損傷具有明顯的對抗作用，其機制與增強細胞抗氧化能力、抑制細胞凋亡有關。

活血定眩膠囊； 小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞； 缺氧； 細胞凋亡

椎動脈型頸椎病(cervical spondylosis of vertebral artery type，CSA)是由于頸椎局部退行性變引起鉤小關節(jié)位移、椎關節(jié)骨質(zhì)增生、頸部肌肉痙攣等刺激壓迫椎動脈，引發(fā)椎動脈狹窄、痙攣或屈曲等改變，從而導致椎基底動脈供血不足引起眩暈、眼花、耳鳴、頭項僵痛甚則昏厥為主要臨床表現(xiàn)的一種頸椎病，臨床發(fā)病率僅次于神經(jīng)根型頸椎病，約占所有頸椎病的20%。近年來，該病呈現(xiàn)出不斷增長和年輕化趨勢[1-2]。血管內(nèi)皮細胞具有維持管壁通透性、抗血栓形成、調(diào)節(jié)血管張力、血壓和血流速度的生理功能，干預多種與血管有關疾病的生理病理過程[3]。bEnd.3細胞是人工改造而獲得的一種血管內(nèi)皮細胞株，具備一系列微血管內(nèi)皮細胞的特征?；钛ㄑＤz囊是甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，經(jīng)過十幾年臨床應用與實驗研究，對CSA療效確切，但其機理尚未明了。前期體外研究表明，活血定眩膠囊能改善血管微循環(huán)、抑制自由基的氧化損傷，對大鼠椎動脈血流動力學及血液流變學改變方面具有良好的改善作用[4-5]。本實驗采用小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞bEnd.3建立缺氧損傷模型，從細胞水平上探討活血定眩膠囊對缺氧所致bEnd.3細胞損傷的作用及其機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 藥品與試劑 活血定眩膠囊的組成包括炙黃芪、丹參、粉葛、白芷等，每粒0.5 g，甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院配制生產(chǎn)，批準文號為甘藥制字Z20130010；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液(Gibco)；丙二醛(malonaldehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒和PI/RNase staining緩沖液(BD)；其余試劑均為市售分析純。

1.2 動物及細胞株 10月齡SPF級健康Wistar大鼠 30只，雌雄各半，體質(zhì)量(300±20) g，生產(chǎn)許可證號為SCXK(甘)2015-0021，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞bEnd.3為和元生物技術有限公司提供。

1.3 儀器 全自動細胞熒光計數(shù)分析儀(Cellometer)；流式細胞儀(COULTER EPICS XL)；酶標儀(Bio-Rad)；倒置相差顯微鏡(Olympus)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋電機公司)。

2 方法

2.1 含藥物血清的制備 將30只SPF級Wistar大鼠(雌雄各半)隨機分為空白對照組和活血定眩膠囊組。依據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算Wistar大鼠灌胃劑量，以5倍等效劑量的活血定眩膠囊給大鼠灌服，空白對照組只灌服相同體積的生理鹽水。每日 2 次，連續(xù)給藥 7 d，末次灌胃2 h后用10% 水合氯醛麻醉，腹主動脈采集血液，3 000 r/min離心15 min，過濾除菌后制得含藥血清，-20℃保存。

2.2 bEnd.3細胞的培養(yǎng) 復蘇小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞株bEnd.3，將其用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，待細胞生長至融合狀態(tài)后用0.5% 胰蛋白酶消化傳代備用。

2.3 分組、給藥與造模 經(jīng)MTT實驗確定活血定眩膠囊細胞毒性劑量范圍，預實驗確定給藥劑量。取長成致密單層的bEnd.3細胞，分為正常組、模型組和活血定眩膠囊含藥血清組，每組5個復孔。給藥前輕輕吸去6孔板里培養(yǎng)基，PBS洗1 遍，正常組和模型組加入10%空白血清+無血清DMEM培養(yǎng)基，給藥組加入無血清DMEM完全培養(yǎng)基+10%活血定眩膠囊含藥血清。正常組37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)6 h；其它各組均置于37 ℃三氣培養(yǎng)箱中，持續(xù)通入95% N2+5% CO2的混合氣體缺氧6 h[6-7]，倒置顯微鏡下觀察(×40)各組細胞形態(tài)。

2.4 MDA含量和SOD活性的檢測 實驗按“2.3”項方法分組、給藥及造模，去除各組細胞培養(yǎng)基，PBS 洗2次，用細胞刮收集培養(yǎng)皿中細胞，在冰上用細胞破碎機破碎細胞，4 ℃、12 000 r/min離心20 min 后取上清，上樣量為100 μL，再按試劑盒說明書方法測定MDA和SOD活性。

2.5 流式細胞術檢測bEnd.3細胞周期及早期凋亡 實驗按“2.3”項方法分組、給藥及造模，每組設3個復管，以70%乙醇、-20 ℃ 固定2 h，PBS和PI/RNase staining緩沖液分別洗細胞1 次，PI 染色30 min，流式細胞儀檢測。按照上法,每組設3個復管，加Annexin V binding 緩沖液500 μL，振蕩成單細胞懸液，Annexin V-FITC/PI 雙染后，流式細胞儀檢測。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 bEnd.3 生長曲線的測定

使用MTT測定第3代小鼠bEnd.3細胞1～8 d的活力，繪制的生長曲線呈S型，由圖1可見細胞在前2 d生長緩慢，第3天起迅速增長，6 d后生長減慢。由此選擇傳代后3～5 d進行共培養(yǎng)實驗。

2 形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡觀察各組細胞。正常組bEnd.3細胞多呈長梭形或多邊形，排列緊密，呈典型“鋪路石”樣排列; 模型組細胞體積收縮，細胞間間隙擴大，且出現(xiàn)很多亮點，出現(xiàn)越來越多的凋亡及壞死細胞；活血定眩膠囊含藥血清組相較于模型組而言，細胞連接更緊密，形態(tài)更飽滿，說明活血定眩膠囊含藥血清能減輕在缺氧條件下小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的細胞形態(tài)，見圖2。

Figure 1.The growth curve of the third generation of bEnd.3 cells cultured with 10% FBS.

Figure 2.Morphological observation of bEnd.3 cells in each group(×40).

3 活血定眩膠囊對缺氧損傷的bEnd.3細胞中MDA含量與SOD 活性的影響

與正常組相比，模型組bEnd.3細胞由于缺氧促進MDA的釋放，SOD活性降低(P<0.01)，表明細胞膜受到了明顯損傷，通透性增加，清除氧自由基的能力下降?；钛ㄑＤz囊含藥血清組能顯著抑制細胞上清液中MDA的增加(P<0.01)，并顯著增強SOD 的活性(P<0.01)，見表1。

表1 活血定眩膠囊對缺氧損傷的bEnd.3細胞MDA含量和SOD活性的影響

**P<0.01vsnormal group；△△P<0.01vsmodel group.

4 活血定眩膠囊對缺氧損傷的bEnd.3細胞早期凋亡的影響

正常組早期凋亡bEnd.3細胞僅有6.5%；缺氧模型組則高達45.5%；活血定眩膠囊含藥血清作用于bEnd.3細胞6 h后，早期凋亡率為17.5%，與模型組相比差異顯著(P<0.01),表明活血定眩膠囊能夠明顯抑制缺氧誘導的bEnd.3細胞早期凋亡的進程，見圖3、表2。

Figure 3.Effects of Huoxue-Dingxuan capsule-medicated serum on early apoptosis of bEnd.3 cells induced by hyoxia.

5 活血定眩膠囊對bEnd.3細胞周期的影響

與正常組比較，模型組G1期bEnd.3細胞顯著增加(P<0.05)，S期細胞顯著減少(P<0.01)，表明缺氧可誘導bEnd.3細胞發(fā)生G1/S 期阻滯。與模型組相比，活血定眩膠囊含藥血清組S期細胞顯著增加(P<0.05)，G1期細胞減少(P<0.05)，表明活血定眩膠囊含藥血清能有效抑制缺氧誘導的bEnd.3細胞發(fā)生G1/S期阻滯，見圖4、表2。

Figure 4.Effects of Huoxue-Dingxuan capsule on the cell cycle of bEnd.3 cells induced by hypoxia.

表2 活血定眩膠囊對缺氧損傷的bEnd.3早期凋亡率及細胞周期的影響

*P<0.05,**P<0.01vsnormal group；△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

討 論

CSA是頸椎病的常見類型之一,由于病因復雜，發(fā)病機制尚未完全明了，其預防與治療比較棘手。目前多認為CSA是由于頸椎退行性改變、椎基底動脈供血不足、組織慢性缺血缺氧損傷，從而出現(xiàn)以眩暈為主的臨床綜合征[8]。CSA發(fā)病過程中，由于頸椎退行性變引起鉤椎關節(jié)骨質(zhì)增生、小關節(jié)位移、頸部肌痙攣、頸交感神經(jīng)等因素刺激，椎動脈血管炎癥反應，釋放有關細胞因子、內(nèi)分泌激素、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽類等信息分子，導致椎-基底動脈供血不足，以致出現(xiàn)慢性腦缺血缺氧損傷。減輕缺血缺氧后內(nèi)皮損傷是防治椎動脈型頸椎病疾病的重要手段，也是中藥治療CSA的作用靶點[9]。

活血定眩膠囊作為甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由宋敏教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗研制，已在臨床應用多年，其主要成分包括炙黃芪、菊花、天麻、桑寄生、鉤藤、丹參、葛根、雞血藤、甘草等，具有活血、定眩、通絡、補益等功效。在不同藥物劑量組的CSA大鼠研究中發(fā)現(xiàn)，該藥能有效改善CSA大鼠的血液流變學指標。其中君藥為黃芪，具有補氣、祛瘀散結之效,可有效抑制血小板聚集，改善血流變學、擴張血管等功效[10]。雞血藤、丹參和葛根為臣藥，具有活血、化瘀、通絡之功效，能有效改善微循環(huán)，擴張血管，抗動脈粥樣硬化，抗腦缺血，保護心肌，抗血栓，抗氧化等功能[11-12]。佐以鉤藤、天麻、菊花和桑寄生,定眩明目，熄風止痙，補肝益腎。其中天麻的主要有效成分天麻素可改善血管的擴張功能，提高腦組織5-羥色胺水平[13]。鉤藤中含有多種吲哚類生物堿，具有鎮(zhèn)靜、降壓、抗驚厥、鈣拮抗劑的作用，并可以抗血栓，調(diào)節(jié)多巴胺、去甲腎上腺素等神經(jīng)元功能[14]。甘草作為使藥，起調(diào)和諸藥之功能。諸藥合用，共奏活血化瘀、定眩止痛、通絡補益之功。

椎動脈缺血缺氧時，能量代謝障礙，導致大量Na+內(nèi)流，K+外流，細胞膜電位下降，產(chǎn)生去極化，引發(fā)大量Ca+內(nèi)流引起腦細胞損傷，血腦屏障破壞，產(chǎn)生大量氧自由基可使生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應，引起細胞損傷，誘導細胞凋亡。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物,對MDA的檢測可反映出機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和機體細胞受自由基攻擊的損傷程度[15]。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，當體內(nèi)自由基生成增多時，它與超氧陰離子反應生成過氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽酶轉(zhuǎn)變成水，從而使自由基清除，保護細胞免受損傷[16]。本實驗結果表明，活血定眩膠囊對缺氧損傷的bEnd.3細胞具有保護作用，能明顯抑制細胞上清液中MDA含量的增加，保護細胞膜的穩(wěn)定性，顯著增強細胞內(nèi)SOD的活性，改善能量代謝，有效抑制缺氧誘導的bEnd.3發(fā)生G1/S 期阻滯和早期凋亡，且使受損細胞形態(tài)得到明顯改善。

綜上所述，活血定眩膠囊對缺氧損傷的bEnd.3細胞具有顯著的保護作用，其機制可能與抑制細胞凋亡、減少氧自由基生成、提高細胞對氧自由基的清除能力有關。

[1] Sultan MJ, Hartshornc T, Naylor AR. Extracranial and transcranial ultrasound assessment in patients with suspected positional ‘vertebrobasilar ischaemia’ [J].Eur J Vasc Endovasc Surg, 2009, 38(1):10-13.

[2] 宋 敏, 柴居堂, 董萬濤, 等. 中醫(yī)藥防治椎動脈型頸椎病研究思路探討[J].遼寧中醫(yī)雜志, 2014, 41(12):2579-2581.

[3] 劉 濤, 宋 敏, 鞏彥龍, 等. 中藥對腦微血管內(nèi)皮細胞影響的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2016,27(6):1461-1463.

[4] 宋 敏, 溫孝明, 郭成龍, 等. 活血定眩丸對治療椎動脈型頸椎病血液流變學的影響[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2013, 24(9):2167-2168.

[5] 宋 敏, 李清林, 孫定平, 等. 3種椎動脈型頸椎病大鼠模型的建立與評價[J]. 西安交通大學學報：醫(yī)學版, 2016, 37(3):455-459.

[6] 戴柳玲, 萬海同, 周惠芬, 等. 谷紅注射液對缺糖缺氧致乳鼠腦微血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用[J]. 中國藥學雜志, 2014, 49(21):1897-1902.

[7] 蓋 聰, 孫紅梅, 李澎濤, 等. 通心絡對體外模擬腦缺血再灌注損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的保護作用[J]. 河南中醫(yī), 2014, 34(7):1253-1256.

[8] Le Bras B, BaralIobre MJ, Homman-Ludiye J, et al. VEGF-C is a trophic factor for neural progenitors in the vertebrate embryonic brain [J]. Nat Neurosci, 2006, 9(3):340-348.

[9] Bonn M, Schmitt A, Lesch KP, et al. Serotonergic innervation and serotonin receptor expression of NPY-producing neurons in the lateral and basolateral amygdaloid nuclei[J].Brain Struct Funct, 2013, 218(2):421-435.

[10]張 薔, 高文遠, 滿淑麗. 黃芪中有效成分藥理活性的研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2012, 37(21):3203-3207.

[11]符 影, 程 悅, 陳建萍, 等. 雞血藤化學成分及藥理作用研究進展[J]. 中草藥, 2011, 42(6):1229-1234.

[12]趙仁霞. 丹參的現(xiàn)代藥理研究及臨床應用[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2011, 12(9):291-292.

[13]黃 華, 丁 菁, 粟 鳳, 等. 葛根素預處理上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達減輕人臍靜脈內(nèi)皮細胞缺氧/復氧損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(5): 857-862.

[14]陳東麗, 陳旭東, 夏翠英. 天麻對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)細胞凋亡的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(3):148-150.

[15]戴國華, 孫敬昌, 齊冬梅, 等. 鉤藤生物堿對自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈成纖維細胞凋亡/增殖及FN、LN的影響[J]. 中國中西醫(yī)結合雜志, 2012, 32(9):1233-1237.

[16]徐明舉, 利 凱, 崔紅玉, 等. H3N2豬流感病毒誘導的小鼠急性肺損傷與SOD、NO、MDA和OH·變化的相關性[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(4):783-786,790.

[17]冬 蘭, 佟牧虹, 徐 寧. 川芎嗪聯(lián)合尼莫地平治療老年椎動脈型頸椎病35例[J]. 中醫(yī)雜志, 2009, 50(8):754.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Protective effect of Huoxue-Dingxuan capsule-medicated serum on mouse brain microvascular endothelial cell line bEnd.3 with hypoxic injury

LIU Tao1, SONG Min1, GONG Yan-long1, ZHOU Ling-tong1, DONG Wan-tao2, LIU Jian-hong1

(1GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China;2AffiliatedHospitalofGansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730020,China.E-mail:sm@gszy.edu.cn)

AIM: To investigate the protective effect of Huoxue-Dingxuan capsule-medicated serum on mouse brain microvascular endothelial cell line bEnd.3 with hypoxic injury. METHODS: The Wistar rats were randomly divided into control group and Huoxue-Dingxuan capsule group. The serum was collected at the 7th day after drug administration. The bEnd.3 cells were divided into normal group, hypoxia serum model group and Huoxue-Dingxuan capsule serum group. After administration of the medicated serum, bEnd.3 cell were treated with hypoxia for 6 h. The cell morphology was observed under microscope, the apoptosis rate and cell cycle were detected by flow cytometry, and the activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) were detected by ELISA. RESULTS: Compared with other groups, Huoxue-Dingxuan capsule-medicated serum significantly resisted the injury caused by hypoxia, obviously improved the morphology of bEnd.3 cells, significantly reduced the number of apoptotic cells induced by hypoxia, and effectively inhibited the occurrence of hypoxia-induced G1/S phase arrest in the bEnd.3 cells. At the same time, the medicated serum inhibited MDA production, and increased SOD activity. CONCLUSION: Huoxue-Dingxuan capsule attenuates hypoxia-induced bEnd.3 cell damage by enhancing the antioxidant capacity of cells and inhibiting cell apoptosis.

Huoxue-Dingxuan capsule; Mouse brain microvascular endothelial cells; Hypoxia; Apoptosis

1000- 4718(2017)03- 0552- 05

2016- 08- 11

2016- 11- 14

國家自然科學基金資助項目(No. 81360554)；甘肅省自然科學基金資助項目(No. 1506RJZA048)；甘肅省財政廳基本科研業(yè)務課題(No. BH2010-428)； 甘肅省中藥現(xiàn)代制造工程研究院項目(No. YWW-2015049)

△通訊作者 Tel: 0931-8765377; E-mail： sm@gszy.edu.cn

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.029