卞冬燕， 劉紅旭， 梁鈺敏， 王 垚， 吳紅婷， 李朋朋， 黃琳燕

(徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

硫化氫對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈血栓模型中凝血和纖溶活性的影響*

卞冬燕， 劉紅旭， 梁鈺敏， 王 垚， 吳紅婷， 李朋朋， 黃琳燕△

(徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

目的： 探討外源性硫化氫(H2S)對(duì)三氯化鐵(FeCl3)誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈血栓模型凝血和纖溶活性的影響。方法: 本實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、模型組、不同濃度(12.5、25和50 μmol/kg)的硫氫化鈉(NaHS，H2S供體)處理組和30 mg/kg氯吡格雷(clopidogrel，陽(yáng)性對(duì)照)。不同濃度NaHS腹腔注射及硫酸氫氯吡格雷灌胃給藥處理3 d后，采用10% FeCl3誘導(dǎo)小鼠頸動(dòng)脈血栓模型。取各組頸動(dòng)脈制成冰凍切片后，HE染色觀(guān)察血栓形成及血管病理變化；對(duì)形成的血栓重量進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算血栓形成抑制率；采用血凝儀檢測(cè)血漿凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)和纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)的變化；ELISA法檢測(cè)血漿中血栓烷素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)和纖溶酶原活化抑制劑(PAI)的含量。結(jié)果: 與模型組相比，NaHS劑量依賴(lài)性地抑制小鼠頸動(dòng)脈血栓的形成；NaHS處理可延長(zhǎng)血栓模型中PT和APTT，減少FIB含量，增加FDP含量；NaHS處理能夠降低頸動(dòng)脈血栓模型中TXB2及PAI含量，恢復(fù)6-keto-PGF1α含量，并且6-keto-PGF1α/TXB2與血栓重量呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論: 硫化氫通過(guò)抑制機(jī)體凝血功能并激活纖溶活性而抑制FeCl3誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈血栓形成。

硫化氫； 血栓； 凝血； 纖溶； 血栓烷素B2

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)作為一種氣體信號(hào)分子參與許多生物學(xué)過(guò)程。大量研究證實(shí)H2S在神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等中發(fā)揮著各種生理和病理作用[1-5]。在心血管系統(tǒng)中，H2S發(fā)揮舒張血管、促進(jìn)血管新生、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖并調(diào)控其表型轉(zhuǎn)化[6]、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞酸化[7]、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和退化反應(yīng)[8]等生物學(xué)效應(yīng)。在大鼠心肌缺血模型中，硫化氫通過(guò)抑制核因子κB活性減少腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6， IL-6)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)從而減輕心肌缺血對(duì)機(jī)體造成的損傷[9]。同時(shí)，硫化氫還能夠通過(guò)糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)/β-聯(lián)蛋白(β-catenin)信號(hào)途徑介導(dǎo)抗心肌細(xì)胞凋亡作用[10]。此外，硫化氫能夠抑制血小板功能，包括血小板黏附、分泌和聚集[11-14]。已有研究表明，硫化氫可以抑制三氯化鐵(ferric chloride，F(xiàn)eCl3)誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈血栓形成，但是其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)H2S對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈血栓模型小鼠凝血和纖溶活性指標(biāo)的變化，探討H2S抑制血栓形成的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

水合氯醛、硫氫化鈉和三氯化鐵購(gòu)自Sigma；硫酸氫氯吡格雷購(gòu)自Sanofi；多聚甲醛和疏水性載玻片購(gòu)自徐州微科曼得公司；蔗糖、ACD抗凝劑(120 mmol/L枸櫞酸納，110 mmol/L葡萄糖，80 mmol/L枸櫞酸，pH=7.4)和二甲苯購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性樹(shù)脂購(gòu)自上海標(biāo)本模型廠(chǎng)。冰凍切片機(jī)(Leica)；光學(xué)顯微鏡(Olympus)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；血凝儀(Sysmex CA1500)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組和模型建立 將購(gòu)買(mǎi)于徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的8～10周齡健康雄性小鼠，體重(22±2)g，共120只。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、NaHS(12.5 μmol/kg) I組、NaHS (25 μmol/kg)II組、NaHS (50 μmol/kg)III組和氯吡格雷(clopidogrel，30 mg/kg)組共6組，每組20只。連續(xù)3 d每日定時(shí)給予NaHS或生理鹽水(0.9% NaCl溶液，溶劑對(duì)照)腹腔注射，造模當(dāng)日，水合氯醛麻醉成功后取仰臥位，頸部正中線(xiàn)做直線(xiàn)切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，于動(dòng)脈下墊塑料薄膜保護(hù)周?chē)M織。取Whatman濾紙，裁成1.2 cm×0.8 cm大小，10% FeCl3浸透后覆蓋暴露的血管2.5 min后，移去濾紙，生理鹽水沖洗3遍。

2.2 血栓稱(chēng)重 FeCl3造模成功，暴露的血管經(jīng)生理鹽水沖洗后，于包含血栓的血管上下兩端結(jié)扎血管，剪斷后放入EP管中，稱(chēng)取血管和血栓總重量，而后用小鑷子輕輕將血管內(nèi)血栓取出，稱(chēng)取血管重量，兩者差值即為血栓濕重量。最后計(jì)算血栓形成抑制率=(A-A1)/A×100%，其中A代表模型組血栓質(zhì)量，A1代表其它各處理組血栓質(zhì)量。

2.3 蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 經(jīng)FeCl3處理造模成功后的小鼠，打開(kāi)胸腔暴露心臟，沿左心室上行進(jìn)入主動(dòng)脈，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，持續(xù)用壓強(qiáng)約100 mmHg的PBS沖洗小鼠全身血管，觀(guān)察小鼠肝臟發(fā)白時(shí)，接著用冷的4%的多聚甲醛進(jìn)行灌注15 min左右。灌注結(jié)束后剪取頸動(dòng)脈血管制成冰凍切片，切片厚度約6 μm，按照步驟[15]進(jìn)行HE染色，封片后在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察。采用Image-Pro Plus圖像處理軟件測(cè)定頸動(dòng)脈血栓形成面積。

2.4 凝血指標(biāo)和纖溶活性指標(biāo)測(cè)定 小鼠心臟穿刺取血，迅速加入枸櫞酸鈉抗凝管(9∶1)，4 ℃ 3 000 r/min 離心15 min，得到上層血漿，利用血凝儀檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)和纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrinogen degradation product，F(xiàn)DP)變化，1 h內(nèi)完成檢測(cè)。

2.5 ELISA實(shí)驗(yàn) 小鼠心臟取血離心得到上層血漿，采用酶聯(lián)免疫試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)手工測(cè)定小鼠血漿中血栓烷素B2(thromboxane B2, TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-keto-prostaglandin1α, 6-keto-PGF1α)和纖溶酶原活化抑制劑(plasminogen activator inhibitor, PAI)的含量，操作時(shí)每個(gè)樣本測(cè)定2個(gè)孔，結(jié)果取平均值。分光光度計(jì)測(cè)定相應(yīng)的濁度后，根據(jù)各自的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各待測(cè)樣本的濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，所有計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，并采用SNK-q法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 H2S抑制FeCl3誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈血栓形成

通過(guò)稱(chēng)量各組血栓的濕重，我們發(fā)現(xiàn)正常組沒(méi)有血栓，模型組頸動(dòng)脈血栓重量明顯增加，NaHS各劑量組血栓重量依次減少，硫酸氫氯吡格雷與25 μmol/kg NaHS具有相同的作用。HE染色結(jié)果顯示，正常組血管內(nèi)膜完整，模型組有明顯血栓形成，血管內(nèi)膜破壞嚴(yán)重。與模型組相比，NaHS各劑量組血栓依次減少。計(jì)算各組血栓面積結(jié)果顯示，硫氫化鈉處理后，血栓面積明顯較模型組減少，提示H2S抑制FeCl3誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈血栓形成，見(jiàn)圖1、表1。

Figure 1.NaHS inhibited FeCl3-induced carotid artery thrombosis in a dose-dependent manner. Representative HE staining images of carotid artery thrombus in different groups were showed (×200).

表1 不同濃度硫氫化鈉對(duì) FeCl3誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈血栓形成的影響

*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

2 H2S對(duì) FeCl3誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈血栓模型中凝血指標(biāo)和纖溶活性指標(biāo)的影響

通過(guò)檢測(cè)各組凝血指標(biāo)和纖溶活性指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，F(xiàn)eCl3誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈血栓模型組PT和APTT均明顯縮短，而NaHS處理后可分別延長(zhǎng)PT和APTT。與假手術(shù)組相比，模型組FIB和FDP含量明顯增加，而NaHS處理后可減少FIB，但FDP含量增加更明顯，見(jiàn)表2。

3 H2S改變FeCl3誘導(dǎo)的血栓模型中6-keto-PGF1α/TXB2比值以及恢復(fù)PAI水平含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組TXB2和PAI水平顯著增加，而6-keto-PGF1α的含量明顯減少；與模型組相比，NaHS劑量依賴(lài)性地降低TXB2和 PAI水平，增加6-keto-PGF1α的含量，見(jiàn)表 3。

表2 不同濃度硫氫化鈉對(duì) FeCl3誘導(dǎo)小鼠頸動(dòng)脈血栓模型中凝血指標(biāo)和纖溶活性指標(biāo)的影響

*P<0.05,**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

通過(guò)計(jì)算6-keto-PGF1α/TXB2的比值發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，NaHS劑量依賴(lài)性地增加6-keto-PGF1α/TXB2，與血栓重量呈負(fù)相關(guān)(y=-0.0304x+0.2089，R2=0.8505)，見(jiàn)圖2。

討 論

表3 不同濃度硫氫化鈉對(duì)FeCl3誘導(dǎo)頸動(dòng)脈血栓模型中6-keto-PGF1α、TXB2及PAI的影響

*P<0.05,**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

Figure 2.The correlation analysis between thrombus weight and the ratio of 6-keto-PGF1α/TXB2. y=-0.0304x+0.2089, R2=0.8505.

FeCl3誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈血栓是應(yīng)用廣泛的血栓模型[16]，通過(guò)氧化損傷血管內(nèi)皮引起血小板黏附和聚表3 不同濃度硫氫化鈉對(duì)FeCl3誘導(dǎo)頸動(dòng)脈血栓模型中6-keto-PGF1α、TXB2及PAI的影響集，導(dǎo)致血栓形成[17]。該模型對(duì)抗凝和抗血小板藥物敏感，已經(jīng)在多種實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物的動(dòng)、靜脈上得到應(yīng)用[18-19]。本研究中，我們通過(guò)稱(chēng)量頸動(dòng)脈血栓濕重，以及計(jì)算各組血栓抑制率，發(fā)現(xiàn)硫化氫具有抗血栓作用，并且高劑量NaHS作用更明顯，這與先前的報(bào)道有差異[20]，可能與大小鼠模型對(duì)硫化氫的反應(yīng)性不一致有關(guān)。FeCl3誘導(dǎo)的頸動(dòng)脈血栓模型組PT和APTT縮短，提示機(jī)體處于高凝狀態(tài)，而硫化氫處理可延長(zhǎng)凝血時(shí)間。在凝血系統(tǒng)被激活后，F(xiàn)IB被凝血酶水解后形成纖維蛋白單體，后者交聯(lián)成穩(wěn)定的纖維蛋白多聚體；同時(shí)纖溶系統(tǒng)被激活，纖維蛋白在纖溶酶作用下降解成各種FDP，其中最小的片段為D-二聚體[21]。由于模型組中FIB含量增加，由于機(jī)體處于高凝狀態(tài)，已激活纖溶酶產(chǎn)生FDP，因此模型組FDP增加，而硫化氫處理后進(jìn)一步激活機(jī)體纖溶系統(tǒng)，由FIB降解產(chǎn)生的FDP含量進(jìn)一步增加。提示硫化氫可通過(guò)抑制凝血和激活纖溶系統(tǒng)抑制三氯化鐵誘導(dǎo)的血栓形成。PGI2和TXA2均是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，能夠動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)血小板活化和血管張力。PGI2是一種有效的內(nèi)源性血管擴(kuò)張劑和血小板聚集抑制劑，能有效防止血小板黏附和聚集，并且通過(guò)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物活性來(lái)抑制血栓形成。TXA2是血管重建和血小板聚集的有效誘導(dǎo)劑，并在血栓形成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[22]。在生理?xiàng)l件下，TXA2和PGI2維持血管張力和血液流變學(xué)的體內(nèi)平衡。如果TXA2的合成增加，PGI2合成減少，TXA2/PGI2失去平衡，則會(huì)引起血管收縮，血小板黏附和聚集，進(jìn)而血栓生成，并進(jìn)一步導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，冠狀動(dòng)脈痙攣，冠狀動(dòng)脈血栓和心肌梗死[23- 24]。TXA2和PGI2是不穩(wěn)定的，所以我們通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)的穩(wěn)定代謝物TXB2和6-keto-PGF1α來(lái)反映TXA2和PGI2的水平。PAI-1是纖溶系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)劑。血漿過(guò)多的PAI-1使PA活性降低，進(jìn)而降低纖溶活性，促進(jìn)血栓形成。因此，我們通過(guò)檢測(cè)這些指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，模型組血漿中TXB2和PAI-1含量大大增加，6-keto-PGF1α顯著減少，血栓形成增多，并且6-keto-PGF1α/TXB2的比值與血栓重量呈負(fù)相關(guān)。而NaHS處理后明顯降低模型組中TXB2和PAI-1含量，增加6-keto-PGF1α含量，恢復(fù)6-keto-PGF1α/TXB2的比值。本實(shí)驗(yàn)為研究硫化氫預(yù)防和治療血栓性疾病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of hydrogen sulfide on coagulation and fibrinolysis in FeCl3-induced mouse carotid artery thrombosis model

BIAN Dong-yan, LIU Hong-xu, LIANG Yu-min, WANG Yao, WU Hong-ting, LI Peng-peng, HUANG Lin-yan

(MedicalTechnologyCollege,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004,China.E-mail:huangly1985@xzhmu.edu.cn)

AIM: To explore the influence of exogenous hydrogen sulfide (H2S) on coagulation and fibrinolysis in ferric chloride (FeCl3)-induced mouse carotid artery thrombosis. METHODS: The mice were divided into sham control group, model group, different concentrations (12.5, 25 and 50 μmol/kg) of sodium hydrosulfide (NaHS, H2S donor) groups and 30 mg/kg clopidogrel (positive control) group. Intraperitoneal injection of NaHS at different concentrations and oral administration of clopidogrel bisulfate were performed for 3 d prior to FeCl3-induced carotid artery thrombosis. The frozen sections of the carotid artery were collected to perform HE staining, and the thrombus pattern and the changes of vascular pathology were observed. The thrombus was weighed to calculate thrombosis inhibitory rate. Prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), fibrinogen (FIB) and fibrinogen degradation product (FDP) in the mice were also measured by a coagulometer. The plasma levels of thromboxane B2(TXB2), 6-keto-prostaglandin F1α(6-keto-PGF1α) and plasminogen activator inhibitor (PAI) were detected by ELISA. RESULTS: Compared with model group, NaHS dose-dependently inhibited the formation of carotid artery thrombus. NaHS treatment reduced the contents of TXB2and PAI, and recovered 6-keto-PGF1αcontent in thrombosis model group. In NaHS treatment groups, 6-keto-PGF1α/TXB2and thrombus weight was negatively correlated. NaHS treatment prolonged PT and APTT, reduced the content of FIB, but increased the level of FDP in thrombosis model group.CONCLUSION: Hydrogen sulfide prevents FeCl3-induced carotid artery thrombosis by inhibiting coagulation and activating fibrinolysis.

Hydrogen sulfide; Thrombus; Coagulation; Fibrinolysis; Thromboxane B2

1000- 4718(2017)03- 0523- 05

2016- 06- 27

2017- 01- 12

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No. 81402918)；江蘇省科技廳青年項(xiàng)目(No.BK20140228)； 2014年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(No.201410313072X)

△通訊作者 Tel: 0516-83262995; E-mail: huangly1985@xzhmu.edu.cn

R363; R543

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.023