梁 辰， 陳本宏， 滕素玲， 王 燕， 王福文△

(1濟南大學(xué), 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250200； 2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點實驗室，山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南 250062； 3平陰縣中醫(yī)醫(yī)院，山東 濟南 250400)

肢體缺血后處理對大鼠慢性腦缺血后腦內(nèi)LINGO-1的表達及神經(jīng)功能的變化*

梁 辰1, 2， 陳本宏3， 滕素玲1, 2， 王 燕1, 2， 王福文1, 2△

(1濟南大學(xué), 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250200；2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點實驗室，山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南 250062；3平陰縣中醫(yī)醫(yī)院，山東 濟南 250400)

目的： 觀察大鼠肢體缺血后處理后腦內(nèi)LINGO-1表達的變化，研究肢體缺血后處理改善慢性腦缺血后神經(jīng)損傷的分子機制。方法: 采用50%三氯化鐵處理雙側(cè)頸總動脈的方法建立慢性腦缺血模型，隨機將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和肢體缺血后處理組。大鼠肢體缺血后處理3周后采用三等分Y型電迷宮方法觀察各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，RT-qPCR檢測LINGO-1的mRNA，Western blot法測定LINGO-1的蛋白水平。結(jié)果: 與模型組相比，肢體缺血后處理組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著增加(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠LINGO-1的mRNA及蛋白水平有少量陽性表達。肢體缺血后處理組大鼠LINGO-1的mRNA及蛋白水平均顯著下降(P<0.05)。結(jié)論: 慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)LINGO-1水平明顯上調(diào)，肢體缺血后處理可明顯降低LINGO-1的表達水平，并提高學(xué)習(xí)記憶能力，這可能是肢體缺血后處理改善慢性腦缺血神經(jīng)功能的分子機制之一。

LINGO-1； 慢性腦缺血； 肢體缺血后處理

慢性腦缺血是指各種原因?qū)е碌拈L期腦血流灌注不足(低于400～600 mL·kg-1·min-1)，在血管性癡呆(vascular dementia, VD)、Binswanger病、老年性癡呆(Alzheimer’s disease, AD)等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程起著重要的作用。腦組織長期處于慢性缺血狀態(tài)可呈現(xiàn)大腦皮質(zhì)萎縮、神經(jīng)元變性、腦白質(zhì)疏松、膠質(zhì)細胞增生等一系列病理改變， 導(dǎo)致認知功能下降，進而發(fā)展為VD、Binswanger病、AD等多種腦血管疾病。對于慢性腦缺血，目前治療方法較多，如使用腦保護劑、針灸療法等，但對于肢體缺血后處理(limb ischemic postconditioning, LIP)改善慢性腦缺血癥狀的分子機制研究尚不完善。肢體缺血后處理由Vinten-Johansen等人于2002年在英國首先提出[1]，是指對模型動物肢體進行反復(fù)多次的缺血再灌注，主要用于改善心肌缺血再灌注損傷的研究[2-3]，在治療急性腦缺血療效方面也有相關(guān)研究[4]，但對改善慢性腦缺血癥狀的分子機制研究較少。

含富亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的Nogo受體相互作用蛋白1(leucine-rich repeat and Ig domain-containing, Nogo receptor-interacting protein-1, LINGO-1)是一種神經(jīng)再生抑制性因子，含富亮氨酸重復(fù)片段結(jié)構(gòu)域，在抑制軸突再生、少突膠質(zhì)細胞分化及髓鞘形成、神經(jīng)元存活等信號通路中有著重要作用。有研究表明LINGO-1參與慢性腦缺血損傷后神經(jīng)細胞再生過程[5]，但LIP對LINGO-1的影響尚未見報道。本研究觀察LIP后慢性腦缺血大鼠腦組織LINGO-1的表達變化，初步探討LIP對慢性腦缺血損傷恢復(fù)可能的分子機制。

材 料 和 方 法

1 動物及分組

SPF級Wistar大鼠30只，體重 250～300 g，雌雄各半。動物飼養(yǎng)于屏蔽環(huán)境，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，晝夜明暗交替時間10 h/14 h。SPF大小鼠繁殖飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，自由飲水。將動物隨機分為3組，即假手術(shù)(sham)組、模型(model)組和LIP組。每組10只。

2 試劑及儀器

三氯化鐵(FeCl3)由上?；瘜W(xué)試劑廠生產(chǎn)，分析純，用雙蒸水配成至所需濃度；兔抗大鼠LINGO-1抗體(Noves)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG(H+L)，Western blot、IP細胞裂解液，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物科技研究所)；ECL化學(xué)發(fā)光底物(Thermo)；小鼠/兔IgG免疫組化試劑盒(博士德生物工程有限公司)。Y迷宮(張家港市生物儀器廠)；J-25型高速冷凍離心機(Beckman Coulter)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；ImageQuant LAS 4000型化學(xué)發(fā)光成像儀(GE Healthcare)。

3 方法

3.1 慢性腦缺血模型制備 采用三氯化鐵誘導(dǎo)大鼠頸總動脈血栓制備慢性腦缺血模型。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)麻醉后仰臥位固定，從中線縱行切開頸部皮膚約2 cm，剪開淺筋膜，手術(shù)分離并暴露雙側(cè)頸總動脈和迷走神經(jīng)。滴上少許利多卡因, 以減少對迷走神經(jīng)的刺激。仔細分離頸總動脈約1.5～2.0 cm。在雙側(cè)頸總動脈下放置自制弧形塑料墊(5 cm×1 cm)，以保護血管周圍組織。將吸有50% FeCl3溶液2 μL的2 mm×4 mm小片濾紙貼敷在此段動脈上30 min后取下，用生理鹽水沖洗局部組織。傷口撒適量青霉素抗感染，然后逐層縫合，回籠飼養(yǎng)。

3.2 肢體缺血后處理 將大鼠固定在大鼠固定套管中，將自制的無創(chuàng)型血壓測定儀套管套住大鼠雙后肢肢根部，充氣加壓至200 mmHg，使脈搏消失即為阻斷股動脈標志，持續(xù)10 min后放氣，再灌注5 min，共3個循環(huán)。每天早晚各處理1次，連續(xù)處理3周。

3.3 Y迷宮訓(xùn)練 實驗在黑暗、安靜環(huán)境下進行。迷宮有3個臂，每個臂的頂端都裝有燈泡，箱底裝有平行相間的銅棒。兩黑暗臂箱底通電，安全區(qū)方向給予燈光信號。將大鼠放入3臂均未通電的起步區(qū)中適應(yīng)暗環(huán)境3 min，3 min后隨機變換安全區(qū)位置，安全區(qū)燈亮2 s后，如果大鼠停留在黑暗處或另一黑暗臂底，即遭電擊(85～90 V)，大鼠受點擊后從起步區(qū)直接逃避到安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)。30 s后熄燈，結(jié)束1次訓(xùn)練，休息30 s后重復(fù)。LIP結(jié)束前3 d，每日每只大鼠訓(xùn)練20次，連續(xù)訓(xùn)練3 d后，記錄每只大鼠20次電擊逃到安全區(qū)位置的正確反應(yīng)次數(shù)，評價其學(xué)習(xí)能力。

3.4 動物取材 大鼠手術(shù)結(jié)束3周后，分別腹腔注射20%烏拉坦(4 mL/kg)麻醉，放血后迅速取出大腦，在大腦同一位置取腦組織200～250 mg，裝入EP管中，置于-80 ℃冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.5 Western blot實驗檢測腦組織中LINGO-1的表達 取-80 ℃冰柜保存的腦組織100 mg，液氮中研磨后加入含1 mmol/L PMSF的裂解液1 mL研磨均勻，倒入玻璃勻漿器中充分裂解，設(shè)置高速低溫離心機的條件為14 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，取上清液，分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。BCA試劑盒測定勻漿上清液的蛋白濃度，按常規(guī)方法進行SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育LINGO-1抗體(1∶1 000)等，最終用化學(xué)發(fā)光成像儀進行顯影后，應(yīng)用ImageJ圖像處理系統(tǒng)處理蛋白條帶，進行半定量分析。

3.6 RT-qPCR 檢測腦組織中LINGO-1的mRNA表達 取-80 ℃冰柜保存的腦組織100 mg，在液氮中研磨成粉末狀，加入1 mL TRIzol對組織進行裂解，充分勻漿，高速低溫離心機離心5 min，取上清液，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置10 min。相同條件離心10 min后將水層轉(zhuǎn)移到一個新的EP管中。加入500 μL異丙醇，顛倒數(shù)次混勻后，室溫靜置10 min，相同條件離心10 min，保留沉淀在管底，用75%乙醇進行洗滌，離心后吸除上清，適度風(fēng)干。加入30 μL DEPC水溶解RNA沉淀，上下振蕩。逆轉(zhuǎn)錄采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 第 1 鏈，反應(yīng)體積10 μL，37 ℃15 min，85 ℃ 5 s。以β-actin作為內(nèi)參照。LINGO-1的上游引物序列為 5’-GGTGTTGTAGGAGGAGACGGA-3’，下游引物序列為5’-CAATCGCATGTCTCTCTTGCC-3’，PCR產(chǎn)物為75 bp，內(nèi)參照采用β-actin，上游引物序列為 5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’，下游引物序列為5’-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3’，PCR產(chǎn)物為104 bp。以每個樣品目的基因的表達閾值與內(nèi)參照基因表達閾值的差(ΔCt)為其相對表達量，各處理組目的基因的ΔCt與對照組目的基因的ΔCt差值計為ΔΔCt，以2-ΔΔCt表示為目的基因在藥物處理組的表達量與在對照組表達量的比值，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。PCR產(chǎn)物同時進行瓊脂糖凝膠電泳進一步驗證結(jié)果。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Y迷宮實驗

實驗結(jié)果表明，模型組大鼠正確反應(yīng)次數(shù)較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)，而LIP組大鼠較模型組正確反應(yīng)次數(shù)顯著增加(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The effect of limb ischemic postconditioning (LIP) on correctly reflect times by Y maze in chronic cerebral ischemic rats. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs sham group; #P<0.05 vs model group.

2 LINGO-1 mRNA表達的變化

RT-qPCR結(jié)果顯示假手術(shù)組LINGO-1的mRNA少量表達，模型組大鼠腦組織中LINGO-1的mRNA表達量顯著升高(P<0.01)，而LIP組較模型組LINGO-1 mRNA表達量顯著降低(P<0.01)。瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果與之相一致，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of LINGO-1 in chronic cerebral ischemic brain tissues in different groups. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs sham group; ##P<0.01 vs model group.

3 LINGO-1蛋白表達的變化

假手術(shù)組可見LINGO-1少量表達。模型組大鼠腦組織中的LINGO-1水平明顯升高(P<0.01)，而LIP組較模型組LINGO-1水平顯著降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The protein expression of LINGO-1 in chronic cerebral ischemic brain tissues in different groups. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs sham group; ##P<0.01 vs model group.

討 論

LINGO-1是Nogo受體復(fù)合物[NgR/LINGO-1/p75(或TROY)]中的一種跨膜蛋白，含富亮氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)，抑制少突膠質(zhì)細胞分化和髓鞘形成，降低神經(jīng)元存活率，減少軸突再生。在正常神經(jīng)系統(tǒng)中，LINGO-1的表達被抑制，在神經(jīng)病理模型中表達上調(diào)[6]。LINGO-1的神經(jīng)抑制作用具體表現(xiàn)為：(1) 抑制軸突生長：Nogo等髓鞘相關(guān)抑制因子通過LINGO-1激活小G蛋白RhoA，使其抑制神經(jīng)突起的生長。Chen等[7]應(yīng)用RNA干擾技術(shù)研究表明，LINGO-1參與調(diào)節(jié)髓鞘抑制因子，上調(diào)RhoA活性，從而調(diào)節(jié)抑制信號抑制中樞神經(jīng)再生。由此可見，LINGO-1能通過調(diào)節(jié)RhoA信號通路介導(dǎo)跨膜信號傳導(dǎo)，進而抑制軸突生長。(2)抑制少突膠質(zhì)細胞髓鞘分化：LINGO-1負性調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細胞再生和髓鞘形成。Zhang等[8]研究表明，當LINGO-1的功能受到抑制時，RhoA作用降低，少突膠質(zhì)細胞的分化功能和髓鞘形成增強，說明LINGO-1可通過RhoA信號通路調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細胞分化和髓鞘形成。此外，LINGO-1可與神經(jīng)生長因子受體TrkA形成受體復(fù)合物，激活TrkA可上調(diào)LINGO-1進而抑制髓鞘形成。(3)參與神經(jīng)元的凋亡過程：抑制神經(jīng)元存活主要通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)，PI3K/Akt通路可阻斷多種誘導(dǎo)細胞凋亡的細胞因子，進而抑制細胞凋亡，促進細胞存活。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是連接LINGO-1和PI3K/Akt通路的橋梁。Zhou等[9]研究發(fā)現(xiàn)LINGO-1能通過負性調(diào)控EGFR進而抑制PI3K/Akt信號通路活性，提高浦肯野細胞存活率。

LIP的概念于2002提出，2009年Ren等[10]首次報道了LIP能有效減少腦梗死面積。但LIP腦保護的作用機制至今尚不完善，其中LINGO-1與LIP之間的關(guān)系研究甚少，據(jù)此本實驗對兩者之間的聯(lián)系進行了初步探索。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIP可明顯改善慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力并顯著降低其腦組織內(nèi)LINGO-1蛋白表達水平，因此推測抑制LINGO-1的表達是LIP改善慢性腦缺血損傷的機制之一。那么LIP對LINGO-1的調(diào)節(jié)，是否與上述機制有關(guān)呢？通過文獻檢索我們發(fā)現(xiàn)，一氧化氮(nitric oxide，NO)能擴張血管，維持血流量，對心腦血管有很重要的保護作用[11]。而LIP可以通過抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)解偶機制促進NO合成，進而改善腦缺血損傷[12]。Zhou等[13]研究表明，PI3K/Akt信號通路能促進NO產(chǎn)生，參與神經(jīng)細胞生長、增殖、分化和凋亡過程，且LIP可以通過調(diào)節(jié)Akt信號通路防止缺氧所致的新生兒腦缺血損傷。因此我們推測LIP減輕慢性腦缺血損傷的通路之一可能是通過下調(diào)LINGO-1的表達，從而抑制NOS解偶，進而激活PI3K/Akt信號通路促進NO生成產(chǎn)生腦保護作用。另外LIP與LINGO-1的關(guān)系是否與抑制軸突生長和少突膠質(zhì)細胞的分化有關(guān)，以及上述推測是否準確還有待下一步實驗的研究。

本實驗采用三氯化鐵誘導(dǎo)頸總動脈形成血栓的方法建立慢性腦缺血模型，目的在于減少大鼠創(chuàng)傷，提高存活率，建立更合理的慢性腦缺血模型。LIP明顯改善慢性腦缺血癥狀，也有可能與血栓溶解有關(guān)，在下一步實驗中有待驗證。

綜上所述，慢性腦缺血大鼠腦內(nèi)LINGO-1水平明顯上調(diào)，LIP可下調(diào)LINGO-1的表達量，減少神經(jīng)細胞凋亡，促進神經(jīng)功能恢復(fù)，提高學(xué)習(xí)能力，改善慢性腦缺血癥狀。因此，負性調(diào)節(jié)LINGO-1蛋白表達可能是LIP改善慢性腦缺血損傷的分子機制之一。

[1] Baxter GF, Yellon DM. Current trends and controversies in ischemia-reperfusion research：meeting report of the Hatter Institute 3rd International Workshop on Cardioprotection[J]. Basic Res Cardiol, 2003, 98(2):133-136.

[2] Jang YH, Kim JH, Ban C, et al. Stromal cell derived factor-1 (SDF-1) targeting reperfusion reduces myocardial infarction in isolated rat hearts[J]. Cardiovasc Ther, 2012, 30(5):264-272.

[3] Yang XM, Liu Y, Cui L, et al. Platelet P2Y12 blockers confer direct postconditioning-like protection in reperfused rabbit hearts[J]. Cardiovasc Pharmacol Ther, 2013, 18(3):251-262.

[4] 李樹清， 李 凡， 何 亮， 等. 缺血后適應(yīng)促進樹鼩血栓性腦缺血時緊密連接occludin/ZO-1蛋白表達及抑制腦水腫的機制[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(3):477-484.

[5] Bai Y, Markham K, Chen F, et al. Theinvivobrain interactome of the amyloid precursor protein[J]. Mol Cell Proteomics, 2008, 7(1):15-34.

[6] Fernandez-Enright F, Andrews JL. LINGO-1: a novel target in therapy for Alzheimer’s disease? [J]. Neural Regen Res, 2016, 11(1):88-89.

[7] Chen N, Cen JS, Wang J, et al. Neural stem cells promotes neuronal differentiation and functional recovery in rats subjected to spinal cord injury[J]. Crit Care Med, 2016, 44(3):e146-e157.

[8] Zhang ZH, Li JJ, Wang QJ, et al. WNK1 is involved in Nogo66 inhibition of OPC differentiation[J]. Mol Cell Neurosci, 2015, 65(1):135-142.

[9] Zhou ZD, Sathiyamoorthy S, Tan EK. LINGO-1 and neurodegeneration: pathophysiologic clues for essential tremor[J]. Tremor Other Hyperkinet Mov (N Y), 2012, 2:tre-02-51-249-1.

[10]Ren C, Yan Z, Wei D, et al. Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats[J]. Brain Res, 2009, 1288:88-94.

[11]王詩才， 陳太軍， 黃美松， 等. 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子保護H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷血管內(nèi)皮細胞[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(8):1384-1394.

[12]Chen G, Yang J, Lu G, et al. Limb remote ischemic post- conditioning reduces brain reperfusion injury by reversing eNOS uncoupling[J]. Indian J Exp Biol， 2014, 52(6):597-605.

[13]Zhou Y, Fathali N, Lekic T, et al. Remote limb ischemic postconditioning protects against neonatal hypoxic-ischemic brain injury in rat pups by the opioid receptor/Akt pathway [J]. Stroke, 2011, 42(2):439-444.

(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of limb ischemic postconditioning on expression of LINGO-1 in brain and neural function after focal cerebral infarction in rats

LIANG Chen1, 2, CHEN Ben-hong3, TENG Su-ling1, 2, WANG Yan1, 2, WANG Fu-wen1, 2

(1SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250200,China;2InstituteofMateriaMedica,ShandongAcademyofMedicalSciences,KeyLaboratoryforBiotech-DrugsofMinistryofHealth,KeyLaboratoryforRare&UncommonDiseasesofShandongProvince,Jinan250062,China;3PingyinCountyHospitalofTraditionalChineseMedicine,Jinan250400,China.E-mail:wangfuwww@tom.com)

AIM: To observe the expression of LINGO-1 in the rat brain after ischemic stroke, and to explore the molecular mechanism of improving the neural damage after chronic cerebral ischemia by limb ischemic preconditioning (LIP). METHODS: The chronic cerebral ischemia model was established by the method of processing bilateral common carotid arteries with 50% FeCl3. The rats were randomly divided into sham operation group, model group and LIP group. The study and memory abilities of the animals were observed by the test of Y-type labyrinth after treatment for 2 weeks, and the mRNA and protein expression of LINGO-1 was detected by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: Compared with model group, the study and memory abilities were significantly increased (P<0.05). Only a small amount of positive expression of LINGO-1 at mRNA and protein levels in sham operation group was observed. The expression of LINGO-1 in model group was increased significantly. Compared with model group, the expression of LINGO-1 at mRNA and protein levels was significantly decreased in LIP group (P<0.05). CONCLUSION: LIP improves the study and memory abilities and reduces the expression level of LINGO-1. LINGO-1 may be one of the molecular targets for LIP improving the neural function of chronic cerebral ischemia.

LINGO-1; Chronic cerebral ischemia; Limb ischemic postconditioning

1000- 4718(2017)03- 0548- 05

2016- 11- 16

2016- 12- 21

山東省重大新藥創(chuàng)制中心建設(shè)項目(No. 2009ZX09301-013)

△通訊作者 Tel: 0531-82919972； E-mail: wangfuwww@tom.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.028